專(zhuān)利名稱(chēng)：多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，應(yīng)用于生物科學(xué)研究和臨床分子診斷，具體地，是涉及 到一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
基因拷貝數(shù)是指單個(gè)細(xì)胞或單個(gè)基因組內(nèi)所含目標(biāo)基因片段的數(shù)目。基因拷貝 數(shù)的變化如缺失或重復(fù)可能會(huì)改變目標(biāo)基因的正常功能從而導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生或相關(guān)表 型的變化，因此基因拷貝數(shù)的快速而準(zhǔn)確的檢測(cè)將有助于相關(guān)基因的科學(xué)研究。具體檢測(cè) 方法可以分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是全基因組水平上的基因拷貝數(shù)變化區(qū)域篩選，另一類(lèi)是對(duì)目 標(biāo)區(qū)域進(jìn)行拷貝數(shù)測(cè)定。前者包括細(xì)胞核型分析、比較基因組雜交以及全基因組SNP芯片 雜交技術(shù)等(Jacobs et al. , 1978; Solinas-Toldo et al. , 1997; Barrett et al., 2004; Zhao et al. , 2004)，這些技術(shù)主要用于發(fā)現(xiàn)新變異區(qū)域，但普遍存在檢測(cè)分辨率、 準(zhǔn)確性偏低、檢測(cè)周期長(zhǎng)以及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)，而后者主要針對(duì)有限目標(biāo)區(qū)段的檢測(cè)，包 括實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)(Bieche et al.，1998)、多重可擴(kuò)增探針雜交(MAPH) (Armour et al, 2000)、短熒光片斷定量多重PCR (QMPSF) (Charbonnier et al.，2000)、多重連接依賴(lài)探 針擴(kuò)增(MLPA) (Schouten et al.，2002)以及 MassArray 絕對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)(Sequenom Inc., San Diego, CA)。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)主要是基于在PCR指數(shù)擴(kuò)增期，其擴(kuò)增產(chǎn)物的量與原始模板量 成指數(shù)關(guān)系的原理發(fā)展而來(lái)的。如果固定PCR指數(shù)擴(kuò)增期產(chǎn)物的量，那么原始模板量(NO) 對(duì)數(shù)值與PCR循環(huán)數(shù)(Ct)成線性關(guān)系。利用該技術(shù)進(jìn)行目標(biāo)基因拷貝數(shù)檢測(cè)時(shí)，需要選取 至少一個(gè)在所有待檢樣品中拷貝數(shù)保持穩(wěn)定的參照基因(通常每個(gè)基因組僅含一個(gè)拷貝) 以及目標(biāo)基因/參照基因分子數(shù)量已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行梯度稀釋后與待檢 樣品一起進(jìn)行目標(biāo)基因/參照基因的實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，收集與PCR產(chǎn)物量成正相關(guān)的熒 光信號(hào)，分析每個(gè)反應(yīng)在指數(shù)擴(kuò)增期某一固定熒光值對(duì)應(yīng)的Ct值，利用標(biāo)準(zhǔn)樣品基因分子 數(shù)對(duì)數(shù)值與Ct值的線性關(guān)系曲線獲取待檢樣品的目標(biāo)基因以及參照基因的絕對(duì)分子數(shù)， 在參照基因拷貝數(shù)已知情況下，將目標(biāo)基因絕對(duì)分子數(shù)除以參照基因的絕對(duì)分子數(shù)即可估 計(jì)出目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。這種技術(shù)由于其操作簡(jiǎn)單以及反應(yīng)體系易優(yōu)化而獲得廣泛應(yīng)用， 但由于目標(biāo)基因與參照基因在不同體系中進(jìn)行反應(yīng)，最后結(jié)果的方差較大，不適合高拷貝 數(shù)的區(qū)分如5個(gè)與6個(gè)拷貝之間，而且通常情況下每個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一個(gè)基因，因此檢測(cè)通 量較小。短熒光片斷定量多重PCR (QMPSF)是一個(gè)多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)一個(gè)多 重?zé)晒釶CR反應(yīng)同時(shí)擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的多個(gè)目標(biāo)基因和參照基因片斷，然后利用毛細(xì)管電泳 分析各個(gè)片斷的擴(kuò)增量。