專利名稱：一種枯草芽胞桿菌及1萬億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及飼料添加劑和水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，更具體涉及一種枯草芽胞桿菌原粉 (10，000億活芽胞/克)的制備方法，將在飼料工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面上得到廣泛應(yīng)用。隨著 芽胞桿菌功能還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用范圍也在不斷擴大，該產(chǎn)品將應(yīng)用到如污染水體凈 化、水果保鮮、垃圾除臭等新領(lǐng)域，在國內(nèi)國際市場上有很強的競爭力。
背景技術(shù)：
自20世紀50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動物生長促進劑發(fā)揮了重大作 用。然而，由于抗生素負面效果越來越嚴重，世界衛(wèi)生組織已禁止在飼料中使用任何抗菌藥 物，一些發(fā)達國家對獸用抗生素的使用也有明確規(guī)定。飼料和養(yǎng)殖業(yè)以添加抗生素預(yù)防和 促進動物生長的飼養(yǎng)方式已經(jīng)受到了很大沖擊，抗生素替代品的使用和推廣成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā) 展的必然方向。芽胞桿菌益生菌具備抗生素預(yù)防疾病和促進生長的特點，成為抗生素的替 代品，將取得理想的應(yīng)用效果，在養(yǎng)殖業(yè)中具有很大的開發(fā)潛力。益生菌又稱微生態(tài)制劑，是指有益微生物經(jīng)過特殊馴化和加工制成的活菌制劑， 益生菌可以改善動物腸道中微生物的菌群平衡，防治某些細菌性疾病的發(fā)生，能提高動物 的飼料利用率、提高機體免疫力，促進生長和改善生產(chǎn)性能，得到安全無藥物殘留的動物產(chǎn) 品?，F(xiàn)已開發(fā)成商品制劑的益生菌有芽胞桿菌類、酵母、乳酸菌、雙歧桿菌、鏈球菌、曲霉 等，枯草芽胞桿菌(Bacillus subtillus簡稱Bs)是最重要的品種。目前，國內(nèi)芽胞桿菌益生菌制品的生成工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵法和液體深 層發(fā)酵法。固體發(fā)酵法是把益生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行發(fā)酵培養(yǎng)，其優(yōu)點是相對管理 比較粗放，具有生產(chǎn)工藝簡單，投資少的特點，但同時具易受雜菌污染，菌體含量不易控制、 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點。目前我國大多數(shù)芽胞桿菌益生菌產(chǎn)品都是采用該生產(chǎn)方法。液體 深層發(fā)酵法是采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，將益生菌菌種接種到反應(yīng)器中進行通風培養(yǎng)，對整個發(fā) 酵過程都可以進行精細的過程控制，具有便于無菌操作，容易控制菌體含量，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定 的特點，但技術(shù)水平要求較高，相對固體發(fā)酵投資要高，但更適合工業(yè)化生產(chǎn)。其一般工藝 流程為菌種接種培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)一排放培養(yǎng)液一收集菌體一加入適 量載體和保護劑一干燥一粉碎一過篩一稀釋混和一成品包裝一質(zhì)檢一益生菌產(chǎn)品。國內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生產(chǎn)的枯草桿菌制劑(有效活菌數(shù)一般在200億 cfu/g左右)和部分廠家采用液體發(fā)酵生產(chǎn)的制劑(芽胞數(shù)一般為1000-2000億cfu/ g)。該工藝安全、高效優(yōu)質(zhì)，方法易行，由該工藝生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數(shù)達 1，000億活芽胞每克；水份彡7%,pH 6. 0-8. 0,細度(150 μ m) ^95%,噬菌體含量彡40個 /10,000活芽胞。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種枯草芽胞桿菌篩選和鑒定方法，該方法篩選的菌種具有來源安全和發(fā)酵水平高等優(yōu)點。該菌株在飼料工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面得到廣泛應(yīng)用， 并且在污染水體凈化、水果保鮮、垃圾除臭等新領(lǐng)域也將會有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種枯草芽胞桿菌原粉的制備方法，具有安 全、高效優(yōu)質(zhì)、方法易行，由該工藝生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數(shù)達10，000億活 芽胞每克。安全的枯草芽孢桿菌益生菌的篩選；培養(yǎng)基優(yōu)化及液體高密度補料發(fā)酵技術(shù)； 高效的芽胞提取回收工藝；產(chǎn)品活芽胞數(shù)高。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施1. BsKN-48 菌種的篩選取一定量(約IOg)從全國各地不同土壤和水體中收集的樣品，在已滅菌的研缽 內(nèi)研磨均勻。稱取Ig研磨好的土樣裝入無菌試管中，加入IOmL無菌水充分震蕩30分鐘， 制成1 10的土壤稀釋液。