一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，首先采用含剛果紅的顯色培養(yǎng)基進行初篩，獲取產(chǎn)多糖細菌；進而采用菌落拉絲，通過拉絲效果進一步復篩，獲取產(chǎn)高粘性多糖的細菌，最后，選用低氮源濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基對通過前兩輪篩選的細菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，通過發(fā)酵液粘度變化測定，從而實現(xiàn)高粘性多糖膠細菌的判定，達到篩獲目標細菌的目的。本發(fā)明提供的篩選方法工作量較少，具有更好的篩選方向性和覆蓋全面性，以及更高的篩選效率。
【專利說明】
一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及細菌篩選技術領域，特別涉及一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法。
【背景技術】
[0002]微生物多糖種類眾多，包括胞內(nèi)多糖、胞壁多糖、胞外多糖等，其中，微生物胞外多糖因獨特的理化特性、產(chǎn)量高、易與菌體分離而被廣泛研究。近年來微生物胞外多糖已應用在食品、制藥、日化等行業(yè)。而高粘性的微生物胞外多糖(透明質(zhì)酸，還有假單胞菌屬所產(chǎn)生的結(jié)冷膠、黃原膠、威倫膠等)在各行業(yè)各業(yè)的應用更為廣泛。
[0003]目前，微生物胞外多糖是由細菌和真菌發(fā)酵分泌提取，其中細菌多糖占有很大的份額，良好的生產(chǎn)菌種是微生物發(fā)酵產(chǎn)品企業(yè)的核心競爭力，因此，篩選出優(yōu)良的高性能多糖生產(chǎn)菌株具有重大的現(xiàn)實意義和經(jīng)濟價值。
[0004]現(xiàn)有技術中對產(chǎn)高粘性多糖膠細菌的篩選，通常是在菌種分離純化后直接進行多糖發(fā)酵，由發(fā)酵液粘度來篩選目標菌株。該方法需要將所有待查菌株逐一進行液體發(fā)酵，工作量極大、篩選效率低。因此，有必要提供一種工作量小且能高效率地篩選出產(chǎn)高粘性多糖膠的目標細菌的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]有鑒于此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，先通過剛果紅顯色培養(yǎng)基上接種的菌落的顏色變化來快速甄別產(chǎn)多糖細菌，然后將產(chǎn)多糖細菌接種固體培養(yǎng)基，進而通過菌落拉絲評價篩獲產(chǎn)粘性多糖細菌，最后將菌落粘性較好的菌株接種低氮發(fā)酵培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，通過發(fā)酵液粘度變化篩獲產(chǎn)高粘性多糖的目標菌株。本發(fā)明提供的篩選方法的篩選效率高、工作量小，還可以具有良好的篩選方向性，真正獲得目標細菌。
[0006]本發(fā)明提供了一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，包括以下步驟:
[0007](I)平板顯色法篩獲產(chǎn)多糖的細菌:
[0008]將細菌培養(yǎng)基與剛果紅溶液混合后形成剛果紅顯示培養(yǎng)基，將所述剛果紅顯示培養(yǎng)基鋪板，制成剛果紅顯色平板；
[0009]取分離純化后的待篩細菌，將所述待篩細菌分別在無菌環(huán)境下接種至所述剛果紅顯色平板上，20?37°C下靜置培養(yǎng)24?48小時，觀察菌落的顏色有無變深，若觀察到菌落顏色變深，即為產(chǎn)多糖的細菌；
[0010](2)菌落拉絲法篩獲產(chǎn)粘性多糖的細菌:
[0011]將步驟(I)篩獲的細菌接種于固體培養(yǎng)基上，在20?37°C下培養(yǎng)24?48h，待形成一定大小的菌落后，用無菌牙簽接觸菌落并輕輕向外拉絲，觀察能否形成連續(xù)拉絲，若能形成連續(xù)拉絲，則為產(chǎn)粘性多糖的細菌；
[0012](3)低氮發(fā)酵篩獲產(chǎn)高粘性多糖的細菌:
[0013]將步驟(2)篩獲的細菌接種至低氮發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為20?37°C、振搖速度為150?300r/min下進行振蕩培養(yǎng)120-168h，持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵液的粘度變化趨勢，若發(fā)酵液的粘度持續(xù)升高，則判定產(chǎn)高粘性多糖的細菌，即獲得目標細菌。
