專利名稱：：5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及飼料工業(yè)和水體凈化劑一種枯草芽胞桿菌原藥(5，000億活芽胞/克)的制備方法，將在飼料工業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面上得到廣泛應(yīng)用。隨著芽胞桿菌功能還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大，該產(chǎn)品將應(yīng)用到如污染水體凈化、水果保鮮、垃圾除臭等新領(lǐng)域，在國(guó)內(nèi)國(guó)際市場(chǎng)上有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。
背景技術(shù)：
：自20世紀(jì)50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑發(fā)揮了重大作用。然而，由于抗生素負(fù)面效果越來越嚴(yán)重，世界衛(wèi)生組織己禁止在飼料中使用任何抗菌藥物，一些發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)獸用抗生素的使用也有明確規(guī)定。飼料和養(yǎng)殖業(yè)以添加抗生素預(yù)防和促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的飼養(yǎng)方式已經(jīng)受到了很大沖擊，抗生素替代品的使用和推廣成為養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必然方向。芽胞桿菌益生菌具備抗生素預(yù)防疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)的特點(diǎn)，成為抗生素的替代品，將取得理想的應(yīng)用效果，在養(yǎng)殖業(yè)中具有很大的開發(fā)潛力。益生菌又稱微生態(tài)制劑，是指有益微生物經(jīng)過特殊馴化和加工制成的活菌制劑，益生菌可以改善動(dòng)物腸道中微生物的菌群平衡，防治某些細(xì)菌性疾病的發(fā)生，能提高動(dòng)物的飼料利用率、提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)生長(zhǎng)和改善生產(chǎn)性能，得到安全無藥物殘留的動(dòng)物產(chǎn)品。現(xiàn)已開發(fā)成商品制劑的益生菌有芽胞桿菌類、酵母、乳酸菌、雙歧桿菌、鏈球菌、曲霉等，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtillus簡(jiǎn)稱Bs)是最重要的品種。目前，國(guó)內(nèi)芽胞桿菌益生菌制品的生成工藝主要有兩種，即固體發(fā)酵法和液體深層發(fā)酵法。固體發(fā)酵法是把益生菌接種到固體培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，其優(yōu)點(diǎn)是相對(duì)管理比較粗放，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，投資少的特點(diǎn)，但同時(shí)具易受雜菌污染，菌體含量不易控制、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。目前我國(guó)大多數(shù)芽胞桿菌益生菌產(chǎn)品都是采用該生產(chǎn)方法。液體深層發(fā)酵法是采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，將益生菌菌種接種到反應(yīng)器中進(jìn)行通風(fēng)培養(yǎng)，對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程都可以進(jìn)行精細(xì)的過程控制，具有便于無菌操作，容易控制菌體含量，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定的特點(diǎn)，但技術(shù)水平要求較高，相對(duì)固體發(fā)酵投資要高，但更適合工業(yè)化生產(chǎn)。其一般工藝流程為菌種接種培養(yǎng)一種子罐培養(yǎng)一發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)一排放培養(yǎng)液—收集菌體—加入適量載體和保護(hù)劑一干燥一粉碎一過篩一稀釋混和一成品包裝—質(zhì)檢—益生菌pfe口國(guó)內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生產(chǎn)的枯草桿菌制劑(有效活菌數(shù)一般在200億cfWg左右)和部分廠家采用液體發(fā)酵生產(chǎn)的制劑(芽胞數(shù)一般為1000-2000億cfti/g)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法，安全、高效優(yōu)質(zhì)，方法易行，由該工藝生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數(shù)達(dá)5,000億活芽胞/克。
