一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組《-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組a-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（簡稱a-CGT酶）的方法，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。其具體步驟包括：（1)構(gòu)建軟化芽孢桿菌a-CGT酶重組枯草桿菌基因工程菌；(2)優(yōu)化發(fā)酵條件得到培養(yǎng)基關(guān)鍵組分麥芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳濃度分別為：15.5g/L，13g/L和20g/L，將重組枯草桿菌接種于該培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)36h后a-CGT酶活性為17.6U/mL，對早日實現(xiàn)枯草桿菌生產(chǎn)CGT酶以滿足其在食品中的應(yīng)用具有積極意義。
【專利說明】一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，屬于基因工程和 發(fā)酵工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（簡稱CGT酶，EC2. 4. 1. 19)是一種能夠催化淀粉、糖原、麥 芽寡聚糖等葡萄糖聚合物而獲得環(huán)糊精的胞外酶，可分為α-，β-和Υ-三種類型。環(huán)糊 精分子具有獨特的疏水空腔結(jié)構(gòu)，能包合疏水性客體分子，因此在食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域 具有廣泛的應(yīng)用。環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)均采用酶法合成，在環(huán)糊精研究的早期，由于沒有篩 選出高效生產(chǎn)CGT酶的菌株而導(dǎo)致環(huán)糊精的生產(chǎn)率很低，環(huán)糊精的應(yīng)用受到很大限制。目 前，國外對CGT酶的研究較多，而我國對此酶的研究尚處于起步階段，基因工程菌的研究不 多。
[0003] 為了克服天然菌株的低CGT酶生產(chǎn)能力，利用DNA重組技術(shù)將CGT酶編碼基因?qū)?入大腸桿菌和枯草桿菌中過量表達被認(rèn)為是最有效途徑之一。雖然關(guān)于外源蛋白表達的研 究枯草桿菌還遠遠落后于大腸桿菌，但是枯草桿菌屬于食品工業(yè)安全宿主菌，能將蛋白直 接分泌到胞外，在食品基因工程的研究中具有重要的意義。隨著基因工程的飛速發(fā)展，相信 枯草桿菌表達系統(tǒng)將更加完善，成為原核蛋白表達的最佳宿主之一。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組α -環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的 方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0006] 一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組a -CGT酶的方法，其特征在于包括如下步驟：
[0007] (1)構(gòu)建軟化芽孢桿菌a -CGT酶重組枯草桿菌基因工程菌；
[0008] (2)優(yōu)化發(fā)酵條件得到培養(yǎng)基關(guān)鍵組分麥芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳濃度分別 為：15. 5g/L，13g/L和20g/L，將重組枯草桿菌接種于該培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)36h后離心收集上 清液。
[0009] 其中步驟⑴的方法為：
[0010] I.克隆Cgt基因及其自身信號肽的片段：
[0011] 以P. macerans JFB05-01 (菌種保藏在國家典型微生物保藏中心，保藏號：CCTCC M203062)基因組DNA為模板，以P1，P2為引物擴增得到cgt基因及其自身信號肽的片段；
[0012] 正向引物 P1 :5，-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3'(含 EcoR I 酶切位點）
[0013] 反向引物 P2 :5' -CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3'(含 BamH I 酶切位點）
[0014] PCR 反應(yīng)體系：dNTPs 5μ L，IOXEx Taq buffer(Mg2+Plus)5y L，正向引物 Pl(10μM)lμL，反向引物P2(10μM)lμL，模板lμL，ExTaqHS(5U/μL)0·25μL，加入 ddH20 補足 50μ L。
[0015] PCR 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 2· 2min， 30個循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin，擴增得到目的基因PCR片段，割膠回收，回收片段與 PMD18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青 霉素的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8-10h后提取質(zhì)粒，將此 質(zhì)粒進行序列測定。
[0016] II.構(gòu)建重組質(zhì)粒pGJ-cgt :
[0017] 用于構(gòu)建表達載體的質(zhì)粒是PGJ103,含麥芽糖誘導(dǎo)型啟動子，將該質(zhì)粒和擴增的 目的基因進行EcoR I和BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后再用T4連接酶于16°C連接過 夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨芐青霉素 LB進行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的重組質(zhì)粒pGJ-cgt。