[0014]本發(fā)明中，所述待篩細菌可以是來自不同環(huán)境的細菌經(jīng)過營養(yǎng)富集、菌株純化獲得?？梢詠碜杂诓蛷N下水口、廢棄水渠壁的細菌菌株等。
[0015]所述純化為本領域內(nèi)的常規(guī)操作。可以是將保存于4°C條件下的待篩細菌樣品，取1.0g與100ml LB液體培養(yǎng)基混合，20?37°C震蕩4?8h，之后取1.0mL的震蕩混合液與無菌生理鹽水進行梯度稀釋，將稀釋液涂布在固體LB培養(yǎng)基上，20?37°C靜置培養(yǎng)12?48h。挑取單菌落，進行劃線純化，獲取并保存待篩菌株。
[0016]本發(fā)明中采用剛果紅作為顯色劑制作顯色平板，通過觀察剛果紅顯色平板中接種的菌落顏色變化情況，初步篩選產(chǎn)多糖細菌。主要利用剛果紅與細菌所產(chǎn)多糖類物質(zhì)結(jié)合后呈現(xiàn)紅褐色陽性反應，具備產(chǎn)多糖能力的細菌菌落顏色變深，呈紅褐色，而不產(chǎn)多糖的菌株則呈陰性，菌落顏色無明顯變化。
[0017]本發(fā)明中采用剛果紅作為顯色劑，相比于現(xiàn)有技術中采用含熒光染料(如革蘭氏)或含苯胺藍的培養(yǎng)基來顯色而言，所述操作更簡單快捷，無需提供熒光光源進行觀察，也無需在培養(yǎng)完成后另加顯色劑進行菌落染色。
[0018]優(yōu)選地，所述剛果紅顯色培養(yǎng)基包括:葡萄糖、酵母粉，蛋白胨，KH2P04，MgS04.7H20，NH4NO3，瓊脂，剛果紅和水。
[0019]進一步優(yōu)選地，每IL所述剛果紅顯色培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:葡萄糖2?20g，酵母粉0.5?5.0g，蛋白胨 I.0?1g，KH2PO4 0.I ?2.0g，MgSO4.7H200.I ?0.5g，NH4NO3
0.1?2.0g，瓊脂15?20g，剛果紅:0.05?0.5g，其余為蒸餾水;所述剛果紅顯色培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2。調(diào)節(jié)pH值是采用HCl和NaOH溶液。
[0020]所述剛果紅顯色培養(yǎng)基的制備方法如下:取葡萄糖2?20g、酵母粉0.5?5.0g，蛋白胨 1.0?10g，KH2P04 0.1?2.0g，MgS04.7H20 0.I?0.5g,NH4NO3 0.1?2.0g，瓊脂 15?2(^，剛果紅0.05?0.58，加水至11^，調(diào)節(jié)口!1至7.0?7.2，121<€下高壓滅菌20111；[11后，鋪板，制成剛果紅顯色培養(yǎng)平板。
[0021 ]優(yōu)選地，步驟(I)中，所述鋪板是將所述剛果紅顯示培養(yǎng)基鋪在培養(yǎng)皿上。
[0022]能夠產(chǎn)生多糖的細菌種類較多，僅靠平板顯色難以將篩選范圍迅速縮小，對篩選效率的提高不明顯，因此，需要進一步快速縮小篩選范圍。
[0023]微生物胞外多糖作為生物高分子，能使菌落具有較大的粘度，其在固體培養(yǎng)基上，產(chǎn)粘性多糖的細菌能形成表面粘稠或四周有擴散現(xiàn)象的菌落，在外力作用下呈現(xiàn)出拉絲狀。根據(jù)拉絲長度即可初步判定菌落粘稠度，從而篩獲可能具有產(chǎn)高粘性多糖能力的細菌。所述拉絲長度為Icm以上時，優(yōu)選為3cm以上時，該菌落為粘絲菌落。
[0024]優(yōu)選地，在所述拉絲時，朝垂直于培養(yǎng)基的表面的方向向外拉絲。
[0025]優(yōu)選地，在每種細菌的4-6個菌落進行拉絲，每個菌落平行做2-3次。
[0026]優(yōu)選地，每IL所述固體培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:葡萄糖2?20g，酵母粉0.5?5.0g，蛋白胨 1.0?10g，KH2P04 0.1?2.0g，MgS04.7H20 0.1?0.5g，NH4N030.1?2.0g，瓊脂15?20g，其余為蒸餾水;所述固體培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2。