發(fā)明內(nèi)容包括安全的枯草芽孢桿菌益生菌的篩選；培養(yǎng)基優(yōu)化及液體高密度補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)；高效的芽胞提取回收工藝；產(chǎn)品活芽胞數(shù)高。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施-1.Bs菌種的篩選從全國(guó)各地不同土壤和水體中收集富含芽孢桿菌芽胞的土樣和水樣，將樣品用無菌水稀釋到100-200個(gè)芽胞/ml水，涂布在A,分離培養(yǎng)基上，于29-3rC溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態(tài)特征的菌株轉(zhuǎn)接到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，29—3rC搖瓶培養(yǎng)后，選出生長(zhǎng)迅速(發(fā)酵周期36小時(shí)以內(nèi))、生物量高(600nm可見光光密度OD6()Q>70)的菌種KN-42轉(zhuǎn)接到試管斜面生長(zhǎng)后于4'C保種。2.Bs菌種的確認(rèn)對(duì)KN-42菌株進(jìn)行了形態(tài)和生理生化特征研究，測(cè)定KN-42菌株的16SrDNA共1421個(gè)有效堿基，根據(jù)枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進(jìn)行分子鑒定，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育資料及分類資料(伯杰氏細(xì)菌手冊(cè))鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO.M208249。3.高產(chǎn)Bs的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子篩選設(shè)計(jì)，利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考慮碳源、氮源、無機(jī)離子等多個(gè)因素之間的協(xié)同作用，用于尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(yàn)(PathofSte鄰estascent),和用于優(yōu)化響應(yīng)面最大值的中心組合設(shè)計(jì)(CentralCompositeDesign)來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析，設(shè)計(jì)優(yōu)化B49發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物復(fù)合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氫鉀(KH2P04)0.5g/L，氯化鈉(NaCl)3g/L)。4.液體深層高密度補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，以發(fā)酵前期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期OD、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定各時(shí)期遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期最佳營(yíng)養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關(guān)系。在分批發(fā)酵研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化高密度補(bǔ)料發(fā)酵工藝。5、高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2，升溫35。C，80目過濾，加3.18%。(質(zhì)量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。(質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥進(jìn)口風(fēng)溫20(TC，出口風(fēng)溫85-87。C，原粉活芽胞數(shù)達(dá)5,000億/克。發(fā)明的目的在于對(duì)篩選的生長(zhǎng)迅速、生物量高、產(chǎn)芽胞同步率高的枯草芽胞桿菌菌株(菌種專利保護(hù))，釆用培養(yǎng)基的優(yōu)化和高密度發(fā)酵工藝、高效芽胞回收工藝，生產(chǎn)出活芽胞數(shù)達(dá)到5,000億/克的枯草芽胞桿菌安全原藥，遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)通常采用的固體發(fā)酵方式生產(chǎn)的枯草桿菌制劑(有效活菌數(shù)一般在200億cfo/g左右)和部分廠家采用液體發(fā)酵產(chǎn)品(芽胞數(shù)一般為1000-2000億cfWg)。枯草芽胞桿菌KN-42(Bad〃縱wMfcKN-42)，CCTCCNO.M208249。一種5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原藥的制備方法，其步驟是1.Bs菌種的篩選從全國(guó)各地不同土壤和水體中收集富含芽孢桿菌芽胞的土樣和水樣，將樣品用無菌水稀釋到100-200個(gè)芽胞/ml水，涂布在A,分離培養(yǎng)基上(蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.0，1216'C滅菌30min)，于29—3rC溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態(tài)特征的菌株轉(zhuǎn)接到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，29—3rC搖瓶培養(yǎng)后，選出生長(zhǎng)迅速(發(fā)酵周期36小時(shí)以內(nèi))、生物量高(600nm可見光光密度OD卿^70)的菌種KN-42轉(zhuǎn)接到試管斜面生長(zhǎng)后于4'C保種。