[0018] III.構(gòu)建含重組質(zhì)粒pGJ-cgt的枯草桿菌基因工程菌：
[0019] 將重組質(zhì)粒pGJ-cgt轉(zhuǎn)化枯草桿菌WB600得到含有軟化芽孢桿菌a -CGT酶基因 的重組枯草桿菌基因工程菌。
[0020] 步驟（2)中誘導(dǎo)劑麥芽糖的最佳濃度為15. 5g/L。
[0021] 步驟（2)中碳源為玉米淀粉，最佳濃度為13g/L。
[0022] 步驟（2)中氮源為酵母粉，最佳濃度為20g/L。
[0023] 本發(fā)明從食品工業(yè)安全宿主菌為出發(fā)點，構(gòu)建了軟化芽孢桿菌a-CGT酶重組枯 草桿菌基因工程菌，采用單因素實驗確定顯著影響因子，并采用響應(yīng)面中心組成實驗法研 究顯著影響因子的交互作用并確定各因子的最佳組合，尋找到基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳 條件，在該最佳條件下，重組酶活性為17. 6U/mL，對早日實現(xiàn)枯草桿菌生產(chǎn)CGT酶以滿足其 在食品中的應(yīng)用具有積極意義。

【具體實施方式】
[0024] 實施例1構(gòu)建重組質(zhì)粒pGJ-cgt
[0025] 以軟化芽抱桿菌（Peanibacillus macerans) JFB05-01為模板，以PI, P2為引物擴 增得到cgt基因及其自身信號肽的片段；
[0026] 正向引物 P1 :5，-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3'(含 EcoR I 酶切位點）
[0027] 反向引物 P2 :5，-CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3'(含 BamH I 酶切位點）
[0028] PCR 反應(yīng)體系：dNTPs 5μ L，IOXEx Taq buffer(Mg2+Plus)5y L，正向引物 Pl(10μM)lμL，反向引物P2(10μM)lμL，模板lμL，ExTaqHS(5U/μL)0·25μL，加入 ddH20 補足 50μ L。
[0029] PCR 反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 2. 2min， 30個循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。擴增得到目的基因PCR片段，割膠回收，回收片段與 PMD18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青 霉素的LB平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，8-10h后提取質(zhì)粒，將此 質(zhì)粒進行序列測定。
[0030] 將含麥芽糖誘導(dǎo)型啟動子的質(zhì)粒PGJ103和擴增的目的基因進行EcoR I和BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后再用T4連接酶于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli感受 態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于lOOmg/L氨芐青霉素LB進行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì) 粒，得到富集的重組質(zhì)粒pGJ-cgt。
[0031] 實施例2構(gòu)建重組枯草桿菌基因工程菌及分泌表達a -CGT酶
[0032] 將重組質(zhì)粒pGJ-cgt通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化枯草桿菌WB600,在含氯霉素（10 μ g/ mL) LB平板上經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基中37°C液體培養(yǎng)過夜，然后4% 接種量接入TB發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)1. 5 %麥芽糖誘導(dǎo)48h后產(chǎn)酶達到6. lU/mL，發(fā)酵上清液經(jīng) SDS-PAGE鑒定，在大約72kDa處出現(xiàn)一條蛋白條帶。
[0033] 實施例3單因素實驗優(yōu)化CGT酶發(fā)酵條件
[0034] 一般情況下，影響重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的可能因素很多，包括碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng) 基起始PH值、發(fā)酵溫度、種齡、接種量、裝液量等。通過在前期工作中對重組枯草桿菌產(chǎn)酶 發(fā)酵條件進行初步優(yōu)化的基礎(chǔ)上，可以確定本研究中影響該重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的主要因素為 誘導(dǎo)劑，碳源和氮源，因而通過單因素實驗考察了誘導(dǎo)劑濃度（5、10、15、20、25 8/1)，碳源 (葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、糊精和玉米淀粉，濃度按含碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等原則），氮源（蛋白 胨、酵母粉、牛肉膏、玉米漿，濃度按含氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)相等原則）對a-CGT酶發(fā)酵生產(chǎn)的影響。
