專利名稱：棉花一片多靶標的fish方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于分子細胞遺傳學領域，具體地，本發(fā)明涉及棉花一片多靶標的FISH方法。
背景技術(shù)：
染色體原位雜交技術(shù)是根據(jù)核酸分子堿基互補配對的原理，將有放射性或非放 射性標記的外源核酸探針，與染色體上變性處理后的單鏈DNA互補配對，再經(jīng)過一系列的 檢測手段將待測的核酸序列在染色體上的位置顯示出來的技術(shù)。在染色體原位雜交技 術(shù)創(chuàng)建初期，均采用放射性同位素標記探針，但隨著熒光素物質(zhì)出現(xiàn)后，開始使用熒光素 檢出雜交信號，雜交結(jié)果在熒光顯微鏡下觀察，即熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，簡稱為 FISH)。基因組原位雜交(genomicin situ hybridization, GISH)技術(shù)是 80 年代末 90 年代初發(fā)展起來的一種原位雜交技術(shù)。它用來自一個物種的總基因組DNA作為標記探針， 以適當濃度的另一物種總基因組DNA進行封阻，在靶染色體上進行原位雜交。相對于標記 DNA探針，高濃度封阻DNA優(yōu)先與靶染色體上共有保守序列雜交，剩下的外源種特異性序列 主要被標記探針所雜交。GISH技術(shù)是跟蹤檢測雜種的真實性及其后代外源染色體或染色體 片段存在與否的一個快速、靈敏、準確的手段。cGISH是一種新的基因組原位雜交分子顯帶方法，它是利用一個物種的基因組 DNA作探針對其它物種染色體進行原位雜交，其雜交信號檢出程序是專門用于檢出重復 DNA序列的，因此可以直觀地顯示不同物種間共享的重復序列在染色體上的分布(Jutta. et al.，2001)。cGISH最初用于植物中檢測雜交后代是否存在或是否滲入了原物種的基因組 DNA，后來逐漸成為一種基因組進化分析的新手段。不同種間的比較基因組雜交在物種進化 和親緣關(guān)系的研究上有重要作用，是研究不同物種基因組間重復序列的變異性和保守性的 一種簡便方法。然而，以熒光原位雜交技術(shù)為基礎的cGISH，對某一物種及近緣種基因組進行比較 基因組熒光原位雜交分析時，一般都是采用一固定探針分別對不同的靶DNA進行雜交，將 得到的實驗結(jié)果進行對比分析。這樣，當這一固定探針在某一物種及近緣種染色體上雜交 時，一旦FISH檢測后無信號產(chǎn)生時就很難定義，到底是人為操作的原因還是探針與靶DNA 之間確實無同源序列難以說清。而在不同的靶DNA上都可以產(chǎn)生雜交信號后，則需要對比 這些實驗的熒光信號強弱，其受到的影響因素會更多，如分別制片間的質(zhì)量，處理時間及程 度差異、分別配置雜交液組分差異、分別變性靶染色體時間及變性程度差異、分別雜交時間 及溫度差異、分別洗脫強度差異、圖像分別采集時曝光程度的差異等等，因此需要創(chuàng)造外界 環(huán)境相對一致的條件，才能確保得到的實驗結(jié)果具有真實性，并且有助于陰性實驗結(jié)論的 得出。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問題提出并完成了本發(fā)明。本發(fā)明主要針對上述FISH試驗中出現(xiàn)的問題，設計了一種同一制片下多靶標的FISH技術(shù)方法，旨在能夠更 準確反映目的FISH探針(一個或多個代表著某一 DNA序列)與兩種或多種靶染色體(即 兩種或多種材料)進行比較熒光原位雜交時的雜交結(jié)果。