布魯菌外膜蛋白抗體檢測elisa試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯菌病是由布魯菌屬細(xì)菌引起的重大人獸共患疾病，嚴(yán)重影響著家畜的生產(chǎn)力 和動物性產(chǎn)品的生物安全，給畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)世界統(tǒng)計資料表明，每年 因布魯菌病造成的經(jīng)濟(jì)損失近30億美元。我國每年牛、羊、豬感染有百萬頭之多，所造成的 經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)十幾億元。我國就新疆、甘肅兩地概算，每年因布魯菌病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失 約1億元。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，2011年12月，僅1個月我國河北、內(nèi)蒙古、遼寧、黑龍江、浙江、甘 肅、新疆等地區(qū)牛和綿羊共發(fā)生布魯菌病468次，發(fā)病數(shù)約1萬頭，捕殺近8000頭。同時， 野生動物布魯菌病的存在，也是對畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康的一種潛在威脅。
[0003] 布魯菌病的診斷技術(shù)從總體上分為細(xì)菌學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測和PCR檢測等幾類方 法。細(xì)菌學(xué)檢測是診斷布魯菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，由于布魯菌培養(yǎng)條件苛刻，操作人員存在被感 染風(fēng)險，沒有廣泛應(yīng)用。血清學(xué)檢測是發(fā)現(xiàn)部分疫情和了解疫情的重要手段。0IE指定布魯 菌檢測試驗有緩沖布氏桿菌抗原試驗、ELISA和補(bǔ)體結(jié)合試驗，而我國布魯菌病診斷國標(biāo)是 2002年制訂的動物布魯菌病診斷技術(shù)（GB/T18646-2002)，檢測方法有虎紅平板凝集試驗、 乳牛全乳環(huán)狀試驗、試管凝集試驗和補(bǔ)體結(jié)合試驗。虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗試 驗因假陽性、假陰性結(jié)果較多而易造成誤判；乳牛全乳環(huán)狀試驗結(jié)果易受動物機(jī)體內(nèi)環(huán)境 影響而造成誤判；補(bǔ)體結(jié)合試驗因操作繁瑣、費(fèi)時而在實際應(yīng)用中較少。
[0004] ELISA近年來以操作簡易、貯存方便、高敏感性和高特異性等優(yōu)勢逐漸成為布魯菌 病檢測的重要手段，而我國尚未推廣快速、敏感、高通量的ELISA檢測方法用于實際生產(chǎn)及 口岸檢測。此外，完整的細(xì)菌作為ELISA包被抗原是最經(jīng)典的，但因為布魯菌培養(yǎng)條件苛 亥IJ、不易培養(yǎng)，而且存在生物安全隱患。國內(nèi)外在選用ELISA作為檢測布魯菌病的常用方法 時，大多是從牛種布魯菌S1119-3或S99株中提取光滑型脂多糖（sLPS)作為抗原，這種抗 原易與其它菌發(fā)生交叉反應(yīng)，減低試驗的準(zhǔn)確性。因而利用生物工程技術(shù)表達(dá)單一性抗原 表位作為檢測抗原，既安全有效，又解決了脂多糖作為抗原易與其它病原菌發(fā)生交叉反應(yīng) 的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種快速、敏感、簡便的布 魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒， 其特征在于，其利用大腸桿菌表達(dá)的布魯菌外膜蛋白0MP28作為抗原包被酶標(biāo)板，用布魯 菌標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清分別作為陽性對照血清和陰性對照血清，以HRP標(biāo)記的羊抗牛 IgG作為酶標(biāo)抗體。
[0007] 本研究在篩選ELISA抗原時，選用了 0MP19和0MP28兩種蛋白作為候選對象，但試 驗中發(fā)現(xiàn)經(jīng)克隆表達(dá)的0MP19蛋白不穩(wěn)定，易降解，不易純化；與之相比，0MP28則相對穩(wěn) 定、多次試驗均易獲得高純度的可溶性蛋白。優(yōu)化好條件，以0MP14、0MP15、0MP39作為包 被抗原檢測臨床陰性血清和陽性血清時，〇D450nm值幾乎沒有區(qū)別，特異性差；與之相比， 0MP28作為包被抗原檢測臨床陰性血清和陽性血清時，P/N在3. 0以上，特異性強(qiáng)。因此， 0MP28是具有較好反應(yīng)原性的穩(wěn)定蛋白質(zhì)，可作為ELISA試劑盒的包被抗原。
[0008] 進(jìn)一步地，所述大腸桿菌表達(dá)的布魯菌外膜蛋白0MP28的制備方法如下：