[0035] 結(jié)果表明，隨著麥芽糖濃度的增加，菌體干重逐漸增加，當(dāng)麥芽糖濃度為15g/L 時，酶活達到最大值6. lU/mL，再增加麥芽糖濃度，酶活并未增加。不同碳源對產(chǎn)酶存在很大 差異，葡萄糖對菌體生長和產(chǎn)酶均不利，玉米淀粉有利于菌體生長和產(chǎn)酶，并且產(chǎn)酶高峰期 提前至36h，當(dāng)添加濃度為10g/L時，菌體干重和a -CGT酶酶活分別為10g/L和8. 3U/mL。 氮源酵母粉能獲得較高的酶活且有利于菌體生長，蛋白胨雖然不能促進產(chǎn)酶，但是比酶活 與酵母粉相當(dāng)，因而在添加酵母粉的基礎(chǔ)上添加4g/L蛋白胨使重組B. subtilis產(chǎn)酶增加 至 12. 5U/mL。
[0036] 實施例4響應(yīng)面中心組成實驗進一步優(yōu)化CGT酶發(fā)酵條件
[0037] 根據(jù)以上對營養(yǎng)因素進行單因素實驗的結(jié)果，選擇誘導(dǎo)劑-麥芽糖，碳源-玉米淀 粉，氮源-酵母粉作為響應(yīng)面設(shè)計的因素，每個因素選擇三個濃度水平，表1為響應(yīng)面實驗 因素水平安排表。表2列出了 Box-Behnken實驗設(shè)計下a -CGT酶活性的實驗值和模型的 預(yù)測值。
[0038] 對實驗數(shù)據(jù)進行方程擬合并進行方差分析，結(jié)果較顯著，得二階回歸方程Y = 16. 26667+3. 2375XXJ1. 53375ΧΧ2-0. 25375ΧΧ3-3. 7ΧΧ/-2. 75ΧΧ/-2. 04ΧΧ/-0. 0825Χ X1X2-O. WSXX1X3-O. 425XX2X3,其中 Y 為 a -CGT 酶酶活。
[0039] 表1響應(yīng)面中心組合實驗因素水平表 「00401

【權(quán)利要求】
1. 一種利用枯草桿菌生產(chǎn)重組α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（簡稱a-CGT酶）的方法， 其特征在于包括如下步驟： (1) 構(gòu)建軟化芽孢桿菌a -CGT酶重組枯草桿菌基因工程菌； (2) 優(yōu)化發(fā)酵條件得到培養(yǎng)基關(guān)鍵組分麥芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳濃度分別為： 15. 5g/L，13g/L和20g/L，將重組枯草桿菌接種于該培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)36h后離心收集上清 液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用枯草桿菌生產(chǎn)重組a-CGT酶的方法，其特征在于步驟 (1) 構(gòu)建含有軟化芽孢桿菌a -CGT酶基因cgt的重組枯草桿菌基因工程菌的方法為： I. 克隆cgt基因及其自身信號肽的片段： 以軟化芽孢桿菌（Peanibacillus macerans)JFB05-01為模板，以P1，P2為引物擴增得 到cgt基因及其自身信號肽的片段； 正向引物 P1 :5' -ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3'(含 EcoR I 酶切位點） 反向引物 P2 :5' -CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3'(含 BamH I 酶切位點） PCR 反應(yīng)體系：dNTPs 5μ L，IOXEx Taq buffer(Mg2+Plus)5y L，正向引物 Pl(10μM)lμL，反向引物P2(10μM)lμL，模板lμL，ExTaqHS(5U/μL)0·25μL，加入 ddH20 補足 50μ L。 PCR反應(yīng)條件：94°C預(yù)變性4min，94°C變性45s，60°C退火45s，72°C延伸2. 2min，30個 循環(huán)后，再于72°C延伸lOmin。擴增得到目的基因PCR片段，割膠回收，回收片段與pMDIS-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB 平板，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，S-IOh后提取質(zhì)粒，將此質(zhì)粒進行序 列測定。 II. 構(gòu)建重組質(zhì)粒pGJ-cgt : 用于構(gòu)建表達載體的質(zhì)粒是PGJ103,含麥芽糖誘導(dǎo)型啟動子，將該質(zhì)粒和擴增的目的 基因進行EcoR I和BamH I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回收后再用T4連接酶于16°C連接過夜， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨芐青霉素LB 進行液體培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒，得到富集的重組質(zhì)粒pGJ-cgt ; III. 構(gòu)建含重組質(zhì)粒pGJ-cgt的枯草桿菌基因工程菌： 將重組質(zhì)粒pGJ-cgt轉(zhuǎn)化枯草桿菌WB600得到含有軟化芽孢桿菌a -CGT酶基因的重 組枯草桿菌基因工程菌。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用枯草桿菌生產(chǎn)重組a-CGT酶的方法，其特征在于步驟 (2) 中誘導(dǎo)劑麥芽糖的最佳濃度為15. 5g/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用枯草桿菌生產(chǎn)重組a-CGT酶的方法，其特征在于步驟 (2)中碳源為玉米淀粉，最佳濃度為13g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用枯草桿菌生產(chǎn)重組a-CGT酶的方法，其特征在于步驟 (2)中氮源為酵母粉，最佳濃度為20g/L。
【文檔編號】C12R1/125GK104212776SQ201410440327
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】張佳瑜, 吳敬, 吳丹, 陳晟, 陳堅 申請人:江南大學(xué)