專(zhuān)利名稱(chēng)：慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于血液腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫 苗BCR/ABL-p IRES-SEA及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，對(duì)于慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)的治療 主要有傳統(tǒng)化療、IFN-α和酪氨酸激酶抑制劑靶向治療等。雖然這些治療方法已經(jīng)能夠 在很大程度上提高患者的生存質(zhì)量，患者的預(yù)后也有了較大改善，但腫瘤的微小殘留病變 (minimal residual disease,MRD)卻很難被現(xiàn)行治療方案根除。造血干細(xì)胞移植雖然能夠 根除MRD，但骨髓來(lái)源少，配型成功率低，高昂的移植費(fèi)用以及嚴(yán)重的移植相關(guān)并發(fā)癥限制 了該療法的推廣。由于許多白血病患者體內(nèi)都存在由于染色體易位所形成的融合基因，利 用融合基因作為誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗白血病治療的靶點(diǎn)已經(jīng)成為眾多研究人員追求的目標(biāo)。 由于體外表達(dá)的蛋白不一定具有與體內(nèi)蛋白一致的天然構(gòu)象，而且外源蛋白進(jìn)入體內(nèi)后以 誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)為主，而DNA疫苗則能夠有效地克服這些缺陷，同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì) 胞免疫。在常規(guī)治療結(jié)束后輔以CML特異的DNA疫苗治療是有希望根除MRD的方法之一。BCR/ABL融合基因是CML發(fā)病以及應(yīng)用酪氨酸激酶抑制劑甲磺酸伊馬替尼治療有 效的分子基礎(chǔ)，是一個(gè)特異的白血病抗原。表達(dá)BCR/ABL融合基因的細(xì)胞可誘導(dǎo)T細(xì)胞克隆 性增殖，提示該細(xì)胞內(nèi)的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到細(xì)胞表面，因此可以利用 BCR/ABL融合蛋白或融合基因誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，或者誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)BCR/ ABL的特異性CTL，達(dá)到免疫治療的目的。Ji等研究發(fā)現(xiàn)利用跨越BCR/ABL融合基因的融合 點(diǎn)的基因片段構(gòu)建的DNA疫苗能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫保護(hù)作用。利用BCR/ ABL融合基因制備DNA疫苗是有希望根除CML的MRD的方法之一。但單獨(dú)的多肽疫苗所產(chǎn)生的免疫效應(yīng)較弱，尋找合適的免疫佐劑成為臨床實(shí)際 應(yīng)用必須要解決的重點(diǎn)所在。超抗原可與抗原提呈細(xì)胞表面的MHC-II類(lèi)分子及TCRVii 區(qū)⑶R3外側(cè)區(qū)域結(jié)合，而不涉及TCRV β區(qū)⑶R3及TCR α的識(shí)別，這種激活T細(xì)胞的獨(dú)特 方式可產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答。目前較有研究基礎(chǔ)的超抗原主要是金黃色葡萄球菌腸毒素 A (Staphylococcal Enterotoxin A, SEA)等，SEA強(qiáng)大的T細(xì)胞激活功能使其成為CML免疫 治療的佐劑。目前對(duì)于制備BCR/ABL基因疫苗特異性目的基因的選擇尚無(wú)定論，如何篩選出具 有最佳免疫原性的BCR/ABL基因片段仍是此類(lèi)研究所面臨的核心問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種慢性粒細(xì)胞白血病 DNA疫苗BCR/ABL-p I RES-SEA。該DNA疫苗BCR/ABL-p IRES-SEA是能夠在真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí) 表達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白的質(zhì)粒。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA 的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供上述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA 的應(yīng)用。所述用于慢性粒細(xì)胞白血病特異免疫治療的DNA疫苗是一種能夠在真核細(xì)胞中同 時(shí)表達(dá)BCR/ABL蛋白和SEA蛋白的DNA疫苗，它能夠誘導(dǎo)CML患者機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CML細(xì)胞 的特異性CTL，從而清除患者體內(nèi)的微小殘留病變，達(dá)到治愈CML的目的。 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ ABL-pIRES-SEA，含有pIRES質(zhì)粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分別 位于PlRES質(zhì)粒上的IRES元件兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)上；其中，pIRES質(zhì)粒為商業(yè)性的質(zhì)粒，含 有多克隆位點(diǎn)A(MCS Α)、多克隆位點(diǎn)B(MCS B)和IRES元件，MCS A和MCS B分別位于IRES 元件的兩側(cè)，BCR/ABL基因可以位于MCS A或MCS B上，SEA基因可以位于MCS A或MCS B 上；所述BCR/ABL基因(大小為336bp)的核苷酸序列如下