從上述土壤稀釋液中取出lmL，加入9mL無菌水充分震蕩做成 1 IO2的稀釋液，依此類推，制成1 IO3U IO4U IO5U IO6的土壤稀釋液，用移液槍 吸取稀釋液均勻涂布在分離培養(yǎng)基A1 (豆餅粉30g，淀粉8g，酵母粉10g，磷酸氫二鉀0. 3g， 硫酸鎂 0. 3g，硫酸錳 0. 05g，碳酸鈣 0. lg，瓊脂 15g，水 IOOOmL, pH 7. 5，121°C 滅菌 30min) 上，于29-31°C溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微 鏡檢，選出有Bs形態(tài)特征的菌株轉(zhuǎn)接到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基B1 (大米粉30g，麥麩15g，硫 酸鎂 0. 03g，硫酸亞鐵 0. 002g，硫酸鋅 0. 02g，碳酸鈣 lg,7jC 1000mL，pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 30min)中，500mL搖瓶裝量為25mL，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，30°C搖瓶培養(yǎng)后，選出生長迅速的 菌種KN-48轉(zhuǎn)接到試管斜面生長后于4°C保種。2. BsKN-48 菌種的鑒定對BsKN-48菌株進行了形態(tài)和生理生化特征研究，測定BsKN-48菌株的16SrDNA 共1244個有效堿基，根據(jù)枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結(jié)合 分類資料(伯杰氏細菌手冊)鑒定KN-48菌株為枯草芽胞桿菌。BsKN-48菌株于2009年 12月28日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC N0.M209317。3.高產(chǎn)Bs KN-48的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，首先從眾多碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳 糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉或玉米粉)、氮源(水解植物復合氨基酸、棉 籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬 氨酸或硫酸銨)、無機離子{氯化鈷(CoCl2)、碳酸鈣(CaCO3)、硫酸鎂(MgSO4)、磷酸二氫 鉀(KH2PO4)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵(FeSO4)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅(CuSO4)或硫酸鋅 (ZnSO4)I中選擇重要的部分因子篩選設(shè)計，利用合理的試驗設(shè)計，考慮多個因素之間的協(xié) 同作用，用于尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(Path of Steepest Ascent)和 用于優(yōu)化響應(yīng)面最大值的中心組合設(shè)計(Central Composite Design)來擬合因子與響應(yīng) 值(芽孢數(shù))之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析，得到B-48發(fā)酵培養(yǎng)基(大米粉 28. 84g/L，玉米淀粉18. 21g/L，酵母粉27. 92g/L，玉米漿30. 05g/L,豆粕3. 88g/L，磷酸二氫 鉀(KH2PO4) 0. 5g/L，硫酸鎂(MgSO4)O. 06g/L，氯化鈉(NaCl) 3g/L，碳酸鈣(CaCO3) lg/L)。4.液體深層高密度補料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵動力學研 究，以發(fā)酵前期(0-4小時)、對數(shù)期(4-15小時)和穩(wěn)定期(15-24小時)的溶氧(》3ppm)、
5PH(6. 5-7. 5)和放罐芽胞數(shù)(》140億)為指標，確定各時期遲緩期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期 最佳營養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關(guān)系。在分批發(fā)酵研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化高密度補 料發(fā)酵工藝。5.特殊、高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4. 2，升溫35 °C，80目過濾，加 3. 18%。(質(zhì)量比)硫酸鋅(ZnSO4),攪拌3分鐘，再加2. 27%。(質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1分 鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫200°C，出口風溫85-87°C，原 粉活芽胞數(shù)達10，000億/克。發(fā)明的目的在于對篩選的生長迅速、生物量高、產(chǎn)芽胞同步率高的枯草芽胞桿 菌菌株，采用培養(yǎng)基的優(yōu)化和高密度發(fā)酵工藝、高效芽胞回收工藝，生產(chǎn)出活芽胞數(shù)達到 10，000億/克的枯草芽胞桿菌安全原粉(原藥)，遠高于國內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生 產(chǎn)的枯草桿菌制劑(有效活菌數(shù)一般在200億cfu/g左右)和部分廠家采用液體發(fā)酵產(chǎn)品 (芽胞數(shù)一般為1000-2000億cfu/g)。