本發(fā)明的目的是提出一種棉花一片多靶標的FISH方法。根據(jù)本發(fā)明的棉花一片多靶標的FISH方法包括以下步驟1)將不同棉種染色體樣品放在同一載玻片上進行混合制片，2)用同一次探針同時進行熒光原位雜交，在熒光原位雜交結(jié)果圖像采集的過程中 選擇同一視野下的不同棉種染色體分裂相進行拍照。根據(jù)本發(fā)明的方法，可以通過染色體數(shù)目差異、或特征染色體或其片段(如隨體 大小、有無等)或通過引入識別探針區(qū)分FISH結(jié)果中供比較的靶染色體。當滿足了對供比 較的靶染色體的識別后，在制片過程中，將分別酶解好的不同棉種(兩種及兩種以上)染色 體樣品(來源于根尖或花粉母細胞)等比例或不等比例放在同一載玻片上進行混合制片， 完成同一制片多靶標的制備，儲存?zhèn)溆?。在完成熒光原位雜交的雜交、洗脫步驟后，圖像采 集時，選擇同一視野下兩個或多個棉種染色體分裂相，進行熒光拍照，確保曝光度一致。具體地，根據(jù)本發(fā)明的方法，識別供比較的材料的FISH圖像時，可以借助于被比 較品種的已知特性區(qū)分供試材料的染色體，例如，通過單個細胞里的染色體數(shù)目比較，如二 倍體棉種分裂相中染色體數(shù)為26條，而四倍體棉種分裂相為52條；或者通過比較特征染色 體或其片段，如黃褐棉有兩個特別大的隨體、亞洲棉與克勞茨基棉的隨體數(shù)量不同、草棉與 亞洲棉的隨體所在染色體臂位不同等等；或者通過識別引入的識別探針，如利用RNA位點、 大小不同，通過加入RNA探針(45S或5SRNA探針)來區(qū)分不同棉種，二倍體D組棉種雷蒙 德氏棉和瑟伯氏棉的45S位點分別為3對、4對、E組的灰白棉5S位點為2對而其他二倍體 均為1對；四倍體棉種黃褐棉與其他四倍體棉種染色體數(shù)目相同但有一個非常明顯的大隨 體，可以用45SRNA探針來區(qū)分開黃褐棉與其他四倍體棉種。在區(qū)分開不同棉種后，就能順 利的比較其他顏色標記的目的探針信號了。根據(jù)本發(fā)明的方法，在制備同一制片的多靶標時，其具體操作可以為將不同棉 種分別發(fā)根后，待主根長至3cm左右去掉根尖1cm，重新栽入培養(yǎng)盤，讓材料生長側(cè)根， 待側(cè)根長至3-5cm(2-3天)，分別集中收集3-5cm的側(cè)根，取根尖(0. 5mm)，于放線菌酮 (25ppm) 20°C預處理(破環(huán)紡錘絲，使前期染色體提前濃縮，形成分散的中期染色體)，春、 秋天預處理2h，夏天1.5h，冬天2h。預處理結(jié)束后，用蒸餾水洗lOmin，固定液(95%乙醇 冰乙酸3 1)固定2-24h。然后，水洗10min，2%纖維素酶(Cellulase R-10)和果膠 酶(Pectinase Y-23)混合液37°C分別處理45min (分解細胞壁，釋放細胞核)，選擇酶解好 的不同棉種(兩種及兩種以上)染色體樣品(來源于根尖或花粉母細胞)放于同一張載玻 片上混合制片，45%或60%乙酸(軟化細胞)壓片，然后鏡檢，選擇分裂相較好且多的制片 保留。-20°C預冷，-70°C揭蓋片，80°C迅速烤干(防止染色體變形)，-20°C保存?zhèn)溆?。根?jù)本發(fā)明的方法保證了不同棉種靶染色體的雜交流程中外環(huán)境(雜交或洗脫 的溫度、濕度、時間、溶液中各離子含量等)及人為操作步驟等等的一致性，避免了分別進 行熒光原位雜交時，由于人為操作或外界條件所造成的實驗誤差，因此，該方法獲得的FISH實驗結(jié)果相對更具有真實性。