ATGGGGCTCTATGGGTTTCTGAATGTCATCGTCCACTCAGCCACTGGATTTAAGCAGAGTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAA
TGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCTAGATG為啟始密碼子，TAG為終止密碼子；所述SEA基因(大小為774bp)的核苷酸序列如下
ATGAAAAAAACAGCATTTACATTACTTTTATTCATTGCCCTAACGTTGACAACAAGTCCACTTGTAAATGGTAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTAAAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCTTTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTGTTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATAATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATACAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATCTTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATGGGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCTTCGGTTAATTACGATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGATAATAAAACGATTAACTCTGAAAACATGCATA
TTGATATATATTTATATACAAGTTAA；所述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的制備方法，包括如下步 驟 (1)將BCR/ABL基因插入pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A或多克隆位點(diǎn)B中，得到BCR/ABL-p IRES 質(zhì)粒；(2)將SEA基因插入BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，SEA基因與BCR/ABL基因分別位于IRES元件的兩側(cè)，得到慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA ；所述的制備方法，更優(yōu)選包括如下步驟(1)提取白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA ；將得到的cDNA為 模板，通過(guò)引物Bl和B2 PCR擴(kuò)增出大小為354bp的BCR/ABL片段所述的引物Bl 5ATTlCTCGA^TGGGGCTCTATGGGTTTCTG-3‘；所述的引物B2 :5,-GCC0AATTCK:TAGATGTAGTTGCTTGGGAC-3,；所述的BCR/ABL片段(354bp)如下所示
att|ctcgag|atggggctctatgggtttctgaatgtcatcgtccactcagccactggatttaagcagagTTCAAAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACA
τοταφααττφ ο；其中，粗體ATG為起始密碼子；粗體TAG為終止密碼子；方框內(nèi)所述的CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)；方框內(nèi)所述的GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)；(2)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，通過(guò)引物Sl和S2 PCR擴(kuò)增出大小為 827bp的SEA片段；所述的引物Sl :5’-GC[TCTAdX|AATTATGCTTTAGAGGTGAG-3，;所述的引物S2 :5'-CG^TCGAC|TCAACTACCATGTTTAACTTG-3'；所述SEA片段(大小為827bp)序列如下
gcfrctaga|aattatgctttagaggtgagcaaaatgaaaaaaacagcatttacattacttttattcattGCCCTAACGTTGACAACAAGTCCACTTGTAAATGGTAGCGAGAAAAGCGAAGAAATAAATGAAAAAGATTTGCGAAAAAAGTCTGAATTGCAGGGAACAGCTTTAGGCAATCTTAAACAAATCTATTATTACAATGAAAAAGCTAAAACTGAAAATAAAGAGAGTCACGATCAATTTTTACAGCATACTATATTGTTTAAAGGCTTTTTTACAGATCATTCGTGGTATAACGATTTATTAGTAGATTTTGATTCAAAGGATATTGTTGATAAATATAAAGGGAAAAAAGTAGACTTGTATGGTGCTTATTATGGTTATCAATGTGCGGGTGGTACACCAAACAAAACAGCTTGTATGTATGGTGGTGTAACGTTACATGATAATAATCGATTGACCGAAGAGAAAAAAGTGCCGATCAATTTATGGCTAGACGGTAAACAAAATACAGTACCTTTGGAAACGGTTAAAACGAATAAGAAAAATGTAACTGTTCAGGAGTTGGATCTTCAAGCAAGACGTTATTTACAGGAAAAATATAATTTATATAACTCTGATGTTTTTGATGGGAAGGTTCAGAGGGGATTAATCGTGTTTCATACTTCTACAGAACCT
TCGGTTAATTACGATTTATTTGGTGCTCAAGGACAGTATTCAAATACACTATTAAGAATATATAGAGA