[0009] (1)設(shè)計引物
[0010] 參照NCBI中提供的牛型布魯菌0MP28的基因序列（CP003176)，用Primer5. 0軟件 設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物為:5，-CGCGGATCCATGAAC ACTCGTGCTAGC-3'；下游引物為:5'-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'。為了便于后續(xù)的 克隆，在上、下游引物的5'端分別添加BamHI和Xhol酶切位點(下劃線標(biāo)出）。
[0011] (2 ) 0MP28基因的擴(kuò)增
[0012] 以牛型布魯菌A544株基因組DNA為模板，擴(kuò)增0MP28基因，用膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物。
[0013] (3)克隆載體和表達(dá)載體的構(gòu)建
[0014] 用BamHI酶和Xhol酶將回收的0MP28PCR產(chǎn)物定向克隆于原核表達(dá)載體pET-28a (+ )，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，篩選得到陽性重組質(zhì)粒。
[0015] (4)重組蛋白的制備
[0016] 將重組質(zhì)粒pET-28a ( + ) -0MP28轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表 達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE分析，用Ni-NTA瓊脂糖親合層析純化，純化的蛋白即為0MP28 蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。
[0017] 其中，所述步驟（2)0MP28基因的擴(kuò)增中，PCR擴(kuò)增的工作體系為25iiL:DNA 模板 1.〇1^，1〇11111〇1/1上游引物？1.〇111，1〇11111〇1/1下游引物1?1.〇1^，2\]\&18七6『 Mixl2. L，滅菌去離子水 9. L;反應(yīng)參數(shù)：95°C 5min ;95°C 30s，57°C 30s，72°C lmin，35 個循環(huán)，72°C延伸7min，冷卻至4°C。
[0018] 其中，所述步驟（3)中篩選得到陽性重組質(zhì)粒的具體過程為，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌 DH5 a細(xì)胞涂布到含50 ii g/mL卡那霉素的LB平板上，于37°C培養(yǎng)過夜，次日，從LB平板上 隨機(jī)挑取5個菌落，接種于含50 y g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)16h，提取質(zhì) 粒，進(jìn)行PCR鑒定，將PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒再進(jìn)行酶切鑒定，將酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒測 序，得到陽性重組質(zhì)粒。
[0019] 進(jìn)一步地，所述酶標(biāo)板的制備方法如下：
[0020] (1)抗原包被：無菌條件下，將純化的重組蛋白0MP28于pH9. 6的碳酸緩沖液中按 1 y g/ml稀釋，100 ii L/孔加到96孔酶標(biāo)板中，濕盒內(nèi)37°C包被lh;
[0021] (2)洗滌：以pH值為7. 4的PBST作洗滌液，300iiL/孔，每次室溫作用2min，洗滌 4次。最后一次甩掉洗滌液后，在吸濕紙上用力排干；
[0022] (3)封閉：用含5%脫脂乳的PBST按160ul/孔，加入至酶標(biāo)板中，37°C封閉30min， 洗滌4次。最后一次甩掉洗滌液后，在吸濕紙上用力排干，后自然晾干；
[0023] (4)包裝：將封閉好的酶標(biāo)板放于鋁箔袋中，加入包裝為lg的干燥劑，用真空包裝 機(jī)將酶標(biāo)板包裝好，貼標(biāo)簽。
[0024] 進(jìn)一步地，所述陽性對照血清和陰性對照血清的制備方法如下：
[0025] (1)陽性對照血清的制備：在無菌條件下，將從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購買的布魯菌 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清（lml干粉包裝)用2ml高壓好的蒸餾水稀釋，加入0. 01%硫柳汞以防腐，然后 分裝，貼好標(biāo)簽。
[0026] (2)陰性對照血清的制備：在無菌條件下，將從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購買的布魯菌 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清（lml干粉包裝)用2ml高壓好的蒸餾水稀釋，加入0. 01%硫柳汞以防腐，然后 分裝，貼好標(biāo)簽。