[0027]細菌所產(chǎn)的高分子聚合物中，除了多糖之外，糖蛋白、蛋白聚糖復合物也都有一定的粘度，通過菌落拉絲測試而篩選的細菌可能本身并不是產(chǎn)多糖的，因此，在篩選產(chǎn)高粘性多糖膠細菌的過程中，，僅靠菌落拉絲法難以實現(xiàn)良好的篩選方向性，需要進一步的篩選。本發(fā)明中，是對通過剛果紅平板顯色、菌落拉絲測試的細菌進行多糖發(fā)酵，以篩選出目標細菌。
[0028]優(yōu)選地，每IL所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:蔗糖20?100g，牛肉膏0.1?2.(^，硝酸鈉0?0.58，]\%304.7H20 0.I?0.5g，KH2P〇4 0.1?1.0g，含微量元素的溶液1.0?5.0mL，其余為蒸餾水，所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2;其中，所述微量元素包括銅、鋅和鈷。
[0029 ] 優(yōu)選地，所述微量元素還包括錳、鐵、鉬和硼中的一種或多種。
[0030]進一步優(yōu)選地，所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各組分= MnCl2.4H200?2.0g/L，F(xiàn)eS04.7H20 O?5.0g/L，H3B03 O?0.5g/L，CuCl2 10?50mg/L，ZnCl210?50mg/L，CoCl2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H20 O?50mg/L。微量元素溶液提前配制好，在使用時，每IL的培養(yǎng)基，加入1.0?5.0mL的含微量元素的溶液。
[0031]更優(yōu)選地，所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各成分=MnCl2.4H201.0?2.0g/L，F(xiàn)eS04.7H20 I?4.0g/L，H3B03 0.1?0.4g/L，CuCl2 10?50mg/L，ZnCl210?50mg/UC0CI2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H20 10?40mg/L。
[0032]更優(yōu)選地，每IL所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:蔗糖50g，牛肉膏
1.6g，硝酸鈉0.4g，MgS04.7H20 0.2g,KH2PO4 0.5g，含微量元素的溶液2mL，其余為蒸餾水，所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7.0;其中，每IL所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各成分:MnCl2.4Η20 1.8g/L，F(xiàn)eS04.7H20 2.5g/L，H3B03 0.285g/L，CuCl2 27mg/L,ZnCl2 21mg/UC0CI2.6H2O 7.4mg/L,NaMoO4.2H20 23mg/L，其余為蒸餾水。
[0033]優(yōu)選地，步驟(3)中，所述振搖速度為200-250r/min。所述振蕩培養(yǎng)的時間為144h。
[0034]如本發(fā)明所述的，步驟(3)中，接種后12?24h開始測定發(fā)酵液的粘度，若發(fā)酵液的粘度持續(xù)顯著升高，且發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的粘度在轉(zhuǎn)速為30r/min剪切速率下能達到100m Pa.s以上，則判定篩獲產(chǎn)高粘性多糖的細菌。在篩獲目標細菌之后，可以對其進行16SrRNA序列測定，以確定所述目標細菌的種屬。
[0035]本發(fā)明的
【申請人】，經(jīng)過反復摸索發(fā)現(xiàn)，能夠產(chǎn)高粘性多糖的目標細菌在氮源饑餓的情況下更易產(chǎn)生多糖，本申請中選用低氮源濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基對通過前兩輪篩選(剛果紅顯示平板-菌落拉絲)的細菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，當細菌培養(yǎng)進入穩(wěn)定期，所述低氮培養(yǎng)基中的氮源消耗殆盡后，會迫使目標細菌迅速產(chǎn)生多糖，發(fā)酵液的粘度顯著上升，發(fā)酵液的流動特性也發(fā)生明顯變化，從而實現(xiàn)高粘性多糖膠細菌的判定，達到篩獲目標細菌的目的。這一方法將有效保障篩選方向性和覆蓋面，可以有效避免陽性細菌的漏選。