taataaaacgattaactctgaaaacatgcatattgatatatatttatatacaagttaaacatggtagt
tga|gtcgac^g；其中，粗體ATG為啟始密碼子；粗體TAA為終止密碼子；方框內(nèi)所述的TCTAGA為XbaI酶切位點(diǎn)；
方框內(nèi)所述的GTCGAC為SalI酶切位點(diǎn)；(3)用XhoI酶和EcoRI酶分別將pIRES質(zhì)粒和步驟(1)所述的BCR/ABL片段進(jìn) 行雙酶切，再通過(guò)T4 DNA連接酶將雙酶切后的BCR/ABL片段和pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，BCR/ ABL片段插入至pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中，得到BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒；(4)用XbaI酶和Sal I酶分別將步驟⑵得到的SEA片段和步驟(3)得到的 BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后通過(guò)T4 DNA連接酶將雙酶切后的SEA片段和BCR/ ABL-pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，SEA片段插入到BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)B中，得到慢 性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-p I RES-SEA。所述步驟(I)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性94°C 30sec，退火60°C 30sec ；延伸 72°C 30sec，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；首次預(yù)變性為94°C 4min，末次延伸為72°C IOmin ； 所述步驟⑵PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為首先94 V預(yù)變性4min，然后94 °C lmin, 50°C lmin，72°C Imin 循環(huán) 30 次，最后 72°C總延伸 IOmin0所述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA可應(yīng)用于制備治療慢性粒細(xì) 胞白血病的基因藥物。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果(1)本發(fā)明所述的慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA是一個(gè)能夠在 真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白的質(zhì)粒，將該DNA疫苗注射到小鼠體內(nèi)能夠表達(dá) BCR/ABL和SEA蛋白，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CML細(xì)胞的特異性CD8+T細(xì)胞，并伴有細(xì)胞因子分 泌增加，可以達(dá)到根除患者體內(nèi)的微小殘留病變的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所克隆的 BCR/ABL片段是有效的免疫片段，且SEA基因能有效地增強(qiáng)BCR/ABL片段的免疫效應(yīng)，BCR/ ABL-pIRES-SEA雙基因DNA疫苗可應(yīng)用于制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物。(2)本發(fā)明提供了 一個(gè)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗CML免疫效應(yīng)的BCR/ ABL-pIRES-SEA雙基因DNA疫苗，為治療CML的DNA疫苗的研發(fā)提供重要的數(shù)據(jù)和資料。(3)本發(fā)明利用腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異抗原與超抗原基因共同構(gòu)建DNA疫苗) 還可以為其他治療性腫瘤DNA疫苗的研究所借鑒。(4)本發(fā)明的DNA疫苗能通過(guò)促進(jìn)機(jī)體的特異細(xì)胞免疫和體液免疫功能而清除 CML患者體內(nèi)的微小殘留病變，最終達(dá)到治愈CML的目的。


圖1為BCR/ABL-pIRES-SEA雙表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。圖2為PCR擴(kuò)增獲得的BCR/ABL片段圖；其中泳道1 為 150bp DNA Marker ；
泳道2和3為PCR擴(kuò)增得到的BCR/ABL片段。圖3為PCR擴(kuò)增獲得的SEA片段的電泳檢測(cè)圖；其中泳道1 為 150bp DNAMarker ；泳道2和3為PCR擴(kuò)增得到的SEA片段。圖4為BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖；其中，泳道1 為 Ikb DNA marker ；泳道2為pIRES空質(zhì)粒單酶切； 泳道3為BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒單酶切；泳道4為BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒雙酶切；泳道5為BCR/ABL的PCR產(chǎn)物；泳道 6 為 150bp DNAmarker。圖5為BCR/ABL-pIRES-SEA重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果圖；其中，泳道1 為 Ikb DNA marker ；泳道2為BCR/ABL-p IRES-SEA重組質(zhì)粒單酶切；泳道3 為 BCR/ABL-p IRES-SEA 用 XhoI 酶和 EcoRI 酶雙酶切；泳道4 為 BCR/ABL-p IRES-SEA 用 XbaI 酶和 SalI 酶雙酶切；泳道5為pIRES空質(zhì)粒單酶切；泳道6為BCR/ABL的PCR產(chǎn)物；泳道7為SEA的PCR產(chǎn)物；泳道 8 為 150bp DNA marker。