專利名稱：：開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程
技術(shù)領(lǐng)域：
中L-乳酸的生產(chǎn)方法，尤其是涉及一種開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的方法。
背景技術(shù)：
：乳酸(C2H5OCOOH)，又名α-羥基丙酸。乳酸可以分為L(zhǎng)-乳酸(左旋性)、D_乳酸(右旋性)和DL-乳酸(消旋性)。傳統(tǒng)上乳酸可用于食品、印染、制藥等領(lǐng)域。近年來，隨著白色污染日益受到關(guān)注以及礦物質(zhì)資源的不可再生性，以可再生資源為原料生產(chǎn)的可生物降解聚合物引起了人們的廣泛關(guān)注。其中，聚乳酸作為主要的生物可降解塑料之一，其物理性能與聚苯乙烯非常相似，有希望成為石油基塑料的替代物之一。可生物降解聚乳酸的生產(chǎn)需要高光學(xué)純度的L-乳酸，而目前高光學(xué)純度的L-乳酸的生產(chǎn)成本還比較高，這是造成可生物降解聚乳酸無法與石油基塑料競(jìng)爭(zhēng)的重要因素之一。微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)L-乳酸的主要方法。L-乳酸可以從淀粉、纖維質(zhì)、有機(jī)垃圾等再生資源中甚至廢棄物中發(fā)酵獲得，原料的來源廣泛。同時(shí)，可以通過菌株篩選和改造，得到可生產(chǎn)高光學(xué)純度的L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)菌株，生成的高光學(xué)純L-乳酸易于用于聚乳酸的合成。但是在大規(guī)模分批發(fā)酵過程中，每一批次發(fā)酵都需要在滅菌后的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)多級(jí)種子，以保證發(fā)酵培養(yǎng)過程中有足夠的生產(chǎn)菌株細(xì)胞支持發(fā)酵生產(chǎn)的進(jìn)行。多級(jí)種子培養(yǎng)不僅延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，還增加了種子罐等發(fā)酵設(shè)備的投入。此外，多級(jí)種子培養(yǎng)過程中的能量消耗尚無法避免。而在現(xiàn)代大規(guī)模發(fā)酵過程中，單罐發(fā)酵體積越來越大，種子培養(yǎng)體積也相應(yīng)增大，種子培養(yǎng)過程中的能量消耗不容忽視。為了避免每一批次都要進(jìn)行的多級(jí)種子培養(yǎng)，有報(bào)道提出半連續(xù)發(fā)酵的操作方式，即把部分發(fā)酵結(jié)束后的培養(yǎng)液作為下一批次發(fā)酵的種子。但是這種操作方式把發(fā)酵液中的代謝廢物帶入了新的發(fā)酵批次，容易引起發(fā)酵效率下降和菌株退化。針對(duì)這一問題，有報(bào)道提出細(xì)胞回收發(fā)酵操作，即將與發(fā)酵液分離后的菌體作為新的發(fā)酵批次的種子。目前，細(xì)胞回收發(fā)酵采用濾膜系統(tǒng)從發(fā)酵液中分離菌體。濾膜系統(tǒng)中的濾膜容易堵塞，必須定期更換。常規(guī)的細(xì)胞分離操作如旋轉(zhuǎn)離心如能用于細(xì)胞回收發(fā)酵，可簡(jiǎn)化全細(xì)胞回收半連續(xù)發(fā)酵的操作。但目前通常采用的嗜中溫乳酸生產(chǎn)菌株在非無菌條件下的細(xì)胞回收時(shí)容易污染雜菌，無法使用開放式細(xì)胞回收操作。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種操作簡(jiǎn)便、純度較高的開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的方法，是以嗜熱乳酸生產(chǎn)菌株，優(yōu)選凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCN22184為菌種進(jìn)行開放式發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，去除菌體的上清液即為含有高光學(xué)純度L-乳酸發(fā)酵液，離心后所得菌體再作為種子培養(yǎng)物接入下一批次發(fā)酵培養(yǎng)基中，以與上次發(fā)酵完全相同的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，如此循環(huán)，得到光學(xué)純L-乳酸。本發(fā)明采用凝結(jié)芽孢桿菌作為發(fā)酵菌種，所述凝結(jié)芽孢桿菌(Baci1luscoagulans)CASHCGMCCNa2184已于2007年09月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，并已在中國(guó)專利CN200710176060.9中公開。所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖130g/L，酵母粉220g/L，余量為水，pH值6.0。所述發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度50°C55°C，發(fā)酵時(shí)間4048小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速130150轉(zhuǎn)/分，其間自動(dòng)流加重量比為30%40%堿液控制發(fā)酵液pH值在6.06.5范圍內(nèi)。所述發(fā)酵條件優(yōu)選為發(fā)酵溫度50°C，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，旋轉(zhuǎn)半徑33毫米，流加堿液為重量比為40%的氫氧化鈉，發(fā)酵液pH值6.0。本發(fā)明突出特點(diǎn)是每次發(fā)酵液均在非無菌條件下以離心方式回收菌體并將菌體用于循環(huán)發(fā)酵。