一種10，000億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是1. BsKN-48 菌種的篩選從全國各地不同土壤和水體中收集富含芽孢桿菌芽胞的土樣和水樣，將樣品用無 菌水稀釋到100-200個芽胞/ml水，涂布在A1分離培養(yǎng)基上(豆餅粉30g，淀粉8g，酵母粉 10g，磷酸氫二鉀0. 3g，硫酸鎂(MgSO4)O. 3g，硫酸錳0. 05g，碳酸鈣(CaCO3)O. lg，瓊脂15g， 水IOOOmL, pH 7. 5，121°C滅菌30min)，于29_31°C溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3_5d后，挑出芽胞同 步率高的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態(tài)特征的菌株轉(zhuǎn)接到B1液體搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)基中(大米粉30g，麥麩15g，硫酸鎂0. 03g,硫酸亞鐵0. 002g,硫酸鋅0. 02g,碳酸 鈣lg，水lOOOmL，pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌30min)，29_31°C搖瓶培養(yǎng)后，選出生長迅速(發(fā) 酵周期36小時以內(nèi))、生物量高(600nm可見光光密度0D_彡70)的菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面 生長后于4°C保種。2. BsKN-48 菌種的確認對BsKN-48菌株進行了形態(tài)和生理生化特征研究，測定BsKN-48菌株的16SrDNA 共1244個有效堿基，根據(jù)枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結(jié)合 分類資料(伯杰氏細菌手冊)鑒定KN-48菌株為枯草芽胞桿菌。BsKN-48菌株于2009年 12月28日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址中國.武漢.武漢大學，保藏號為 CCTCC NO. M209317，分類命名枯草芽胞桿菌 KN-48 (Bacillus subtilis KN-48) 3.高產(chǎn)BsKN-48的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子篩 選設(shè)計，利用合理的試驗設(shè)計，考慮碳源、氮源、無機離子等多個因素之間的協(xié)同作用，用于 尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(Path of Ste印estascent)，和用于優(yōu)化響應(yīng) 面最大值的中心組合設(shè)計(Central Composite Design) 0來擬合因素與響應(yīng)值之間的函 數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析，設(shè)計優(yōu)化B-48發(fā)酵培養(yǎng)基(大米粉28. 84g/L，玉米淀粉 18. 21g/L，酵母粉 27. 92g/L，玉米漿 30. 05g/L,豆粕 3. 88g/L，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0. 5g/L， 硫酸鎂(MgSO4) 0.06g/L，氯化鈉(NaCl) 3g/L，碳酸鈣(CaCO3) Ig)。4.液體深層高密度補料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量
采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵動力學研 究，以發(fā)酵前期(0-4小時)、對數(shù)期(4-15小時)和穩(wěn)定期(15-24小時)的溶氧(》3ppm)、 pH(6. 5-7. 5)和放罐芽胞數(shù)(》140億)為指標，確定各時期遲緩期、對數(shù)生長期和穩(wěn)定期 最佳營養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關(guān)系。在分批發(fā)酵研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化高密度補 料發(fā)酵工藝。5.特殊、高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，？朋.2，升溫351，80目過濾，加 3. 18%。(質(zhì)量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2. 27%。(質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置 15分鐘，離心菌漿進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫200°C，出口風溫85-87°C，枯草芽胞桿 菌原粉活芽胞數(shù)達10，000億/克。6.活芽胞數(shù)檢測稱取0. 99g l.Olg試樣到中性瓶中，加入IOOmL,濃度為0. 85% (質(zhì)量比)水的 生理鹽水，猛烈搖動混合均勻。再把混合瓶放在磁力攪拌器(CJJ-4上海君竺儀器制造有限 公司)平臺上混合30min后，放入超聲波水浴器(KQ-600B昆山市超聲儀器有限公司)中超 聲15min，然后再放在勻質(zhì)器(Bagmixer 400W/P/VW)中混合lOmin。將處理好的試樣溶液 依次稀釋到10_8放入70°C水浴鍋中水浴30min，然后稀釋到10_9取0. ImL到每個營養(yǎng)瓊脂 培養(yǎng)基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16hr 20hr。 計平板上的菌落數(shù)，計算試樣中枯草芽胞桿菌的芽胞數(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果(1)處理方法能有效分散粉劑中粘結(jié)集聚的芽胞、殺滅熱穩(wěn)定性和生物活性不穩(wěn) 定的無效芽胞，準確的檢測出產(chǎn)品中有效活芽胞的數(shù)量；(2)重復性好；(3)檢測過程不需要特殊昂貴的儀器；(4)成本低；(5)可以同時檢測7-8個樣品；(6)操作簡單便于推廣。該工藝安全、高效優(yōu)質(zhì)，方法易行，由該工藝生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞 數(shù)達10，000億活芽胞每克，水份彡7%, pH:6. 0-9.0，細度(150 μ m)彡95%，噬菌體含量 <40個/10，000活芽胞。