圖6為SEA-pIRES重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果圖；其中，泳道1 為 Ikb DNA marker ；泳道2為pIRES空質(zhì)粒單酶切；泳道3為SEA-pIRES重組質(zhì)粒單酶切；泳道4為SEA-pIRES重組質(zhì)粒用XhoI酶和EcoRI酶雙酶切；泳道5為SEA的PCR產(chǎn)物；泳道 6 為 150bp DNA marker。圖7為BCR/ABL-p IRES-SEA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K293細(xì)胞后進(jìn)行RT-PCR得到的產(chǎn)物電 泳圖；其中，泳道1為以空白組K562細(xì)胞cDNA為模板，Sl和S2為引物進(jìn)行的擴(kuò)增；泳道2為以轉(zhuǎn)染pIRES空質(zhì)粒的K562細(xì)胞cDNA為模板，Sl和S2為引物進(jìn)行的 擴(kuò)增；泳道3 4為轉(zhuǎn)染BCR/ABL-p IRES-SEA的K562細(xì)胞cDNA為模板，Sl和S2為引 物進(jìn)行的擴(kuò)增；泳道5為以空白組K562細(xì)胞cDNA為模板，Bl和B2為引物進(jìn)行的擴(kuò)增；泳道6為以pIRES空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞cDNA為模板，Bl和B2為引物進(jìn)行的 擴(kuò)增；泳道7 8為以轉(zhuǎn)染BCR/ABL-p IRES-SEA的K562細(xì)胞cDNA為模板，Bl和B2為 引物進(jìn)行的擴(kuò)增。
圖8為BCR/ABL-pIRES-SEA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K293細(xì)胞后蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖；其中，泳道1為陽(yáng)性對(duì)照SEA蛋白；泳道 2 為蛋白 marker (Blue Plus II Protein Marker)；泳道3為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組； 泳道4為轉(zhuǎn)染BCR/ABL-p IRES-SEA重組質(zhì)粒組。圖9為流式細(xì)胞儀檢測(cè)所構(gòu)建質(zhì)粒免疫小鼠后對(duì)CD4+、CDS+T細(xì)胞亞群的影響的 圖其中A為pIRES質(zhì)粒免疫小鼠組；B為BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒免疫小鼠組；C 為 BCR/ABL-p IRES-SEA 質(zhì)粒免疫小鼠組；D為SEA-pIRES質(zhì)粒免疫小鼠組；E為空白對(duì)照組，注射生理鹽水小鼠組。圖10為ELISA法檢測(cè)免疫后小鼠血清中INF- γ含量變化情況圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。實(shí)施例1 慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-p IRES-SEA重組質(zhì)粒的構(gòu)建，如圖1所示利用RT-PCR擴(kuò)增BCR/ABL片段，將該片段插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中構(gòu) 建出BCR/ABL-pIRES，然后通過(guò)PCR從金黃色葡萄球菌基因組DNA中擴(kuò)增出SEA基因，將該 基因插入到BCR/ABL-pIRES的多克隆位點(diǎn)B中構(gòu)建BCR/ABL_pIRES_SEA，經(jīng)過(guò)測(cè)序正確后， 成功構(gòu)建了 BCR/ABL-p IRES-SEA 質(zhì)粒。具體步驟如下1 BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒的構(gòu)建1. 1 BCR/ABL 片段的擴(kuò)增從白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞(購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù))中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA作為模板(K562細(xì)胞的RNA提取和cDNA合成均按常規(guī)方法進(jìn)行)，用上游引物Bi、 下游引物B2進(jìn)行PCR擴(kuò)增BCR/ABL片段，總反應(yīng)體積為50 μ L，其中含1 μ L cDNA, 0. 5 μ L starDNA 聚合酶，上下游引物各 1 μ L，dNTP8 μ L, 5xPCR BufferlO μ L，超純水 32. 5 μ L。反 應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94°C 30sec (首次為4min)；退火60°C 30sec ；延 伸72°C 30sec(末次為lOmin)，擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠在100伏電壓下電泳。電泳結(jié) 果如圖2所示，產(chǎn)物片段大小與預(yù)期結(jié)果相符，其大小為354bp，實(shí)際有效片段為336bp。擴(kuò) 增的PCR產(chǎn)物標(biāo)記為BCR/ABL。Bl :5'- att|ctcgag|atggggctctatgggtttctg- 3'；方框內(nèi)IctcgX^為Xh01酶切位點(diǎn)；B2 :5'- gcc|gaattc|ctagatgtagttgcttgggac -3‘；方框內(nèi)IGAATf^I為EcoRI酶切位點(diǎn)。