2.Bs菌種的確認(rèn)對(duì)KN-42菌株進(jìn)行了形態(tài)和生理生化特征研究，測(cè)定KN-42菌株的16SrDNA共1421個(gè)有效堿基，根據(jù)枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進(jìn)行分子鑒定，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育資料及分類資料(伯杰氏細(xì)菌手冊(cè))鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNO.M208249。3.高產(chǎn)Bs的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，首先從眾多因子中選擇重要的部分因子篩選設(shè)計(jì)，利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考慮碳源、氮源、無機(jī)離子等多個(gè)因素之間的協(xié)同作用，用于尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(yàn)(PathofSteepestascent),和用于優(yōu)化響應(yīng)面最大值的中心組合設(shè)計(jì)(CentralCompositeDesign)。來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析，設(shè)計(jì)優(yōu)化B49發(fā)酵培養(yǎng)基(B-49:為葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，，豆粕3.88g/L，水解植物復(fù)合氨基酸3.91g/L，，磷酸二氫鉀(KH2P04)0.5g/L，氯化鈉(NaCl)3g/L)。4.液體深層高密度補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，以發(fā)酵前期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期OD、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定各時(shí)期遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期最佳營(yíng)養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞形成關(guān)系。在分批發(fā)酵研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化高密度補(bǔ)料發(fā)酵工藝。5.高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2,升溫35。C,80目過濾，加3.18%。(質(zhì)量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。(質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥進(jìn)口風(fēng)溫200。C，出口風(fēng)溫85-87°C，原粉活芽胞數(shù)達(dá)5，000億/克。6.活芽胞數(shù)檢測(cè)稱取0.99g1.01g試樣到中性瓶中，加入100mL，濃度為0.85%(質(zhì)量比)水的生理鹽水，猛烈搖動(dòng)混合均勻。再把混合瓶放在磁力攪拌器(CU-4上海君竺儀器制造有限公司)平臺(tái)上混合30min后，放入超聲波水浴器(KQ-600B昆山市超聲儀器有限公司)中超聲15min，然后再放在勻質(zhì)器(Bagmixer400W/P/VW)中混合10min。將處理好的試樣溶液依次稀釋到10—8放入7(TC水浴鍋中水浴30min，然后稀釋到l(T取O,lmL到每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16hr20hr。計(jì)平板上的菌落數(shù)，計(jì)算試樣中枯草芽胞桿菌的芽胞數(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果(1)處理方法能有效分散粉劑中粘結(jié)集聚的芽胞、殺滅熱穩(wěn)定性和生物活性不穩(wěn)定的無效芽胞，準(zhǔn)確的檢測(cè)出產(chǎn)品中有效活芽胞的數(shù)量；(2)重復(fù)性好；(3)檢測(cè)過程不需要特殊昂貴的儀器；(4)成本低；(5)可以同時(shí)檢測(cè)7-8個(gè)樣品；(6)操作簡(jiǎn)單便于推廣。具體實(shí)施例方式一種5,000億活芽胞/克枯草芽胞桿菌原藥的制備方法，其步驟是1.BS菌種的篩選從全國(guó)各地不同土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺(tái)上，稱取樣品l.Og裝入小三角瓶中，加入9mL無菌水，充分振蕩后靜置，取上清液做濃度梯度稀釋(lx10、1X1(T，，1X1(T，1X1(T，1X1(T)。用移液槍吸取稀釋液100ul均勻涂布在分離培養(yǎng)基上，于30'C溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3—5d后，挑出芽胞同歩率高(芽胞形成率》90%)的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態(tài)特征的菌株轉(zhuǎn)接到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝量為25mL，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm，30。