具體實施例方式一種10，000億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是1. BsKN-48 菌種的篩選從全國各地不同土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺上，稱取樣品1. Og裝入小 三角瓶中，加入9mL無菌水，充分振蕩后靜置，取上清液做濃度梯度稀釋(1 X ΙΟ"4,1 X 10_5，， 1 X 10_6，1 X 10_7，1 X 10_8)。用移液槍吸取稀釋液IOOul均勻涂布在A1分離培養(yǎng)基(豆餅 粉30g，淀粉8g，酵母粉10g，磷酸氫二鉀0. 3g，硫酸鎂0. 3g，硫酸錳0. 05g,碳酸鈣0. Ig,瓊 脂15g，水IOOOmL, pH7. 5，121°C滅菌30min)上，于30°C溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3_5d后，挑出 芽胞同步率高(芽胞形成率>90%)的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態(tài)
7特征的菌株轉(zhuǎn)接到B1液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(大米粉30g，麥麩15g，硫酸鎂0. 03g,硫酸亞 鐵 0. 002g，硫酸鋅 0. 02g，碳酸鈣 lg, 7jC IOOOmL, pH7. 0-7. 5，121°C滅菌 30min)中，500mL 搖 瓶裝量為25mL，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，30°C搖瓶培養(yǎng)后，選出生長迅速(發(fā)酵同期36小時以 內(nèi))、生物量高(600nm可見光光密度OD6tltl彡70)的菌種KN-48轉(zhuǎn)接到試管斜面生長后于 4°C保種。2. BsKN-48 菌種的確認對KN-48菌株進行了形態(tài)和生理生化特征研究，根據(jù)該菌株的16SrDNA序列進行 分子分類。該菌株的16SrDNA共測定1244個有效堿基，系統(tǒng)發(fā)育資料及分類資料(伯杰氏 細菌手冊)鑒定該菌株為枯草芽胞桿菌。該菌株于2009年12月28日在中國典型培養(yǎng)物 保藏中心保藏，保藏號為CCTCC N0.M209317。(1)菌種鑒定理化實驗結(jié)果見下表
權(quán)利要求
一種枯草芽胞桿菌，其特征在于枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)KN 48，CCTCCNOM209317。
2.權(quán)利要求1所述的一種枯草芽胞桿菌原粉的制備方法，其步驟是A.BsKN-48菌種的篩選取土壤和水體中的樣品，在已滅菌的研缽內(nèi)研磨均勻，稱取研 磨好的土樣裝入無菌試管中，加入IOmL無菌水充分震蕩，制成1 10的土壤稀釋液，從上 述溶液中取出lmL，加入無菌水震蕩做成1 IO2的稀釋液，依此類推，制成1 103、1 104、 1 IO5U IO6的土壤稀釋液，用移液槍吸取稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基上，于29-31°C溫控 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d后，挑出芽胞同步的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出有Bs形態(tài)特 征的菌株轉(zhuǎn)接到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝量為25mL，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，30°C 搖瓶培養(yǎng)后，選出生長的菌種轉(zhuǎn)接到試管斜面生長后于4°C保種；(1)A1分離培養(yǎng)基豆餅粉30g，淀粉8g，酵母粉10g，磷酸氫二鉀0.3g，硫酸鎂0. 3g，硫 酸錳 0. 05g，碳酸鈣 0. lg，瓊脂 15g，水 IOOOmL, pH 7. 5，121°C滅菌 30min ；(2)B1液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基大米粉30g，麥麩15g，硫酸鎂0. 03g，硫酸亞鐵0. 002g，硫 酸鋅 0. 02g，碳酸鈣 lg, 7jC IOOOmL, pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 30min ；B.