具體的，所述發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液以6，0008，000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速在非無菌條件下離心20士2分鐘；所述離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8，000轉(zhuǎn)/分。所述循環(huán)發(fā)酵次數(shù)優(yōu)選為28次。為獲得更好的發(fā)酵效果，所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNo2184菌種在發(fā)酵前還可先進(jìn)行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)。用上述方法獲得的光學(xué)純L-乳酸也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了一種開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的方法。本發(fā)明采用非無菌條件下回收菌體作為種子用于循環(huán)發(fā)酵。這種開放式全細(xì)胞回收技術(shù)可以采用常規(guī)的菌體分離單元操作如旋轉(zhuǎn)離心回收菌體，避免了膜單元的使用，降低了細(xì)胞回收費(fèi)用，提高了細(xì)胞回收效率，使細(xì)胞回收操作更加簡(jiǎn)便易行。開放式離心全細(xì)胞回收技術(shù)可以在非無菌條件下進(jìn)行，降低了細(xì)胞回收操作對(duì)設(shè)備和環(huán)境的要求，可以利用現(xiàn)有設(shè)備進(jìn)行細(xì)胞回收，減少了設(shè)備投資，降低了細(xì)胞回收操作復(fù)雜程度。本發(fā)明采用的芽孢桿菌屬于嗜熱乳酸生產(chǎn)菌，可以在培養(yǎng)基不滅菌的條件下進(jìn)行開放式發(fā)酵生產(chǎn)高光學(xué)純度L-乳酸，這是由于其能夠在50°C以上生長(zhǎng)并生成乳酸，而普通菌株不能在如此高溫條件下生長(zhǎng)，即使在離心操作時(shí)混入雜菌，由于其高生長(zhǎng)溫度，在以其為種子的后續(xù)發(fā)酵中也能夠成為優(yōu)勢(shì)菌株，抑制雜菌生長(zhǎng)，保證乳酸發(fā)酵的順利進(jìn)行。嗜熱乳酸生產(chǎn)菌株不僅能夠?qū)崿F(xiàn)開放式發(fā)酵，其高生長(zhǎng)溫度和抗污染能力還能夠使常規(guī)的菌體分離操作如旋轉(zhuǎn)離心能夠應(yīng)用于全細(xì)胞回收發(fā)酵。而普通菌株在非無菌離心操作時(shí)容易被雜菌。此外，本方法實(shí)現(xiàn)了非無菌條件下以常規(guī)離心方式回收細(xì)胞作為循環(huán)發(fā)酵的種子，簡(jiǎn)化了循環(huán)發(fā)酵細(xì)胞回收過程，有利于簡(jiǎn)化操作，降低L-乳酸發(fā)酵生產(chǎn)設(shè)備投入。本發(fā)明光學(xué)純L-乳酸的生產(chǎn)方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的光學(xué)純L-乳酸生產(chǎn)方法，具有純度高、低污染、生產(chǎn)效率高、對(duì)儀器設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適合大面積推廣和應(yīng)用。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。其目的是為了更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，因此，所舉例的實(shí)例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1、開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸本實(shí)施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，瓊脂15g/L，溶劑為水；所述斜面培養(yǎng)基的PH值為6.5，121°C滅菌20分鐘。種子培養(yǎng)基葡萄糖50g/L，酵母粉10g/L，碳酸鈣3g/L，溶劑為水；所述種子培養(yǎng)基的PH值為6.5，121°C滅菌20分鐘。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖130g/L，酵母粉10g/L，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基沒有經(jīng)過滅菌。用本發(fā)明開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵的方法生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸，具體方法包括以下步驟1.斜面培養(yǎng)將凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184以常規(guī)方法接種于斜面培養(yǎng)基上，50°C培養(yǎng)12小時(shí)。2.種子培養(yǎng)將步驟1培養(yǎng)的菌株在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有30mL種子培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，搖床振蕩培養(yǎng)(150轉(zhuǎn)/分)12小時(shí)，培養(yǎng)溫度50°C。制得種子培養(yǎng)液。3.