C搖瓶培養(yǎng)后，選出生長(zhǎng)迅速(發(fā)酵同期36小時(shí)以內(nèi))、生物量高(600nm可見光光密度OD,》70)的菌種KN-42轉(zhuǎn)接到試管斜面生長(zhǎng)后于4'C保種。(1)A,分離培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.0，12rC滅菌30min;(2)Bi液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕20g，玉米漿10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g，氯化鈉(NaCD3g，磷酸二氫鉀(KH2P04)0.5g，七水硫酸鎂(MgS04.7H20)0.2g，七水硫酸亞鐵(FeS04.7H20)O.Olg，水lOOOmL，pH7.5，12rC滅菌30min。2.Bs菌種的確認(rèn)對(duì)KN-42菌株進(jìn)行了形態(tài)和生理生化特征研究，根據(jù)該菌株的16SrDNA序列進(jìn)行分子分類。該菌株的16SrDNA共測(cè)定1421個(gè)有效堿基，系統(tǒng)發(fā)育資料及分類資料(伯杰氏細(xì)菌手冊(cè))鑒定該菌株為枯草芽胞桿菌。該菌株于2008年12月09日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，枯草芽胞桿菌KN-42(&cz7/船幼to'fcKN-42),CCTCCNO.M208249。(1)菌種鑒定理化實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>(2)菌種16SrDNA序列測(cè)定結(jié)果①測(cè)序試劑盒BigDyeTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit(PERKINELMER);②測(cè)序分析儀器ABIPRISM377DNASequencer;③測(cè)序引物16(+):5，GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3，16(_):5，CGGCTACCTTGTTACGAC3，④序列，共計(jì)1421bp，如SEQIDNO.1所示3.高產(chǎn)Bs的培養(yǎng)基優(yōu)化采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以芽胞數(shù)(cfo)為篩選指標(biāo)，利用單因子實(shí)驗(yàn)首先從眾多碳源(玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉)；氮源(水解植物復(fù)合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨)；微量元素(氯化鈷(CoCl2)、碳酸鈣(CaC03)、硫酸鎂(MgS04)、磷酸二氫鉀(KH2P04)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵(FeS04)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅(CuS04)、硫酸鋅(ZnS04))因子中選擇重要的部分因子篩選設(shè)計(jì)，利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考慮重要碳源(葡萄糖和玉米淀粉)、氮源(蛋白胨、豆粕和玉米漿)及無機(jī)離子(磷酸二氫鉀(KH2P04)和氯化鈉(NaCl))等多個(gè)因素之間的協(xié)同作用，用于尋找臨近最大值的優(yōu)化區(qū)域的最陡坡試驗(yàn)(PathofSteepestascent),和用于優(yōu)化響應(yīng)面最大值的中心組合設(shè)計(jì)(CentralCompositeDesign)來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，通過對(duì)回歸方程的分析來設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基B-49，芽胞數(shù)為70億cfu/ml。(1)、碳源因子通過單因子實(shí)驗(yàn)，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出葡萄糖和玉米淀粉為Bs最佳碳源需求因子。(2)、氮源因子通過單因子實(shí)驗(yàn)，從水解植物復(fù)合氯基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨中篩選出蛋白胨、豆粕和玉米漿為Bs最佳氮源需求因子。(3)、微量元素因子通過單因子實(shí)驗(yàn)，從氯化鈷(CoCl2)、碳酸轉(zhuǎn)(CaC03)、硫酸鎂(MgS04)、磷酸二氫鉀(KH2P04)、氯化鈉(NaCl)、硫酸亞鐵(FeS04)、氯化錳(MnCl2)、硫酸銅(CuS04)、硫酸鋅(ZnS04)中篩選出磷酸二氫鉀(KH2P04)和氯化鈉(NaCl)為Bs最佳微量元素需求因子。(4)、利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Plackett-BurmanDesign)篩選影響B(tài)s芽胞形成的重要因子，試驗(yàn)表明葡萄糖、玉米槳和蛋白胨對(duì)Bs芽胞形成有極顯著的影響，因此增加它們的用量對(duì)促進(jìn)Bs芽胞形成具有積極的意義。