[0036]本發(fā)明中首次將剛果紅顯色平板、菌落拉絲和菌種低氮發(fā)酵進行聯(lián)合，形成獨特的篩選方法，逐級縮小篩選范圍，其中大規(guī)模的定性篩選由剛果紅顯色平板和菌落拉絲來實現(xiàn)，操作簡單、歷時較短、篩選效率高，最后針對通過前兩輪篩選的少數(shù)細菌進行低氮發(fā)酵培養(yǎng)，監(jiān)測發(fā)酵液的粘度變化，以進一步確定目標菌株，本發(fā)明提供的篩選方法工作量較少，具有更好的篩選方向性和更高的篩選效率。
[0037]本發(fā)明的有益效果包括以下幾個方面:
[0038]1、本發(fā)明的篩選方法中，首次將剛果紅顯色平板、菌落拉絲和低氮發(fā)酵相聯(lián)合，層層遞進，逐級縮小篩選范圍，具有較好的篩選方向性和較高的篩選效率；
[0039]2、本發(fā)明中的低氮發(fā)酵培養(yǎng)基配方，有利于迫使細菌產(chǎn)生高粘性多糖，可以有效保障篩選方向性和覆蓋全面性，可以有效避免陽性產(chǎn)高粘性多糖的目標細菌的漏選；
[0040]3、本發(fā)明中首次采用剛果紅作為顯色劑制作顯色平板來篩選產(chǎn)多糖細菌，操作簡單，無需提供熒光光源進行觀察，也無需在培養(yǎng)完成后在另加顯色劑進行菌落染色。
【附圖說明】
[0041]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0042]圖1是本發(fā)明中產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法的流程示意圖。
[0043]圖2為本發(fā)明實施例1中通過剛果紅顯色培養(yǎng)基篩選的結(jié)果；
[0044]圖3為本發(fā)明實施例1中通過菌落拉絲的篩選效果；
[0045]圖4為本發(fā)明實施例1中不同菌株在低氮發(fā)酵過程中的粘度變化結(jié)果；
【具體實施方式】
[0046]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0047]實施例1
[0048]參見附圖1，本實施提供了一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，包括以下步驟:
[0049]SlOl:剛果紅顯色培養(yǎng)基篩選產(chǎn)多糖的細菌
[0050]將細菌培養(yǎng)基與剛果紅溶液混合后形成剛果紅顯示培養(yǎng)基，將所述剛果紅顯示培養(yǎng)基鋪板，制成剛果紅顯色平板；
[0051]取分離純化后的待篩細菌，將所述待篩細菌的菌落分別接種至所述剛果紅顯色平板上，觀察菌落的顏色有無變深，若觀察到菌落顏色變深，則初步篩獲產(chǎn)多糖的細菌。
[0052]其中，剛果紅顯示培養(yǎng)基通過以下方法配置:按照配方稱取各組分，將葡萄糖10g、酵母粉2.5g，蛋白胨5g，KH2P04 0.5g,MgSO4.7H20 0.2g，NH4N030.6g，瓊脂 15g，剛果紅0.2g放入容器中，加蒸餾水至1L，調(diào)pH至7.0，得到剛果紅顯示培養(yǎng)基。之后于121 °C下滅菌20min，將滅菌后的培養(yǎng)基鋪在培養(yǎng)皿上，形成剛果紅顯色平板。
[0053]具體來說，本實施例中，所述待篩細菌是來自于餐廚下水口、廢棄水渠壁等營養(yǎng)相對貧瘠的積水處，用無菌鑰匙刮取樣品后保存于4°C條件下，取1.0g的樣品與100ml LB液體培養(yǎng)基混合，20?37°C震蕩4?8h，之后取1.0mL的震蕩混合液與無菌生理鹽水進行梯度稀釋，將稀釋液涂布在固體LB培養(yǎng)基上，20?37 0C靜置培養(yǎng)12?48h。挑取單菌落，進行劃線純化，獲取并保存待篩菌株。
[0054]SlOl的部分篩選結(jié)果如圖2所示。剛果紅與產(chǎn)多糖細菌分泌的多糖結(jié)合呈紅褐色陽性反應，使菌落的顏色變深，而不產(chǎn)多糖菌株則呈陰性，菌落顏色無明顯變化。通過剛果紅顯色培養(yǎng)基中菌落顏色變化情況，即可初步篩獲產(chǎn)多糖細菌，其中將菌落顏色變深的細菌進行下一步驟的篩選。圖2中標號為Y4-4、Y2-8M、Y3-10M(標號為
【申請人】自己編排)的細菌菌落為可能產(chǎn)多糖的細菌，標號為的Y5-1M、Y5-8M的細菌菌落則為不產(chǎn)多糖的細菌。
[0055]S102:菌落拉絲法篩獲產(chǎn)粘性多糖的細菌