1.2 PCR 擴(kuò)增 SEA 片段細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根有限公司)提取金黃色葡萄球菌株(ATCC13565，購(gòu) 自中國(guó)藥品生物制品檢定所)基因組DNA，以金黃色葡萄球菌基因組DNA作為模板，用上游 引物Sl和下游引物S2 PCR擴(kuò)增SEA片段，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為827bp，實(shí)際有效的片段 為774bp?？偡磻?yīng)體積為50 μ L，其中含IyL cDNA,0. 5yL starDNA聚合酶，上下游引物各 1口1^，(1^138口1^，5\卩0 吐作1~1(^1^，超純水32.5口1^反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行。反應(yīng)條 件首先94°C預(yù)變性4min，然后94°C lmin,50°C lmin,72°C Imin循環(huán)30次，最后72°C總延 伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物在100伏特電壓下，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。si 5' -GCfTCTAG^ATTATGCTTTAGAGGTGAG -3'；方框內(nèi)Itctac^I為xbai酶切位點(diǎn)；
S2 5' -CGlGTCGA^CAACTACCATGTTTAACTTG -3‘；方框內(nèi)丨GTCG^I為SalI酶切位點(diǎn)；1.3 酶切Ε. Ζ. N. A.凝膠回收試劑盒純化BCR/ABL片段的PCR產(chǎn)物。將純化后的BCR/ABL片 段和pIRES質(zhì)粒用XhoI和EcoRI進(jìn)行雙酶切處理，具體反應(yīng)體系見(jiàn)表1。反應(yīng)體系旋渦振 蕩混勻后置于PCR儀中，37°C反應(yīng)5小時(shí)。表1BCR/ABL和SEA PCR產(chǎn)物與pIRES質(zhì)粒雙酶切反應(yīng)體系 1.4 連接純化上述酶切反應(yīng)產(chǎn)物，酶切后的BCR/ABL基因與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的pIRES質(zhì) 粒利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。體系配好混勻后16°C過(guò)夜，連接產(chǎn)物4°C保存，盡量 24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)體系共10yL，包括lyL10XBuffer，6yL PCR產(chǎn)物，IyL載 體，1 μ L T4DNA連接酶和1 μ L滅菌水。經(jīng)過(guò)上述步驟將擴(kuò)增的基因BCR/ABL插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中構(gòu)建出 BCR/ABL-pIRES 重組質(zhì)粒。1. 5轉(zhuǎn)化、篩選鑒定陽(yáng)性克隆將構(gòu)建好的BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOPlO感受態(tài)(天根有限 公司)后，16小時(shí)左右長(zhǎng)出菌落。每個(gè)培養(yǎng)皿隨機(jī)挑選數(shù)個(gè)單菌落，分別置于100 μ L LB培 養(yǎng)液(Amp 100yg/mL)中，旋渦震蕩混勻。取溶解單菌落的培養(yǎng)液1 μ L作為模板以相應(yīng)的 引物Bi、Β2進(jìn)行PCR(擴(kuò)增體系和方法同1. 1)。擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠在100伏 特電壓下進(jìn)行電泳。1.6提取質(zhì)粒及酶切鑒定
收集擴(kuò)增的大腸桿菌利用質(zhì)粒提取試劑盒提取BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒；將提 取的重組質(zhì)粒分別用XhoI和EcoRI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)體系共10 μ L，包括2yL 10XBuffer,luL XhoI,luL EcoRI和6 μ L DNA。體系配好后旋渦振蕩混勻，然后置于PCR 儀中37°C反應(yīng)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物100伏電壓下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。從BCR/ ABL-pIRES中切下來(lái)的BCR/ABL基因片段，大小為354bp，與預(yù)期結(jié)果相符(電泳結(jié)果如圖 4)。1. 7重組質(zhì)粒序列分析鑒定構(gòu)建的BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定正確后，還需要進(jìn)行測(cè)序以驗(yàn)證 插入多克隆位點(diǎn)A(MCS Α)序列的正確性，從插入片段的上游開(kāi)始延順時(shí)針?lè)较虿捎秒p脫氧 鏈末端終止法進(jìn)行單向測(cè)序，引物序列為上海英俊有限公司通用引物。測(cè)序結(jié)果與Genbank 中BCR/ABL-pIRES融合基因序列比對(duì)，可知重組質(zhì)粒中的插入的BCR/ABL-pIRES基因序列 完全正確。2BCR/ABL-pIRES-SEA 重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.1 酶切 Ε. Ζ. N. A.凝膠回收試劑盒純化SEA片段PCR產(chǎn)物，將純化后的PCR產(chǎn)物和BCR/ ABL-pIRES重組質(zhì)粒用Xbal I和Sal I進(jìn)行雙酶切處理，酶切反應(yīng)體系共30 μ L，包括8 μ L IOXH Buffer,2y L Xba Ι,2μ L Sal I,10uL DNA和8μ L滅菌水。反應(yīng)體系旋渦振蕩混 勻后置于PCR儀中，37°C反應(yīng)5小時(shí)。