通過最陡坡試驗(yàn)(PathofSteepestascent)最終確定葡萄糖用量為14.42g/L，玉米漿用量為18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L時(shí)Bs芽胞數(shù)最高。利用SAS軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)(CentralCompositeDesign),最終得到Bs發(fā)酵最佳配方B-49:為葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L,，豆粕3.88g/L，水解植物復(fù)合氨基酸3.91g/L，，磯酸二氫鉀(KH2P04)0.5g/L，氯化鈉(NaCl)3g/L，采用該配方，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá)70億/ml。4.高密度液體補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量以響應(yīng)面法優(yōu)化的培養(yǎng)基配方B-49進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，以發(fā)酵前期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期OD、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定各時(shí)期最佳營(yíng)養(yǎng)平衡(以C/N表示)，及與芽胞數(shù)關(guān)系。在分批發(fā)酵配方上進(jìn)行碳源和氮源濃度加倍，分析出現(xiàn)反饋抑制因素及濃度，進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究，確定補(bǔ)料工藝為采用初始糖濃度10g/mL，通過補(bǔ)加葡萄糖，使發(fā)酵過程還原糖濃度保持0.5-1.0%(質(zhì)量比)水平，發(fā)酵工程共用葡萄糖7%(質(zhì)量比)；，發(fā)酵過程補(bǔ)加氨水，使pH控制在6.8-7.2范圍；發(fā)酵過程通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速控制溶氧水平不低于臨界氧(3ppm)。較分批發(fā)酵相比，雖然菌數(shù)和總耗量明顯增加，但采用補(bǔ)料工藝，不僅沒有出現(xiàn)底物反饋抑制，也沒有因?qū)?shù)期溶解氧不能維持在臨界氧之上而影響芽胞的形成。釆用此工藝，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá)100億/ml。5.高效的芽胞提取與回收工藝芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2，升溫35'C，80目過濾，加3.18%。(質(zhì)量比)硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。(質(zhì)量比)黃血鹽，攪拌1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進(jìn)行噴霧干燥,噴霧干燥進(jìn)口風(fēng)溫200'C，出口風(fēng)溫85-87。C，原粉活芽胞數(shù)達(dá)5,000億/克。6.活芽胞數(shù)檢測(cè)稱取0.99g1.01g試樣到中性瓶中，加入lOOmL，濃度為0.85克氯化鈉/100ml水的生理鹽水,猛烈搖動(dòng)混合均勻。再把混合瓶放在磁力攪拌器(CJJ-4上海君竺儀器制造有限公司)平臺(tái)上混合30min后，放入超聲波水浴器(KQ-600B昆山市超聲儀器有限公司)中超聲15min，然后再放在勻質(zhì)器(Bagmixer400W/P/VW)中混合10min。將處理好的試樣溶液依次稀釋到10—8放入7(TC水浴鍋中水浴30mki，然后稀釋到10—9取0.1mL到每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16hr20hr。計(jì)平板上的菌落數(shù)，按下式計(jì)算試樣中枯草芽胞桿菌的芽胞數(shù)。N=C/M*1010.........式中C----幾個(gè)有效平板的平均菌落數(shù)，單位為個(gè)；M----試樣的稱樣量，.單位為克(g);101G_—試樣稀釋倍數(shù)。兩次平行測(cè)定相對(duì)偏差不大于12%。SEQUENCELISTING〈110〉武漢科諾生物科技股份有限公司〈120>5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法〈130〉5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法<140>2009100629648<141>2009-07-03<160>1<170>Patentlnversion3.1.