[0056]將SlOl篩獲的符合條件的細菌接種于固體培養(yǎng)基上，在20?35°C下培養(yǎng)24?48h，當菌落直徑達到5.0mm后，用無菌牙簽接觸菌落并輕輕向外拉絲，然后在2s內(nèi)垂直離開以觀察在培養(yǎng)基表面能否形成連續(xù)拉絲，每種細菌重復操作4-6個菌落進行拉絲，每個菌落平行做2-3次，并測量菌落拉絲的最大長度;若能形成連續(xù)拉絲，則為產(chǎn)粘性多糖的細菌，即篩獲了產(chǎn)粘性多糖的細菌。
[0057]本實施例中，每IL所述固體培養(yǎng)基包括如下含量的各組分::葡萄糖10g/L，酵母粉2.5g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04 0.5g/L,MgS04.7H20 0.2g/L,NH4NO3 0.6g/L，瓊脂 15g/L，其余為蒸餾水;固體培養(yǎng)基的pH為7.0。
[0058]S102的部分篩選結(jié)果如圖3所示。產(chǎn)粘性多糖細菌菌落較為粘稠，用無菌牙簽挑起時，能在固體培養(yǎng)基表面形成細長的拉絲，根據(jù)能否形成連續(xù)拉絲及拉絲長度即可初步判斷菌落粘稠度，從而篩獲產(chǎn)粘性多糖的細菌。圖3中，B中標號為Y2-2的細菌，C中標號為Y3-1OM的細菌，以及D中標號為Y4-4的細菌均能形成連續(xù)長度超過Icm的拉絲，A不能形成超過
Icm的連續(xù)拉絲，其中，B的菌落拉絲的最大長度超過2cm，C的菌落拉絲的最大長度超過3cm，D的菌落拉絲的最大長度超過5cmcm。這說明B、C、D中的細菌為可能產(chǎn)粘性多糖的細菌，可以進入下一步的篩選測試。
[0059]S103:低氮發(fā)酵法篩獲產(chǎn)高粘性多糖的細菌
[0060](I)配制含微量元素的溶液:所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各成分:MnCl2.4H20 1.8g/L，F(xiàn)eS04.7H20 2.5g/L，H3B03 0.285g/L,CuCl2 27mg/L,ZnCl2 21mg/L，CoCl2.6H2O 7.4mg/L,NaMoO4.2H20 23mg/L(溶劑為水)。
[0061](2)制備低氮發(fā)酵培養(yǎng)基:按照配方稱取各組分，蔗糖50g，牛肉膏1.6g，硝酸鈉0.4g,MgSO4.7H20 0.2g，KH2P04 0.5g放入容器中，加入2mL的上述含微量元素的溶液，并加蒸餾水至IL，調(diào)pH至7.0，得到所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0062](3)將S102篩獲的符合條件的細菌接種至上述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為30°C、振搖速度為200r/min下進行振蕩培養(yǎng)144h，持續(xù)觀察并用Brookfield粘度計監(jiān)測發(fā)酵液的粘度變化趨勢，若發(fā)酵液的粘度顯著上升，則為產(chǎn)高粘性多糖的細菌，即獲得目標細菌。
[0063]本發(fā)明的低氮發(fā)酵培養(yǎng)基有利于迫使細菌產(chǎn)生高粘性多糖，可以有效保障篩選方向性和覆蓋全面性，可以有效避免陽性產(chǎn)高粘性多糖的目標細菌的漏選。S103的篩選結(jié)果如圖4所示。其中A組為編號Y4-4的細菌;B組為編號Y3-1OM的細菌，C為編號Y2-2的細菌；。由圖4可知，Y4-4、Y3-10M的細菌在低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的粘度持續(xù)顯著上升，而C組細菌的發(fā)酵液粘度基本保持不變，從而判斷Υ4-4、Υ3-10Μ的細菌為產(chǎn)高粘性多糖的目標細菌，即目標細菌，而Υ2-2的細菌不是期望的目標細菌。
[0064]實施例2
[0065]—種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，操作步驟基本同實施例1，只是具體參數(shù)略有不同，其中:
[0066]實施例2的剛果紅顯示培養(yǎng)基是采用如下方法制備:
[0067]將葡萄糖5g、酵母粉1.5，蛋白胨38，10^04 0.3g,MgSO4.7H20 0.1g^NH4NO3 0.4g，瓊脂18g，剛果紅0.1g放入容器中，加入IL的水，調(diào)pH至7.1，得到剛果紅顯示培養(yǎng)基。