圖1供比較靶材料二倍體雷蒙德氏棉(26條染色體)和四倍體海島棉(52條染色 體)的有絲分裂中期染色體，428K20序列探針為目的探針(綠色信號)。圖2供比較靶材料二倍體雷蒙德氏棉(26條染色體)和四倍體海島棉(52條染色 體)的有絲分裂中期染色體，428K20序列探針為目的探針(綠色信號)、150D24序列探針為 另一目的探針(紅色信號)。圖3供比較靶材料四倍體黃褐棉(52條染色體)和四倍體達爾文棉(52條染色 體)的有絲分裂中期染色體，45S序列探針為識別探針(綠色信號)、二倍體D組瑟伯氏棉 基因組為目的探針。圖4供比較靶材料四倍體黃褐棉(52條染色體)和四倍體達爾文棉(52條染色 體)的有絲分裂中期染色體，45S序列探針為識別探針(綠色信號)、二倍體D組戴維遜氏 棉基因組為目的探針(紅色信號)。
具體實施例方式實施例1棉花一片多靶標的FISH實驗實驗材料二倍體棉種雷蒙德氏棉、瑟伯氏棉、戴維遜氏棉和四倍體棉種海島棉、 黃褐棉、達爾文棉均來自于中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所。實驗試劑纖維素酶Onazuka R-IO和果膠酶Pectolyase Y-23均購自Solarbio ； 探針標記試劑盒Bio-Nick Translation Mix和DIG-Nick Translation Mix均購自于Roche 公司。1、棉花基因組DNA提取60°C預熱核裂解緩沖液(實驗前現(xiàn)加2% β -巰基乙醇ν/ν)取約2g左右幼葉， 立即放入冰凍過的研缽，在研缽中加液氮迅速研磨成粉末?？焖傺b入7mL離心管中，加入在 60°C水浴中預熱過的提取緩沖液約3mL，搖勻。60°C水浴40min，每IOmin搖一次。取出離 心管，加入等體積氯仿異戊醇(24 1，V/V)抽提液，蓋上蓋子后，緩慢顛倒離心管30-50 次。平衡離心管后，13000rpm，4°C離心lOmin。吸取上清，轉(zhuǎn)入新的7mL離心管，重復抽提一 次。重取上清，轉(zhuǎn)入新的7mL離心管，加入0. 6倍體積的冰冷異丙醇，緩慢顛倒離心管直至有 絮狀沉淀析出。鉤出沉淀，轉(zhuǎn)入滅菌的1. 5ml離心管，用70%的乙醇洗2-3次，無水乙醇洗 2次，盡可能倒干凈乙醇，風干。加400111^^651的水浴中溶解201^11或過夜。加入20 50yg/mL(終濃度)的RNaSeA，65°C水浴lh。加等體積氯仿異戊醇(體積比為24 1， V/V)抽提液，緩慢顛倒離心管30 50次，平衡離心管后，12000rpm, 4°C離心lOmin。吸取上 清，加入2倍體積的冰冷無水乙醇和1/10體積的乙酸鈉(0. 3mol/L、pH5. 2)，靜置5min后， 緩慢水平轉(zhuǎn)動離心管5min，慢慢形成一團粘稠的透明的含有許多氣泡的絮狀沉淀。鉤出沉 淀，轉(zhuǎn)到新的1. 5mL的印pendoff管中(或12000rpm，4°C離心lOmin，棄上清)，用70%的酒 精洗2-3次。無水乙醇洗2次，盡可能倒干凈乙醇，風干，用300 μ LTE或ddH20溶解，-20°C 保存。2、體細胞染色體制片