2. 2 連接純化上述酶切反應(yīng)產(chǎn)物。酶切后的SEA PCR產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣酶切處理的BCR/ ABL-pIRES重組質(zhì)粒利用T4DNA連接酶行連接反應(yīng)。體系配好混勻后16°C過(guò)夜，連接產(chǎn)物 4°C保存，盡量24h內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。連接反應(yīng)體系共10 μ L，包括IyL 10XBuffer，6 μ L PCR 產(chǎn)物，1 μ L載體和1 μ L T4DNA連接酶。經(jīng)過(guò)上述步驟將擴(kuò)增的SEA基因插入到pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)B中構(gòu)建出BCR/ ABL-p IRES-SEA 重組質(zhì)粒。2. 3轉(zhuǎn)化及篩選鑒定陽(yáng)性克隆方法同1. 4 ；取溶解單菌落的培養(yǎng)液1 μ L作為模板用Si、S2作為引物進(jìn)行菌落 PCR擴(kuò)增體系和方法同2. 1。2. 4常規(guī)提取質(zhì)粒及酶切鑒定將提取的BCR/ABL-pIRES-SEA重組質(zhì)粒用Xba I和Sal I進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切反 應(yīng)體系共 10μ L，包括2μ L IOXH Buffer, 1 μ L Xba I，1 μ L Sal I 禾口 6 μ L DNA。體系配 好后旋渦振蕩混勻，然后置于PCR儀中37°C反應(yīng)12小時(shí)，酶切產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠 電泳鑒定。電泳結(jié)果如圖5所示，從各重組質(zhì)粒中切下來(lái)的SEA基因片段大小均為827bp， 與預(yù)期結(jié)果相符。2. 5重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定從插入片段的下游開(kāi)始延逆時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行單向測(cè)序，測(cè)序引物序列為上海英俊有 限公司通用引物，測(cè)序結(jié)果顯示插入到BCR/ABL-pIRES-SEA組質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)B (MCS B)中 的SEA片段的序列與Genebank中的SEA序列是完全一致的。3. SEA-pIRES重組質(zhì)粒的構(gòu)建
把SEA連在pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A上，所用引物與Si、S2除酶切位點(diǎn)不一樣 外完全相同，所擴(kuò)增SEA片段完全相同。所用的引物S3 :5'-GC^TCGA^AATTATGCTTTAGAGGTGAG-3,；所用的引物S4 :5’-CG|GAATTC|TCAACTACCATGTTTAACTTG-3’ ；方框內(nèi)所述的CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)；方框內(nèi)所述的GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)；所用方法與構(gòu)建BCR/ABL-pIRES重組質(zhì)粒的方法相同，從SEA-pIRES中切下來(lái)的 SEA基因片段，大小為827bp，與預(yù)期結(jié)果相符(電泳結(jié)果如圖6)。測(cè)序鑒定完全正確。實(shí)施例2
研究構(gòu)建的慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗(即BCR/ABL-pIRES-SEA重組質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染 真核細(xì)胞后基因和蛋白表達(dá)1 篩選合適的待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，利用Lipofectamine 2000 Kit (Invitrogen公司) 轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮K293細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所)。利用Lipofectamine 2000 Kit轉(zhuǎn)染K293細(xì)胞，將培養(yǎng)板放入5% CO2培養(yǎng)箱中 (370C )培養(yǎng)，4 6小時(shí)后將含轉(zhuǎn)染試劑的0pti-MEM I培養(yǎng)基更換為含有體積百分比為 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，48小時(shí)后收集上清液和細(xì)胞。2 RT-PCR 檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48小時(shí)的K293細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板，分別 用引物Bi，B2(用于擴(kuò)增BCR/ABL片段，354bp)和Si，S2(用于擴(kuò)增SEA片段，827bp)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠在100伏特電壓下電泳。確定BCR/ABL和SEA基 因轉(zhuǎn)錄情況(結(jié)果見(jiàn)圖7)。該結(jié)果說(shuō)明了 BCR/ABL和SEA基因轉(zhuǎn)錄能在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水 平表達(dá)。3翻譯水平檢測(cè)外源質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)取細(xì)胞裂解液通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)BCR/ABL蛋白和SEA蛋白的表 達(dá)情況(結(jié)果見(jiàn)圖8)。