[0068]實施例2的固體培養(yǎng)基包括以下各組分:相對于水用量為1.0L，還含有葡萄糖15g，酵母粉l.0g，蛋白胨3g，KH2P04 0.3g,MgSO4.7H20 0.1g,NH4NO30.4g，瓊脂 18g;所述固體培養(yǎng)基的pH為7.0。
[0069]實施例2的低氮培養(yǎng)基包括以下各組分:相對于水用量為1.0L，還含有蔗糖40g，牛肉膏l(xiāng).0g，硝酸鈉0.3g，MgS04.7H20 0.1 g, KH2PO4 0.2g，微量元素溶液2mL，所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7.2，其中所述微量元素溶液包括以下濃度的各成分:MnCl2.4H20 1.2g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 2.0g/L，H3B03 0.20g/L,CuCl2 20mg/L,ZnCl2 15mg/L，CoCl2.6H2O 5.0mg/L，NaMoCU.2H2O 10mg/L。
[0070]實施例3
[0071 ] 一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，操作步驟基本同實施例1，只是具體參數(shù)略有不同，其中:
[0072]實施例3的剛果紅顯示培養(yǎng)基是采用如下方法制備:
[0073]將葡萄糖20g、酵母粉2.0，蛋白胨2g，KH2P040.6g,MgSO4.7H20 0.3g,NH4NO3
0.8g，瓊脂20g，剛果紅0.3g放入容器中，加入IL的水，調(diào)pH至7.2，得到剛果紅顯示培養(yǎng)基。
[0074]實施例3的固體培養(yǎng)基包括以下各組分:相對于水用量為1.0L，還含有葡萄糖20g，酵母粉2.0g，蛋白胨4g，KH2P04 0.6g,MgSO4.7H20 0.3g，NH4N030.5g，瓊脂20g;所述固體培養(yǎng)基的pH為7.2。
[0075]實施例3的低氮培養(yǎng)基包括以下各組分:相對于水用量為1.0L，還含有蔗糖60g，牛肉膏2.0g，硝酸鈉0.2g，MgS04.7H20 0.3g，KH2P04 0.7g，微量元素溶液3mL，所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7.1，其中所述微量元素溶液包括以下濃度的各成分:MnCl2.4H20 1.5g/L，F(xiàn)eSO4.7H20 1.5g/L，H3B03 0.25g/L,CuCl2 40mg/L,ZnCl2 30mg/L,CoCl2.6H2O 8.0mg/L，NaMoCU.2H2O 30mg/L。
[0076]以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
【主權項】
1.一種產(chǎn)高粘性多糖的細菌的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)平板顯色法篩獲產(chǎn)多糖的細菌: 將細菌培養(yǎng)基與剛果紅溶液混合后形成剛果紅顯示培養(yǎng)基，將所述剛果紅顯示培養(yǎng)基鋪板，制成剛果紅顯色平板； 取分離純化后的待篩細菌，將所述待篩細菌分別接種至所述剛果紅顯色平板上，20?37°C下靜置培養(yǎng)24?48小時，觀察菌落的顏色有無變深，若觀察到菌落顏色變深，即為產(chǎn)多糖的細菌； (2)菌落拉絲法篩獲產(chǎn)粘性多糖的細菌: 將步驟(I)篩獲的細菌接種于固體培養(yǎng)基上，在20?37°C下培養(yǎng)24?48h，待形成一定大小的菌落后，用無菌牙簽接觸菌落并輕輕向外拉絲，觀察能否形成連續(xù)拉絲，若能形成連續(xù)拉絲，則為產(chǎn)粘性多糖的細菌； (3)低氮發(fā)酵法篩獲產(chǎn)高粘性多糖的細菌: 將步驟(2)篩獲的細菌接種至低氮發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為20?37°C、振搖速度為150?300r/min下進行振蕩培養(yǎng)120-168h，持續(xù)監(jiān)測發(fā)酵液的粘度變化趨勢，若發(fā)酵液的粘度持續(xù)升高，則為產(chǎn)高粘性多糖的細菌，即獲得目標細菌。2.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，每IL所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:蔗糖20?100g，牛肉膏0.1?2.