發(fā)酵培養(yǎng)(第一次發(fā)酵)將上述種子培養(yǎng)液以體積比10%的接種量接種到3升置于5升發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基沒有經(jīng)過滅菌)中，以培養(yǎng)溫度500C(50°C55°C均可)，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分(130150轉(zhuǎn)/分均可)，培養(yǎng)48小時(shí)(4048小時(shí)均可)，結(jié)束發(fā)酵。培養(yǎng)過程中自動(dòng)流加重量比為40%(30%40%均可)氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液PH值維持在6.0(6.06.5均可)。4.細(xì)胞回收將步驟3中發(fā)酵液在非無菌條件下，以8，000轉(zhuǎn)/分(6，0008，000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)均可)離心20分鐘(20士2分鐘均可)回收菌體，上清液用于分離L-乳酸。5.重復(fù)發(fā)酵(第二次發(fā)酵)將回收的菌體作為種子培養(yǎng)物以體積比不低于5%的接種量接入下一批次發(fā)酵培養(yǎng)基中，以與第一次發(fā)酵完全相同發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后離心回收菌體，上清液用于分離L-乳酸。6.發(fā)酵液檢測(cè)菌體濃度采用分光光度計(jì)于620nm處檢測(cè)。L-乳酸濃度采用生物傳感分析儀SBA-40C(山東省科學(xué)院生物研究所)測(cè)定。L-乳酸光學(xué)純度采用AgilentllOO液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)分別測(cè)定發(fā)酵液中L-如酸和D-乳酸濃度，通過公式計(jì)算出L-乳酸光學(xué)純度。液相系統(tǒng)采用手性分離柱(日本三菱化學(xué)公司，MCIGEL-CRSlOff(3μ)4.6IDX50mm，光學(xué)異體分離用)，0.002mol/L硫酸銅為流動(dòng)相，流量0.5mL/min,進(jìn)樣量20μL，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，操作溫度25°C。D-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號(hào)為L(zhǎng)0625，L-乳酸標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，貨號(hào)為L(zhǎng)1750。L-乳酸光學(xué)純度(％)=L-乳酸濃度/(L-乳酸濃度+D-乳酸濃度)X100%發(fā)酵結(jié)束后，取各批次分離的發(fā)酵液樣品，根據(jù)上述檢測(cè)和計(jì)算方法檢測(cè)發(fā)酵液中菌體濃度、L-乳酸含量以及L-乳酸光學(xué)純度。結(jié)果顯示，第一批次發(fā)酵最大細(xì)胞濃度8.9(0D620nm)，上清液中L-乳酸濃度63g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.4g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.4%。第二批次發(fā)酵最大細(xì)胞濃度9.8(0D620nm)，上清液中L-乳酸濃度70g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.6g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.0%。由此可知，開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵能夠提高乳酸生產(chǎn)效率，同時(shí)保持L-乳酸光學(xué)純度在99%以上。實(shí)施例2、開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸不進(jìn)行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)，直接進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)將實(shí)施例1中第二次發(fā)酵所得發(fā)酵液在非無菌條件下，以8，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘回收菌體。去除菌體上清液即為含高光學(xué)純度L-乳酸發(fā)酵液。將回收菌體作為種子培養(yǎng)物以體積比不少于5%的接種量接入3升置于5升發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以與實(shí)施例1中相同的發(fā)酵條件進(jìn)行第三次循環(huán)發(fā)酵。第三次循環(huán)發(fā)酵結(jié)束，再如上述操作進(jìn)行第四次循環(huán)發(fā)酵。取各批次分離的發(fā)酵結(jié)束時(shí)的發(fā)酵液，檢測(cè)菌體濃度、L-乳酸含量以及L-乳酸光學(xué)純度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第三批次發(fā)酵最大細(xì)胞濃度10.8(0D620nm)，L-乳酸濃度71g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.6g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.3%。第四批次發(fā)酵最大細(xì)胞濃度11.5(0D620nm)，L-乳酸濃度74g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度1.7g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.0%。由此可知，隨著開放式全細(xì)胞回收發(fā)酵的循環(huán)，乳酸生產(chǎn)效率有進(jìn)一步的提升，L-乳酸光學(xué)純度保持在99%以上。