蛋白、dna分子、含有該dna的轉(zhuǎn)化宿主及該轉(zhuǎn)化宿主用于生產(chǎn)l-纈氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及蛋白、編碼該蛋白的DNA分子、含有該DNA分子的轉(zhuǎn)化宿主機該轉(zhuǎn)化宿主用于生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。通過將輔助因子為NADH的亮氨酸脫氫酶的編碼基因leuDH（核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示）轉(zhuǎn)化導(dǎo)入棒桿菌中，獲得胞內(nèi)氧化還原平衡改變的基因工程菌，培養(yǎng)該菌株能夠用于生產(chǎn)L-纈氨酸，極顯著提高了L-纈氨酸的產(chǎn)量。
【專利說明】蛋白、DNA分子、含有該DNA的轉(zhuǎn)化宿主及該轉(zhuǎn)化宿主用于生產(chǎn)L-纈氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及蛋白、編碼該蛋白的DNA分子、含有該DNA分子的轉(zhuǎn)化宿主機該轉(zhuǎn)化宿主用于生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-纈氨酸(L-valine)，化學(xué)名稱為L- a -氨基異戊酸，分子式為C5H11NO2,相對分子質(zhì)量為117.1 5。呈白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，無臭，味苦，在水中溶解度:25V為88.5g/L，50°C為96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等電點為5.96，熔點315°C。L-纈氨酸(L-Val)是人體八種必需氨基酸之一，又是三種支鏈氨基酸(包括纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)之一，因其特殊的結(jié)構(gòu)和功能，在人類生命代謝中具有特別重要的地位?？梢詮V泛應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)、食品工業(yè)和飼料工業(yè)等。醫(yī)藥工業(yè)中，可作氨基酸輸液、綜合氨基酸制劑的主要成分，可治療肝功能衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂。如缺乏可引起神經(jīng)障礙、停止發(fā)育、體重下降、貧血等。食品工業(yè)中，可用作食品添加劑、營養(yǎng)增補液及風(fēng)味劑等。米制糕餅中添加纈氨酸(lg/kg)，產(chǎn)品有芝麻香，用于面包亦能改善風(fēng)味。L-纈氨酸也可用作氨基酸能量飲料與運動員飲料，有形成肌肉、強化肝功能、減輕肌肉疲勞等作用。飼料工業(yè)中，對動物的乳腺組織分泌乳汁有重要的促進作用。將其用于雛雞飼料中，可提高雛雞對雞新城疫病毒的免疫能力。而且L-纈氨酸是動物飼料中的一種限制性氨基酸，所以L-纈氨酸可作為飼料添加劑改善動物日糧中氨基酸含量的不足。
[0003]L-纈氨酸的生產(chǎn)方法有三種:提取法、化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法由于原料來源受限制、生產(chǎn)成本高、污染環(huán)境，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，是目前生產(chǎn)L-纈氨酸最主要的方法。通過菌株的選育，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制和阻遏，達到過量積累L-纈氨酸的目的，是微生物發(fā)酵法工業(yè)應(yīng)用最為廣泛的手段。
[0004]棒桿菌是用于生產(chǎn)L-氨基酸的代表性微生物，特別是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒桿菌(Corynebacterium pekinense)和黃色短桿菌(Breviabacterium flavum)。然而,現(xiàn)有的菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-繳氨酸的產(chǎn)量較低,無法滿足市場需求。
[0005]為了改善微生物的L-纈氨酸生產(chǎn)能力，可以通過傳統(tǒng)誘變和代謝工程等方法對生產(chǎn)菌株進行不斷地改造。傳統(tǒng)誘變育種，是指通過對特定出發(fā)菌株進行物理、化學(xué)或二者合并地誘變處理，再選育出營養(yǎng)缺陷型和/或氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株，以解除代謝調(diào)節(jié)中的反饋抑制或阻遏作用，從而達到過量積累某種氨基酸的目的。代謝工程育種，就是在對代謝網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)分析的基礎(chǔ)上采用基因工程技術(shù)改造細(xì)胞代謝系統(tǒng)以提高產(chǎn)物得率或改進細(xì)胞性能。主要包括如下手段:對原有代謝途徑的改造、新代謝途徑的構(gòu)建、組學(xué)規(guī)模的代謝關(guān)鍵途徑或靶點的識別。通過理性的代謝工程構(gòu)建氨基酸生產(chǎn)菌株，正逐漸成為氨基酸育種的主要策略。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]有鑒于此，本發(fā)明提供一種蛋白、編碼該蛋白的DNA分子、含有該DNA分子的轉(zhuǎn)化宿主機該轉(zhuǎn)化宿主用于生產(chǎn)L-纈氨酸的方法。通過將輔助因子為NADH的亮氨酸脫氫酶的編碼基因IeuDH轉(zhuǎn)化導(dǎo)入棒桿菌中，獲得胞內(nèi)氧化還原平衡改變的基因工程菌，培養(yǎng)該菌株能夠用于生產(chǎn)L-纈氨酸，極顯著提高了 L-纈氨酸的產(chǎn)量。