<210>1<211>1421<212>DNA<213〉枯草芽胞桿菌<400>1ttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccgacttcgactctcgtgg60tgtgeicgggcggtgtgt￡LCa鄉(xiāng)cccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatccgcga120ttactagcgattccagcttc3CgC3gtCgagttgcaga>ctgcgatccgaactgag犯cag1803tttgtggg8Lttggcttaacctcgcggtttcgctgccctttgttctgtccattgtagcac240gtgtgtagccC3ggtC3t犯ggggcatgatgatttgacgtcatccccatccttcctccggt300ttgtcsccggcagtcaccttagagtgcccaactgaatgctggcaactaaga/tc卿ggtt360gcgctcgttgcgggactt肌cccaacatctC3cgac8cgagctgacgacaaccatgcacc420acctgtcsictctgcccccget鄉(xiāng)ggacgtcctatctctaggattgtcagagggLtgtC鄉(xiāng)■acctggteaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctcaccgcttgtgcgggc540ccccgtc犯ttcctttgagtttcagtcttgcgaxxgtactcccc郷cgg3gtgCtt肌t600gcgttagctgC3gca^ct肌ggggc卿咖CCCCt犯C3Cttagcactcatcgtttacgg660cgtggEicteicceigggtatctaatcctgttcgctccccacgctttcgctcctcagcgtcag720ttaC3g￡lCCag卿gtcgccttcgccactggtgttcctccacatctctacgcatttcacc780gctacacgtggELglttCCgLCtctcctcttctgcactc犯gttccccagtttcc犯tgaccc840tccccggttg鄉(xiāng)cgggggctttcacatcagactt犯g肌accgcctgcgagccctttac900gcccaat肌ttccggacaacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagt960tagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccgccctatttgaacggcacttgtt1020cttccctaacaacagagctttacgatccgaaaaccttc3tcactcacgcggcgttgctcc1080gtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtctgggcc1140gtgtCtC3gtcccagtgtggccgatcaccctctc鄉(xiāng)tcggctacgcatcgtcgccttgg1200tgagccgttacctceiccaactagctaatgcgccgcgggtcC6ltCtgt犯gtggtogccg31260agccaccttttatgtctgaaccatgcggttcaaaca9/Ccatccggtattagccccggttt1320cccggagttatcccagtctttacccacgtgttactcacccgtccgccgct1380aacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcgacttgc314211權(quán)利要求1、一種枯草芽胞桿菌，其特征在于枯草芽胞桿菌KN-42(BacillussubtilisKN-42)，CCTCCNO.M208249。2、權(quán)利要求1所述的一種制備枯草芽胞桿菌原藥的方法，其步驟是A.Bs菌種的篩選從土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺(tái)上，稱取樣品裝入小三角瓶中，加入無菌水，振蕩后靜置，取上清液做10—2、10—3、10—4濃度梯度稀釋，用移液槍吸取稀釋液均勻涂布在分離培養(yǎng)基上，于29—3rC溫控培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出有Bs形態(tài)特征的菌株轉(zhuǎn)接到液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，500mL搖瓶裝量為25mL，搖床轉(zhuǎn)速為200rpm,3(TC搖瓶培養(yǎng)后，選出生長(zhǎng)迅速的菌種KN-42轉(zhuǎn)接到試管斜面生長(zhǎng)后于4匸保種；(1)A,分離培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化鈉10g，瓊脂15g，水1000mL，pH7.0，121。C滅菌30min;(2)B,液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基豆粕20g，玉米漿10g，葡萄糖25g，蛋白胨5g，氯化鈉3g，磷酸二氫鉀0.5g，七水硫酸鎂0.2g，七水硫酸亞鐵0.01g，水1000mL，pH7.5，12rC滅菌30min;B.對(duì)KN-42菌株進(jìn)行了形態(tài)和生理生化特征研究，測(cè)定KN-42菌株的16SrDNA共1421個(gè)有效堿基，根據(jù)枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進(jìn)行分子鑒定，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育資料及分類資料鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌；C.Bs的培養(yǎng)基采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以芽胞數(shù)為篩選指標(biāo)，利用單因子實(shí)驗(yàn)首先從碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子篩選設(shè)計(jì)，采用多元一次和二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