該結(jié)果說(shuō)明了 BCR/ABL和SEA基因轉(zhuǎn)錄能在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白。實(shí)施例3研究慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗注射小鼠肌肉(BCR/ABL-pIRES-SEA重 組質(zhì)粒)后，不同時(shí)期的基因和蛋白表達(dá)和特異性CTL效應(yīng)等30只6 8周的健康純系雄性BALB/c小鼠(SCXK粵20040011，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物中心)隨機(jī)均分為5組(每組6只)，各小鼠分別于第1周、2周、4周各免疫1次， 共3次。A組(P組)每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射pIRES 200yg;B組(B-P組) 每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射BCR/ABL-pIRES 200 μ g ;C組(B_P_S組)每次于雙側(cè) 股四頭肌肌內(nèi)分別注射BCR/ABL-pIRES-SEA 200 μ g ;D組(S_P組)每次于雙側(cè)股四頭肌 肌內(nèi)分別注射SEA-pIRES 200yg;E組(N組)每次于雙側(cè)股四頭肌肌內(nèi)分別注射生理鹽 水200yg。于第六周末眼球取血，將小鼠處死，分離出股四頭肌。用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)及免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)目的基因在小鼠骨骼肌中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；ELISA法檢 測(cè)小鼠血清中INF-Y含量；CCK8試劑盒檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞特異性CTL活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) T淋巴細(xì)胞⑶4、⑶8亞群。結(jié)果(1)在小鼠注射部位肌肉組織的常規(guī)石蠟切片(HE染色)可見(jiàn)在各組肌肉間隙中發(fā)現(xiàn)有不同程度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，呈散在或不連續(xù)性的簇狀分布。小鼠肌肉組織提取的RNA中可檢測(cè)(RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR)到BCR/ABL基因及SEA基因的表達(dá)；(2)利 用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組免疫后小鼠⑶4+、⑶8+T細(xì)胞增殖情況(流式圖見(jiàn)圖9)，顯示 BCR/ABL-pIRES-SEA免疫組⑶8+T細(xì)胞有升高的趨勢(shì)；(3)小鼠脾細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞K562細(xì) 胞為靶細(xì)胞，效靶比為40 1，疫苗組經(jīng)CCK8試劑盒檢測(cè)顯示其對(duì)Κ562細(xì)胞具有特異性細(xì) 胞毒性作用，對(duì)Κ562細(xì)胞的殺傷率明顯高于ΝΒ4細(xì)胞對(duì)照組；(4) ELISA法檢測(cè)小鼠血清中 INF-Y含量與其他組比較明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見(jiàn)圖10)。結(jié)論本發(fā)明所述的慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-p IRES-SEA是一個(gè)能夠 在真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白的質(zhì)粒，將該DNA疫苗注射到老鼠體內(nèi)能夠表 達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CML細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答，可以達(dá)到根除患者 體內(nèi)的微小殘留病變的目的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明所克隆的BCR/ABL片段是有效的免疫 片段，且SEA基因能有效地增強(qiáng)BCR/ABL片段的免疫效應(yīng)，BCR/ABL-pIRES-SEA雙基因DNA 疫苗可應(yīng)用于制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA，其特征在于所述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA含有pIRES質(zhì)粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分別位于pIRES質(zhì)粒上的IRES元件兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)上；所述BCR/ABL基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SEA基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.