[0007]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案:
[0008]本發(fā)明提供了一種具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脫氫酶或其功能等價物。
[0009]纈氨酸的合成代謝途徑，是從二分子的丙酮酸開始，經(jīng)過乙酰乳酸、二羥基異戊酸和酮基異戊酸等三個中間產(chǎn)物，最終形成纈氨酸。而這些中間代謝產(chǎn)物分別通過乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸還原異構(gòu)酶、二羥酸脫水酶和轉(zhuǎn)氨酶的催化活性而產(chǎn)生的，如圖1所示。
[0010]乙酰羥酸合成酶(AHAS)是L-纈氨酸合成途徑上的第一個共用酶也是關(guān)鍵酶，催化2分子丙酮酸脫羧合成I分子乙酰乳酸，即纈氨酸的前體。AHAS受三種支鏈氨基酸中的任何一種反饋抑制。
[0011]二羥酸還原異構(gòu)酶(AHAIR)是L-纈氨酸合成途徑上的第二個酶，為一四聚體酶，由大小為53kDa的同種亞基組成，催化乙酰乳酸生成2，3-二羥基異戊酸。反應(yīng)包括烷基的異構(gòu)和還原；發(fā)生該反應(yīng)還需要Mg2+(激活劑)和NADPH (氫供體)。
[0012]二羥酸脫水酶(DHAD)是L-纈氨酸合成途徑上的第三個酶，是由兩個亞基組成的二聚體酶，可催化2，3- 二羥基異戊酸生成2-酮基異戊酸。
[0013]轉(zhuǎn)氨酶(TA) B是纈氨酸`合成過程中的最后一個酶。轉(zhuǎn)氨酶B、轉(zhuǎn)氨酶C和芳香轉(zhuǎn)氨酶(基因分別為ilvE、avtA和tyrB)在支鏈氨基酸的合成中都具有催化活性，但主要由轉(zhuǎn)氨酶B催化三種支鏈氨基酸合成的最后一步反應(yīng)。
[0014]亮氛酸脫氧酶(LeucineDehydrogenase, LDH, ECl.4.1.9)是一種 NAD+依賴型的氧化還原酶，它可逆地催化L-亮氨酸和一些支鏈L-氨基酸反應(yīng)生成對應(yīng)的酮酸及其類似物，如下所示:
[0015]
【權(quán)利要求】
1.一種具有如SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的亮氨酸脫氫酶或其功能等價物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的功能等價物通過在SEQID N0.1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一個或多個氨基酸殘基獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的亮氨酸脫氫酶或其功能等價物用于催化2-酮基異戊酸生成纈氨酸的應(yīng)用。
4.編碼如權(quán)利要求1或2所述的亮氨酸脫氫酶或其功能等價物的DNA分子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
6.編碼如權(quán)利要求1或2所述的亮氨酸脫氫酶或其功能等價物的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列與SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列的同源性大于95%以上。
7.具有如權(quán)利要求5或6任一項所述的DNA分子的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體，其特征在于，其為pMX119。
9.具有如權(quán)利要求5或6任一項所述的DNA分子的轉(zhuǎn)化宿主。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化宿主，其特征在于，如權(quán)利要求5或6任一項所述的DNA分子通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化宿主，其特征在于，如權(quán)利要求5或6任一項所述的DNA分子表達增強。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的轉(zhuǎn)化宿主，其特征在于，所述表達增強的方式為如權(quán)利要求5或6任一項所述的DNA分子 至于強啟動子的控制之下或增加如權(quán)利要求5或6任一項所述的DNA分子的拷貝數(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化宿主，其特征在于，其為棒桿菌或短桿菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化宿主，其特征在于，其保藏編號為CGMCCN0.7041。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14任一項所述的轉(zhuǎn)化宿主用于發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的用途。
16.—種如權(quán)利要求9至14任一項所述的棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-纈氨酸的方法，其特征在于，取所述轉(zhuǎn)化宿主在種子培養(yǎng)基中擴繁后，置于發(fā)酵培養(yǎng)基中于28°C~37°C培養(yǎng)50~120h,即得。
【文檔編號】C12P13/08GK103642766SQ201310275401
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】朱亞然, 胡炎華, 宮衛(wèi)波 申請人:廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司