每個(gè)目標(biāo)基因的擴(kuò)增量先用參照基因擴(kuò)增量進(jìn)行校正，然后通過(guò) 比較待檢樣品與已知各個(gè)基因拷貝數(shù)的對(duì)照樣品在這些校正值上的差異即可估計(jì)出待檢樣品每個(gè)目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。該方法操作簡(jiǎn)單快速而且能夠?qū)崿F(xiàn)多重基因檢測(cè)從而大大提 高檢測(cè)通量并有效降低檢測(cè)成本，但是由于不同基因片斷擴(kuò)增采用的是不同擴(kuò)增引物而且 不同PCR片斷的堿基組成和分子結(jié)構(gòu)不盡相同，因此不同基因片斷的擴(kuò)增效率會(huì)隨著模板 量、模板質(zhì)量以及PCR擴(kuò)增微環(huán)境的不同發(fā)生非同步變化，而且PCR平臺(tái)效應(yīng)可能會(huì)減弱不 同拷貝數(shù)的基因片斷間差異，這樣最后的檢測(cè)值的準(zhǔn)確性會(huì)大大下降，同樣該方法由于方 差偏大不利于高拷貝數(shù)的準(zhǔn)確確定。多重可擴(kuò)增探針雜交(MAPH)也是一種能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多基因拷貝數(shù)檢測(cè)的技術(shù)，其主 要原理是將一批含共同擴(kuò)增引物序列但長(zhǎng)度不同的對(duì)應(yīng)不同基因片段的過(guò)量探針與固定 在尼龍膜上的樣本DNA進(jìn)行雜交，雜交后將未結(jié)合上的探針洗脫，然后分離出結(jié)合探針，以 這些結(jié)合探針為模板用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分離和熒 光信號(hào)收集，比較參照樣本以及檢測(cè)樣本的擴(kuò)增譜形可以確定缺失或重復(fù)的基因位點(diǎn)。這 種方法由于采用了通用引物，不同片段間的擴(kuò)增一致性較QMPSF大為提高，但該操作過(guò)程 時(shí)間長(zhǎng)，體系復(fù)雜不利于高通量運(yùn)行，而且不同探針的結(jié)合效率會(huì)因?yàn)殡s交條件的改變發(fā) 生非同步改變或者不同基因片斷的擴(kuò)增效率也會(huì)隨PCR擴(kuò)增微環(huán)境的不同發(fā)生非同步變 化，PCR平臺(tái)效應(yīng)也可能會(huì)減弱不同拷貝數(shù)的基因片斷間差異，從而導(dǎo)致檢測(cè)方差偏大，準(zhǔn) 確度下降，而且也不利于高拷貝數(shù)的準(zhǔn)確確定。多重連接依賴(lài)探針擴(kuò)增(MLPA)是目前使用較為廣泛的一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè) 技術(shù)，是MRC-Holland公司產(chǎn)品的主要技術(shù)基礎(chǔ)。該技術(shù)的操作過(guò)程如下針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)設(shè) 計(jì)兩個(gè)探針，一個(gè)是上游探針，另一個(gè)是下游探針(其5’端須磷酸化)，這對(duì)探針可雜交到目 標(biāo)序列緊鄰位置上，所有位點(diǎn)的上游探針5’端和下游探針3’端分別含一段共同序列，這對(duì) 共同序列使得隨后連接產(chǎn)物可以用通用引物擴(kuò)增；對(duì)應(yīng)多個(gè)目標(biāo)基因的探針對(duì)與變性后的 樣本DNA的目標(biāo)序列進(jìn)行雜交；緊鄰配對(duì)的上下游探針對(duì)被連接酶連接；連接產(chǎn)物被作為 模板用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物用毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分離和熒光信號(hào)收集，比 較參照樣本以及檢測(cè)樣本的擴(kuò)增譜形可以確定缺失或重復(fù)的基因位點(diǎn)。MLPA與MAPH都能 實(shí)現(xiàn)同時(shí)分析幾十位點(diǎn)的能力，而且都采用了通用引物擴(kuò)增，不同片段間的擴(kuò)增一致性較 QMPSF大為提高，但操作上MLPA較MAPH簡(jiǎn)單。雖然MLPA技術(shù)是目前較為穩(wěn)定而且被廣泛 使用的商業(yè)化技術(shù)，但其整個(gè)過(guò)程完成仍然需要2個(gè)工作日，而且不同探針的雜交連接效 率會(huì)因?yàn)殡s交連接條件以及樣本DNA質(zhì)量差異發(fā)生非同步改變或者不同基因片斷的擴(kuò)增 效率也會(huì)隨PCR擴(kuò)增微環(huán)境的不同發(fā)生波動(dòng)，PCR平臺(tái)效應(yīng)也可能會(huì)減弱不同拷貝數(shù)的基 因片斷間差異，從而導(dǎo)致檢測(cè)方差偏大，準(zhǔn)確度下降，而且也不利于高拷貝數(shù)的準(zhǔn)確確定。