[0027] 進(jìn)一步地，所述酶標(biāo)抗體為HRP標(biāo)記的羊抗牛IgG，其來自美國ROCKLAND公司購買 的 anti-bovine HRP IgG F(C)(GOAT)。
[0028] 進(jìn)一步地，前述試劑盒還配以洗滌液、底物溶液A、底物溶液B和終止液。
[0029] 其中：所述洗滌液的制備方法如下：無菌條件下，用0.22 濾器過濾后的 Tween-20加到經(jīng)高壓滅菌的20 XPBS中，配成1%的20 XPBST貯存液。
[0030] 所述底物溶液A、底物溶液B來自北京康為世紀(jì)科技有限公司購買的TMB底物顯色 試劑盒(可溶型)，其中的TMB液規(guī)定為底物溶液A、TMB-顯色液規(guī)定為底物溶液B。
[0031] 所述終止液為2mol/L硫酸。
[0032] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0033] 本發(fā)明所述布魯菌外膜蛋白抗體檢測ELISA試劑盒，利用生物工程技術(shù)表達(dá)單一 性抗原表位作為檢測抗原，經(jīng)過敏感性、特異性、重復(fù)性、保存性試驗證明所研制的試劑盒 安全穩(wěn)定可靠。此外，在檢測時間方面，研制的試劑盒檢測96個樣本僅需1. 5~2h，而用 IDEXX試劑盒檢測96個樣本則需2-3h，這說明用本試劑盒做檢測更加快捷高效；在檢測成 本方面，研制的試劑盒對于96個樣本的檢測成本不足100元，而檢測同樣的樣本，IDEXX試 劑盒需1500元左右。這說明，所研究的試劑盒更加快捷經(jīng)濟(jì)，適于在生產(chǎn)中推廣使用，可滿 足我國對牛群中布魯菌的抗體進(jìn)行檢測監(jiān)測的防疫要求。
【附圖說明】
[0034] 圖1為0MP28基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中泳道M為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1為PCR產(chǎn)物。
[0035] 圖2為重組0MP28蛋白的SDS-PAGE電泳分析，其中泳道1為純化的重組蛋白，2為 誘導(dǎo)前的重組表達(dá)菌，3為誘導(dǎo)后的重組表達(dá)菌，4為重組表達(dá)菌裂解液沉淀，5為重組表達(dá) 菌裂解液上清，M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實施方式】
[0036] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0037] 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段； 所用試劑均為市售。
[0038] 實施例1大腸桿菌表達(dá)的布魯菌外膜蛋白0MP28制備
[0039] 1?材料
[0040] 1. 1菌種與血清
[0041] 牛型布魯菌A544株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供、原核表達(dá)載體pET-28a( + )、大腸 埃希菌BL21 (DE3)由首都醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)實驗室保存。
[0042] 1. 2 試劑
[0043] DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶購自NEB公司；S印hadex G25、 Superdex75預(yù)裝柱購自GE公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自大連寶生物工程 有限公司。
[0044] 2.引物的設(shè)計
[0045] 參照NCBI中提供的牛型布魯菌0MP28的基因序列（CP003176)，用Primer5. 0軟件 設(shè)計引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。上游引物為:5，-CGCGGATCCATGAAC ACTCGTGCTAGC-3' ；下游引物為:5'-CCGCTCGAGTTACTTGATTTCAAAAACG-3'。為了便于后續(xù)的 克隆，在上、下游引物的5'端分別添加BamHI和Xhol酶切位點(下劃線標(biāo)出）。
[0046] 3. 0MP28基因的擴(kuò)增
[0047] 以牛型布魯菌A544株基因組DNA為模板，擴(kuò)增0MP28基因，用膠回收試劑盒回收 PCR產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增的25iiL工作體系為：DNA模板1.〇1^，1〇11111〇1/1上游引物？1.〇111， 10μmol/L 下游引物 R1. 0 ii L，2XMaster Mixl2. 5 ii L，滅菌去離