實(shí)施例3以不同酵母粉濃度開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)含高光學(xué)純L-乳酸發(fā)酵液發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計(jì)4種培養(yǎng)基，所變化的是實(shí)施例1所述發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉濃度分別為2g/L、10g/L、15g/L、20g/L，葡萄糖130g/L，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基沒有經(jīng)過滅菌。不進(jìn)行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)，直接進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)將實(shí)施例2中第4批次發(fā)酵得到的發(fā)酵液以8，000轉(zhuǎn)/分非無菌條件下離心20分鐘得到的菌體作為種子，以2g/L酵母粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。再將發(fā)酵結(jié)束后得到的發(fā)酵液以8，000轉(zhuǎn)/分非無菌條件下離心收集的菌體作為種子，以10g/L酵母粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。再將發(fā)酵結(jié)束后離心收集的菌體作為種子，以15g/L酵母粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。再將發(fā)酵結(jié)束后以8，000轉(zhuǎn)/分非無菌條件下離心收集的菌體作為種子，以20g/L酵母粉為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。每次發(fā)酵接種量不低于5%。上述每一批次發(fā)酵結(jié)束后，根據(jù)上述實(shí)施例1所述的檢測(cè)和計(jì)算方法，檢測(cè)發(fā)酵液中菌體濃度、L-乳酸濃度以及L-乳酸光學(xué)純度。試驗(yàn)結(jié)果見表1，表明增加酵母粉濃度有利于提高L-乳酸生產(chǎn)效率。最大細(xì)胞光吸收可達(dá)31.8(0D620nm)。L-乳酸濃度最高可達(dá)107g/L，L_乳酸光學(xué)純度可達(dá)99.8%，生產(chǎn)強(qiáng)度2.9g/L/h。表1酵母粉濃度對(duì)開放式全細(xì)胞回收發(fā)酵的影響酵母粉濃度I最大細(xì)胞濃度IL-乳酸濃度I生產(chǎn)強(qiáng)度IL-乳酸光學(xué)純度(g/L)(0D620nm)(g/L)(g/L/h)(%)~~27Γ226O993<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實(shí)施例4、開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸本實(shí)施例中所使用的各培養(yǎng)基的組成如下斜面培養(yǎng)基和種子培養(yǎng)基配方與實(shí)施例1相同。發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖130g/L，酵母粉20g/L，余量為水；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0，發(fā)酵培養(yǎng)基沒有經(jīng)過滅菌。用本發(fā)明開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵的方法生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸，具體方法包括以下步驟1.斜面培養(yǎng)與實(shí)施例1相同。2.種子培養(yǎng)與實(shí)施例1相同。3.發(fā)酵培養(yǎng)將上述種子培養(yǎng)液以體積比10%的接種量接種到3升置于5升發(fā)酵罐中的發(fā)酵培養(yǎng)基(發(fā)酵培養(yǎng)基沒有經(jīng)過滅菌)中，以培養(yǎng)溫度55°C，培養(yǎng)40小時(shí)，結(jié)束發(fā)酵。培養(yǎng)過程中自動(dòng)流加重量比為30%氫氧化鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值維持在6.5。4.細(xì)胞回收將步驟3中培養(yǎng)液在非無菌條件下，以6，000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘回收菌體，上清液用于分離L-乳酸。5.重復(fù)發(fā)酵與實(shí)施例1相同。發(fā)酵結(jié)束后，取各批次分離的發(fā)酵液樣品，檢測(cè)發(fā)酵液中菌體濃度、L-乳酸含量以及L-乳酸光學(xué)純度。結(jié)果顯示，第一批次發(fā)酵最大細(xì)胞濃度10.5(0D620nm)，L-乳酸濃度88g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度2.2g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.4%。第二批次發(fā)酵最大細(xì)胞濃度12.1(0D620nm)，L-乳酸濃度95g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度2.4g/L/h，L-乳酸光學(xué)純度99.3%。由此可知，開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵能夠提高乳酸生產(chǎn)效率，同時(shí)保持L-乳酸光學(xué)純度在99%以上。