(^，硝酸鈉0?0.58，1^304.7H20 0.1?0.5g，KH2PO4 0.1?1.0g，含微量元素的溶液1.0?5.0mL，其余為蒸餾水，所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2;其中，所述微量元素包括銅、鋅和鈷。3.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述微量元素還包括錳、鐵、鉬和硼中的一種或多種。4.如權利要求2所述的篩選方法，其特征在于，所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各成分:MnCl2.4H20 O ?2.0g/L，F(xiàn)eS04.7H20 O ?5.0g/L，H3B030?0.5g/L，CuCl2 10 ?50mg/L,ZnCl2 10?50mg/L，CoCl2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H20 0?50mg/L。5.如權利要求4所述的篩選方法，其特征在于，所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各成分:MnCl2.4H20 1.0?2.0g/L，F(xiàn)eS04*7H20 I?4.0gA^H3BO30.I?0.4g/L，CuCl2 10?50mg/L，ZnCl2 10?50mg/L，CoCl2.6H2O I?10mg/L，NaMo04.2H2O 10?40mg/L。6.如權利要求2-4所述的篩選方法，其特征在于，每IL所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:蔗糖50g，牛肉膏1.6g，硝酸鈉0.4g,MgSO4.7H200.2g，KH2P04 0.5g，含微量元素的溶液2mL，其余為蒸餾水，所述低氮發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為7.0;其中每IL所述含微量元素的溶液包括以下濃度的各成分= MnCl2.4H20 1.8g/L，F(xiàn)eS04.7H20 2.5g/L，H3B03 0.285g/L，CuCl2 27mg/L,ZnCl2 21mg/L，CoCl2.6H2O 7.4mg/L,NaMoO4.2H20 23mg/L，其余為蒸餾水。7.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(I)中，每IL所述剛果紅顯色培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:葡萄糖2?20g，酵母粉0.5?5.(^，蛋白胨1.0?1(^，1?2?04 0.1?2.0g,MgSO4.7H20 0.1?0.5g，NH4N03 0.1?2.0g，瓊脂 15?20g，剛果紅:0.05?0.58，其余為蒸餾水;所述剛果紅顯色培養(yǎng)基的PH為7.0?7.2。8.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，每IL所述固體培養(yǎng)基包括如下含量的各組分:葡萄糖2?2(^，酵母粉0.5?5.(^，蛋白胨1.0?1(^，1(!12?04 0.1?2.0g，MgSO4.7H20 0.I?0.5g，NH4NO3 0.1?2.0g，瓊脂15?20g，其余為蒸餾水;所述固體培養(yǎng)基的pH為7.0?7.2。9.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中還包括，測量連續(xù)拉絲的細菌菌落的拉絲長度，若拉絲長度在Icm以上時，則判斷為產(chǎn)粘性多糖的細菌。10.如權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)中，當發(fā)酵液的粘度在發(fā)酵周期內(nèi)持續(xù)升高，且發(fā)酵液的粘度在轉(zhuǎn)速為30r/min剪切速率下能達到100m Pa.s以上，則判定篩獲產(chǎn)高粘性多糖的細菌。
【文檔編號】C12N1/20GK105907682SQ201610378514
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】劉陳立, 張炳照, 邵翅, 鄧譽峰, 程傳號
【申請人】深圳先進技術研究院