系得到回歸方程，通過對(duì)回歸方程來設(shè)計(jì)培養(yǎng)基B-49,芽胞數(shù)為70億cfu/ml;(1)、碳源因子通過單因子實(shí)驗(yàn)，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出葡萄糖和玉米淀粉為BS碳源需求因子；(2)、氮源因子通過單因子實(shí)驗(yàn)，從水解植物復(fù)合氨基酸、棉籽粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天門冬氨酸、硫酸銨中篩選出蛋白胨、豆粕和玉米漿為BS氮源需求因子；(3)、微量元素因子通過單因子實(shí)驗(yàn)，從氯化鈷、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸銅、硫酸鋅中篩選出磷酸二氫鉀和氯化鈉為Bs微量元素需求因子；(4)、利用PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選Bs芽胞形成的因子，確定葡萄糖用量為14.42g/L，玉米漿用量為18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L時(shí)Bs芽胞數(shù)，利用SAS軟件設(shè)計(jì)中心組合實(shí)驗(yàn)，得到Bs發(fā)酵配方B-49為葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L，蛋白胨30.05g/L，豆粕3.88g/L，水解植物復(fù)合氨基酸3.91g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，氯化鈉3g/L;D.高密度液體補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，以發(fā)酵前期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期OD、溶氧、pH值、芽胞數(shù)為指標(biāo)，確定營(yíng)養(yǎng)平衡，及與芽胞數(shù)關(guān)系，在分批發(fā)酵配方上進(jìn)行碳源和氮源濃度加倍，采用糖濃度10g/ml,通過補(bǔ)加葡萄糖，使發(fā)酵過程還原糖濃度為0.5-1.0%質(zhì)量比，發(fā)酵過程共用葡萄糖7%質(zhì)量比；,發(fā)酵過程補(bǔ)加氨水，使pH控制在6.8-7.2范圍，發(fā)酵液活芽胞數(shù)達(dá)100億/ml;E.芽胞提取與回收工藝發(fā)酵罐酸化2N稀鹽酸，PH4.2,升溫35°C，80目過濾，加3.18%。質(zhì)量比硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27%。質(zhì)量比黃血鹽，攪拌l分鐘，靜置15分鐘，離心菌槳進(jìn)行噴霧干燥，噴霧干燥進(jìn)口風(fēng)溫20(TC，出口風(fēng)溫85-87°C，原粉活芽胞數(shù)達(dá)5,000億/克；F.活芽胞數(shù)檢測(cè)稱取0.99g1.01g試樣到中性瓶中，加入100mL，0.85%質(zhì)量比的生理鹽水，搖動(dòng)混合均勻，再把混合瓶放在磁力攪拌器平臺(tái)上混合30min后，放入超聲波水浴器中超聲15min，然后再放在勻質(zhì)器中混合10min，將處理的試樣溶液依次稀釋到10—8放入7CTC水浴鍋中水浴30min，然后稀釋到l(T取O.lmL到每個(gè)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放在37'C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16hr20hr。全文摘要本發(fā)明公開了一種5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法，其步驟是A.Bs菌種的篩選，從土壤和水體中收集樣品，在無菌超凈臺(tái)上，稱取樣品裝入小三角瓶中，加入無菌水，靜置；B.Bs菌種的確認(rèn)，根據(jù)16SrDNA序列進(jìn)行分子分類，該菌株的16SrDNA共測(cè)定有效堿基，鑒定該菌株；C.Bs的培養(yǎng)基，采用Box-Behken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，以芽胞數(shù)為篩選指標(biāo)，利用單因子實(shí)驗(yàn)首先從眾多碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子；D.高密度液體補(bǔ)料發(fā)酵技術(shù)提高發(fā)酵生物量，以響應(yīng)面法的培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵，以發(fā)酵前期，對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期OD、溶氧、pH、芽胞數(shù)為指標(biāo)；E.芽胞提取與回收工藝；F.活芽胞數(shù)檢測(cè)。由該工藝生產(chǎn)的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數(shù)達(dá)5,000億/克。文檔編號(hào)C12N1/20GK101619298SQ20091006296公開日2010年1月6日申請(qǐng)日期2009年7月3日優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日發(fā)明者娜余,劉華梅,青李,楊克華,王巧梅,程治國(guó),繆華軍,翔謝,陳又香,陳振民,黃志遠(yuǎn)申請(qǐng)人:武漢科諾生物科技股份有限公司