權(quán)利要求一種開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的方法，是以嗜熱乳酸生產(chǎn)菌為菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行50℃～55℃下開放式發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心，去除菌體的上清液即為含有高光學(xué)純度L-乳酸發(fā)酵液；離心后所得菌體再作為種子培養(yǎng)物接入下一批次發(fā)酵培養(yǎng)基中，以與上次發(fā)酵完全相同的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后再對(duì)此次發(fā)酵液進(jìn)行離心操作；如此循環(huán)多次，得到光學(xué)純L-乳酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述嗜熱乳酸生產(chǎn)菌為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖130g/L，酵母粉220g/L，余量為水，pH值6.O。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度50°C55°C，發(fā)酵時(shí)間4048小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速130150轉(zhuǎn)/分，其間自動(dòng)流加重量比為30%40%堿液，控制發(fā)酵液pH值在6.06.5范圍內(nèi)。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生產(chǎn)方法，其特征在于每次發(fā)酵的接種量不少于5%，發(fā)酵溫度50°C，發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)，攪拌轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，流加堿液為重量比為40%的氫氧化鈉，發(fā)酵液PH值6.0。6.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其特征在于每次發(fā)酵液均在非無菌條件下以離心方式回收菌體并將菌體用于循環(huán)發(fā)酵；具體的，所述發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液以6，0008，000轉(zhuǎn)/分轉(zhuǎn)速在非無菌條件下離心20士2分鐘；所述離心轉(zhuǎn)速優(yōu)選為8，000轉(zhuǎn)/分。7.根據(jù)前述任一權(quán)利要求所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述循環(huán)發(fā)酵次數(shù)為28次。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述每次循環(huán)發(fā)酵中所用發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母粉含量逐次遞增；例如，第一次發(fā)酵時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉含量為2g/L，第二次發(fā)酵時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉含量為10g/L，第三次發(fā)酵時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉含量為15g/L，第四次發(fā)酵時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉含量為20g/L。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCCNa2184菌種在發(fā)酵前還需進(jìn)行斜面培養(yǎng)和種子培養(yǎng)。10.用權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述方法獲得的光學(xué)純L-乳酸。全文摘要本發(fā)明公開了一種開放式全細(xì)胞回收循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的方法。該方法是以凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CASHCGMCC№2184為菌種進(jìn)行開放式發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行離心，去除菌體的培養(yǎng)液即為含有高光學(xué)純度L-乳酸發(fā)酵液，離心后所得菌體再作為種子培養(yǎng)物接入下一批次發(fā)酵培養(yǎng)基中，以與上次發(fā)酵完全相同的發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，如此循環(huán)，得到光學(xué)純L-乳酸。本發(fā)明光學(xué)純L-乳酸的生產(chǎn)方法明顯優(yōu)于現(xiàn)有的光學(xué)純L-乳酸生產(chǎn)方法，具有純度高、低污染、生產(chǎn)效率高、對(duì)儀器設(shè)備要求低和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適合大面積推廣和應(yīng)用。文檔編號(hào)C12P7/56GK101805757SQ20101014802公開日2010年8月18日申請(qǐng)日期2010年3月24日優(yōu)先權(quán)日2010年3月24日發(fā)明者唐鴻志,孫際賓,王麗敏,許平,趙博,馬延和申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所