分別取供不同棉種的種子在約60°C的溫水中浸種過夜，播種于經(jīng)煮沸消毒的潮濕 細沙中，置30°C萌發(fā)。待主根長至3cm左右去掉根尖1cm，重新栽入培養(yǎng)盤，讓材料生長側(cè) 根，待側(cè)根長至3-5cm(2-3天)，分別集中收集3-5cm的側(cè)根，取根尖(0. 5mm)，于放線菌酮 (25ppm) 20°C預處理(破環(huán)紡錘絲，使前期染色體提前濃縮，形成分散的中期染色體)，春、 秋天預處理2h，夏天1.5h，冬天2h。預處理結(jié)束后，用蒸餾水洗lOmin，固定液(95%乙醇 冰乙酸3 1)固定2-24h。然后，水洗10min，2%纖維素酶(Cellulase R-10)和果膠 酶(Pectinase Y-23)混合液37°C分別處理45min (分解細胞壁，釋放細胞核)，選擇酶解好 的不同棉種(兩種及兩種以上)染色體樣品(來源于根尖或花粉母細胞)放于同一張載玻 片上混合制片，45%或60%乙酸(軟化細胞)壓片。鏡檢，選擇分裂相較好且多的制片保 留。-20°C預冷，-70°C揭蓋片，80°C迅速烤干(防止染色體變形)。4°C保存?zhèn)溆谩?、探針的標記探針的標記采用Bio-Nick Translation Mix 或 DIG-Nick Translation Mix 標記 系統(tǒng)，其流程按照Roche公司的試劑說明書進行(1)取 1 μ g 探針加 CldH2O 中至 16 μ L ；(2)力口入4yL· Bio-Nick Translation Mix/DIG-Nick Translation Mix，混合，短 暫離心；(3)在 15°C溫浴 9Omin ；(4)在體系中加入IyL 0. 5M的EDTA，于65°C溫浴lOmin，以滅活體系中的酶活性。4、雜交制片在60°C烘箱中干燥過夜，用100μ g/mL的RNase A(2XSSC配制)加塑膜蓋 片，包裝于37°C，1小時，2XSSC漂去塑膜蓋片，2XSSC，3-5min洗滌。用0. 1% Pepsin(10M HCI 配制)37°C，20-40min。1 XPBS，2_5min。4% 的多聚甲醛 37°C，lOmin。2X SSC，3_5min。 2父55(配制70%去離子甲酰胺溶液，801，21^11。-20°C條件下，75% -95% -100%乙醇脫 水，每級5min。自然風干，備用。制備雜交混合液，取20 μ L雜交液滴于制片上，加塑膜蓋片，包裝于80°C水浴鍋中 共變性lOmin。立即轉(zhuǎn)入37°C水浴中雜交過夜，然后洗脫。用安裝有CXD攝像頭的Zeiss熒光顯微鏡觀察熒光信號，用Zeiss-QFISH成像系 統(tǒng)軟件進行原位雜交圖象的攝取、采集和加工，以及核型分析。雷蒙德氏棉和海島棉是分別具有26和52條染色體的棉種，目前，一般認為二倍 體雷蒙德氏棉為海島棉D(zhuǎn)亞組供體種，428k20序列是從海島棉Pima-90BAC文庫中篩選到 的一重復序列，將其作為目的探針以同一制片的雷蒙德氏棉和海島棉為靶DNA，雜交信號如 圖I-A所示染色體數(shù)目較少的分裂相沒有雜交信號，可以判斷其是雷蒙德氏棉，而數(shù)目較 多的分裂相圖I-B即是海島棉，在較大的一半染色體(A亞組染色體)上幾乎都有雜交信號 (綠色)，而在較小的一半染色體(D亞組染色體)靠近著絲粒區(qū)域有信號(綠色)。由此可 以證實428k20序列雖然在四倍體海島棉較小的染色體上(D亞組)有雜交信號，但并非是 來自于其供體種雷蒙德氏棉，很有可能是其較大染色體(A亞組)供體種入侵或通過轉(zhuǎn)座的形式導入較小染色體(D亞組)中的。實施例2