權(quán)利要求1所述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA的制備方法，其特 征在于包括如下步驟(1)將BCR/ABL基因插入pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A或多克隆位點(diǎn)B中，得到BCR/ ABL-p IRES 質(zhì)粒；(2)將SEA基因插入BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，SEA基因與BCR/ABL基因分 別位于IRES元件的兩側(cè)，得到慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)提取白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞的RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；將得到的cDNA為模板， 通過(guò)引物Bl和B2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為354bp的BCR/ABL片段；所述的引物 Bl :5，-ATT |CTCGA(j ATGGGGCTCTATGGGTTTCTG-3'；所述的引物 B2 :5，-GCC lGAATTCl CTAGATGTAGTTGCTTGGGAC-3，；所述的BCR/ABL片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示；方框內(nèi)所述的CTCGAG為XhoI酶切位點(diǎn)；方框內(nèi)所述的GAATTC為EcoRI酶切位點(diǎn)；(2)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，通過(guò)引物Sl和S2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度 為827bp的SEA片段；所述的引物 Sl :5，-GC [rCTAGAl AATTATGCTTTAGAGGTGAG-3，；所述的引物 S2 :5，-CG |GTCGAC| TCAACTACCATGTTTAACTTG-3’ ；所述SEA片段的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示；方框內(nèi)所述的TCTAGA為XbaI酶切位點(diǎn)；方框內(nèi)所述的GTCGAC為SalI酶切位點(diǎn)；(3)用XhoI酶和EcoRI酶分別將pIRES質(zhì)粒和步驟(1)所述的BCR/ABL片段進(jìn)行雙酶 切，再通過(guò)T4DNA連接酶將雙酶切后的BCR/ABL片段和pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，BCR/ABL片段 插入至pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)A中，得到BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒；(4)用XbaI酶和SalI酶分別將步驟(2)得到的SEA片段和步驟(3)得到的BCR/ ABL-pIRES質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，然后通過(guò)T4DNA連接酶將雙酶切后的SEA片段和BCR/ ABL-pIRES質(zhì)粒進(jìn)行連接，SEA片段插入到BCR/ABL-pIRES質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)B中，得到慢 性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟⑴中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條 件為預(yù)變性94°C 30sec，退火60°C 30sec ；延伸72°C 30sec，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；首次預(yù)變 性為94°C 4min，末次延伸為72°C IOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟⑵中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為首先94°C預(yù)變性4min，然后94°C lmin,50°C lmin,72°C lmin循環(huán)30次，最后72°C總 延伸lOmin。
6.權(quán)利要求1所述慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA應(yīng)用于制備治療慢 性粒細(xì)胞白 血病的基因藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種慢性粒細(xì)胞白血病DNA疫苗BCR/ABL-pIRES-SEA及其制備方法和應(yīng)用。該DNA疫苗含有pIRES質(zhì)粒、BCR/ABL基因和SEA基因，BCR/ABL基因和SEA基因分別位于pIRES質(zhì)粒上的IRES元件兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)上，BCR/ABL基因和SEA基因的核苷酸序列分別如SEQ ID No.1和No.2所示。該DNA疫苗能夠在真核細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白，將該DNA疫苗注射到小鼠體內(nèi)能夠表達(dá)BCR/ABL和SEA蛋白，激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)CML細(xì)胞的特異性CD8+T細(xì)胞，并伴有細(xì)胞因子分泌增加，從而達(dá)到根除患者體內(nèi)的微小殘留病變的目的，因此，本發(fā)明可應(yīng)用于制備治療慢性粒細(xì)胞白血病的藥物。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101837134SQ20101016042
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日
發(fā)明者周羽竝, 李揚(yáng)秋, 楊力建, 林晨, 田紅霞, 陳少華, 高永鵬 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)