對BsKN-48菌株進行了形態(tài)和生理生化特征研究，測定BsKN-48菌株的16SrDNA共 1244個有效堿基，根據(jù)枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結(jié)合系 統(tǒng)發(fā)育資料及分類資料鑒定KN-48菌株為枯草芽胞桿菌；C.BsKN-48的培養(yǎng)基采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，以芽胞數(shù)為篩選指標，利用 單因子實驗首先從碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子篩選設(shè)計，采用多元一次和二次回 歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，通過對回歸方程來設(shè)計培養(yǎng)基 B-48 ；(1)、碳源因子通過單因子實驗，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大 米粉、土豆淀粉或玉米粉中篩選出大米粉和玉米淀粉為BsKN-48碳源需求因子；(2)、氮源因子通過單因子實驗，從水解植物復合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白 胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸或硫酸銨中篩選出酵 母粉、豆粕和玉米漿為BsKN-48氮源需求因子；(3)、微量元素因子通過單因子實驗，從氯化鈷、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、 硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸銅或硫酸鋅中篩選出磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈉為BsKN-48微量 元素需求因子；(4)、利用PB實驗設(shè)計篩選影響B(tài)sKN-48芽胞形成的重要因子，確定大米粉、玉米淀粉 和酵母粉為重要因子，利用SAS軟件設(shè)計中心組合實驗，得到BsKN-48發(fā)酵配方B-48 大米 粉28. 84g/L，玉米淀粉18. 21g/L，酵母粉27. 92g/L，玉米漿30. 05g/L,豆粕3. 88g/L，磷酸二 氫鉀0. 5g/L，硫酸鎂0. 06g/L，氯化鈉3g/L，碳酸鈣lg/L，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達100億/ml ；D.高密度液體補料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗的 培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵，以發(fā)酵前期，對數(shù)期，穩(wěn)定期0D、溶氧、pH值、芽胞數(shù)為指標，確定營 養(yǎng)平衡，及與芽胞數(shù)關(guān)系，在分批發(fā)酵配方上進行碳源和氮源濃度加倍，采用糖濃度IOg/ ml，通過補加葡萄糖，使發(fā)酵過程還原糖濃度為0. 5-1.0%質(zhì)量比，發(fā)酵過程共用葡萄糖 7%質(zhì)量比；發(fā)酵過程補加氨水，使pH控制在6. 8-7. 2范圍，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達150億/ml ；E.芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，？朋.2，升溫351，80目過濾，加·3. 18%。質(zhì)量比硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2. 27%。質(zhì)量比黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘， 離心菌漿進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫20(TC，出口風溫85-87°C，原粉活芽胞數(shù)達 10，000 億 / 克；F.活芽胞數(shù)檢測稱取0. 99g 1. Olg試樣到中性瓶中，加入100mL，0. 85%質(zhì)量比的生理鹽水，搖動混合 均勻，再把混合瓶放在磁力攪拌器平臺上混合30min后，放入超聲波水浴器中超聲15min， 然后再放在勻質(zhì)器中混合lOmin，將處理的試樣溶液依次稀釋到10_8放入70°C水浴鍋中水 浴30min，然后稀釋到10_9取0. ImL到每個營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻 涂布后，放在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16hr 20hr。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽胞桿菌及1萬億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉的制備方法，枯草芽胞桿菌，CCTCCNO.M209317。其步驟A.Bs菌種的篩選，從土壤和水體中收集樣品，加入無菌水，靜置；B.Bs菌種的確認，該菌株的16SrDNA共測定1244個有效堿基；C.Bs培養(yǎng)基的篩選，采用Box-Behken設(shè)計的響應(yīng)面實驗，以芽胞數(shù)為篩選指標，從眾多碳源、氮源和微量元素因子中確定最優(yōu)因子；D.提高發(fā)酵生物量，以響應(yīng)面法篩選的培養(yǎng)基進行分批發(fā)酵；E.芽胞提取與回收；F.活芽胞數(shù)檢測，準確的檢測出產(chǎn)品中有效活芽胞的數(shù)量；重復性好，成本低，同時檢測7-8個樣品，操作簡單。生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌原藥清潔安全、回收率高、產(chǎn)品芽孢數(shù)穩(wěn)定、活芽胞數(shù)達10,000億活芽胞每克等優(yōu)點。
文檔編號C12N1/20GK101935624SQ201010147918
公開日2011年1月5日 申請日期2010年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月9日
發(fā)明者余娜, 劉華梅, 李坤, 李青, 楊克華, 王巧梅, 程治國, 謝攀, 謝翔, 閆世君, 陳又香, 陳振民, 黃志遠, 龔永華 申請人:武漢科諾生物科技股份有限公司