將實施例1中使用的制片以428k20序列和150D24序列為雙目的探針雜交，得到的雜交結(jié)果如圖2所示150D24序列的紅色信號出現(xiàn)在雷蒙德氏棉所有染色體(圖2-B)及 海島棉較小染色體(D亞組)的著絲粒區(qū)域，由于與428k20序列在海島棉較小染色體(D亞 組)的著絲粒區(qū)域產(chǎn)生的綠色信號重疊，所以海島棉較小染色體(D亞組)的著絲粒區(qū)域看 到的是黃色的合成信號(圖2-A)，由此也可以證實150D24序列是來自于其供體種雷蒙德氏 棉，但與428k20序列不一致。實施例3黃褐棉和達爾文棉同為四倍體棉種，其染色體均為52條，加入了識別探針45S，黃 褐棉的45S rDNA位點有3對，其中一對非常大幾乎包含了整條染色體的短臂，而另兩對非 常?。贿_爾文棉的3對45S rDNA位點基本一致。而目的探針分別為二倍體D組瑟伯氏棉基 因組和戴維遜氏棉基因組，用鮭魚精DNA做封阻，通過雜交信號的強弱來比較黃褐棉和達 爾文棉分別含有瑟伯氏棉gDNA和戴維遜氏棉gDNA的比例多少。同一制片的黃褐棉和達爾文棉有絲分裂中期染色體以瑟伯氏棉gDNA為探針，其 雜交結(jié)果如圖3所示從識別探針45S信號(綠色)來看，圖3-A分裂相為黃褐棉，其紅色 的瑟伯氏棉gDNA信號要比圖3-B分裂相的紅色信號強，由此可以證實瑟伯氏棉基因組在四 倍體黃褐棉基因組中分布更多。同一制片的黃褐棉和達爾文棉有絲分裂中期染色體以戴維遜氏棉gDNA為探針， 其雜交結(jié)果如圖4所示從識別探針45S信號(綠)來看，圖4-A分裂相為黃褐棉，其紅色 的瑟伯氏棉gDNA信號要比圖4-B分裂相的紅色信號弱，由此可以證實戴維遜氏棉基因組在 四倍體達爾文棉基因組中分布更多。
權(quán)利要求
棉花一片多靶標的FISH方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)將不同棉種染色體樣品放在同一載玻片上進行混合制片；2)用同一次探針同時進行熒光原位雜交，在熒光原位雜交結(jié)果圖像采集的過程中選擇同一視野下的不同棉種染色體分裂相進行拍照。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花一片多靶標的FISH方法，其特征在于，所取染色體樣品 來源于根尖或花粉母細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的棉花一片多靶標的FISH方法，其特征在于，用于混合制片的 各染色體樣品等比例或不等比例混合。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子細胞遺傳學領域，具體地，本發(fā)明涉及棉花一片多靶標的FISH方法。根據(jù)本發(fā)明的棉花一片多靶標的FISH方法包括1)將不同棉種染色體樣品放在同一載玻片上進行混合制片；2)用同一次探針同時進行熒光原位雜交，在熒光原位雜交結(jié)果圖像采集的過程中選擇同一視野下的不同棉種染色體分裂相進行拍照。根據(jù)本發(fā)明的方法保證了不同棉種靶染色體的雜交流程中外環(huán)境(雜交或洗脫的溫度、濕度、時間、溶液中各離子含量等)及人為操作步驟等等的一致性，避免了分別進行熒光原位雜交時，由于人為操作或外界條件所造成的實驗誤差，因此，該方法獲得的FISH實驗結(jié)果相對更具有真實性。
文檔編號C12Q1/68GK101818206SQ20101017538
公開日2010年9月1日 申請日期2010年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者劉方, 張香娣, 楊曉芳, 王坤波, 王春英, 王玉紅, 黎紹惠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所