MassArray絕對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)是美國(guó)kquenom公司基于Massarray SNP分型平 臺(tái)，綜合多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR，單堿基延伸SNP分型以及端片段質(zhì)譜分離技術(shù)開(kāi)發(fā)而成的。競(jìng)爭(zhēng) 性PCR最早是由Wang等人于1989發(fā)明用于目標(biāo)基因表達(dá)量的確定，其基本原理是人工合 成一段RNA序列，其兩側(cè)序列分別與目標(biāo)基因序列相同，但中間序列與目標(biāo)基因存在長(zhǎng)度 上的差異，然后將梯度稀釋的該RNA序列作為內(nèi)對(duì)照分別與等量樣本mRNA混合用共同引物 反轉(zhuǎn)錄后用共同引物同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因mRNA和內(nèi)對(duì)照RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；兩種擴(kuò)增產(chǎn)物由于 在長(zhǎng)度上存在差異所以可以用瓊脂糖電泳分開(kāi)，由于PCR引物相同，目標(biāo)基因片段以及對(duì) 照基因片段的擴(kuò)增效率類(lèi)似，因此兩種擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)應(yīng)電泳條帶的亮度比可以真實(shí)反映摻入 內(nèi)對(duì)照RNA與目標(biāo)基因mRNA的量比，這樣根據(jù)電泳條帶的亮度比以及內(nèi)對(duì)照RNA的摻入量可以很好的估計(jì)目標(biāo)基因mRNA的量。隨后，該技術(shù)經(jīng)改進(jìn)后被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)樣本中目標(biāo) 病原微生物的定量(Hobson et al. , 1997; Li and Drake, 2001)。MassArray 絕對(duì)拷貝數(shù) 檢測(cè)基本流程如下合成一段與參照/目標(biāo)基因僅有一個(gè)堿基差異的內(nèi)對(duì)照DNA，然后將各 個(gè)內(nèi)對(duì)照DNA —起與樣本DNA混合在一起；通過(guò)多重PCR反應(yīng)將多個(gè)參照/目標(biāo)基因片段 以及對(duì)應(yīng)的內(nèi)對(duì)照DNA片段一起擴(kuò)增；將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化；利用緊挨樣本參照/目 標(biāo)基因DNA與內(nèi)對(duì)照DNA差異位點(diǎn)處的延伸引物以多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板在僅含ddNTP 體系中進(jìn)行單堿基延伸；延伸產(chǎn)物純化后用質(zhì)譜分離；分析每個(gè)位點(diǎn)樣本峰與內(nèi)對(duì)照峰的 比例，目標(biāo)基因比值除以參照基因比值進(jìn)行校正，其校正值通過(guò)除以參照樣本的校正值后 乘以參照樣本目標(biāo)基因拷貝數(shù)后即得檢測(cè)樣本目標(biāo)基因的拷貝數(shù)。該技術(shù)由于采用了內(nèi)對(duì) 照競(jìng)爭(zhēng)性PCR技術(shù)，降低了片段擴(kuò)增效率差異以及實(shí)驗(yàn)操作和檢測(cè)環(huán)境/儀器等外界環(huán)境 的影響，從而降低了檢測(cè)結(jié)果方差，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，對(duì)高拷貝數(shù)多態(tài)也會(huì)有很好 的區(qū)分。但該技術(shù)由于采用質(zhì)譜平臺(tái)，延伸產(chǎn)物質(zhì)譜峰普遍比較低，如果不能很好控制背 景噪音以及樣本/內(nèi)對(duì)照DNA量比，結(jié)果的準(zhǔn)確性會(huì)大大下降，而且整個(gè)過(guò)程設(shè)計(jì)多次PCR 以及純化過(guò)程，實(shí)驗(yàn)操作有待進(jìn)一步簡(jiǎn)化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑 盒，該試劑盒可以對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)。
實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下
一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，主要包括有
(A)針對(duì)待測(cè)的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的多重PCR引物，每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo)記；
(B)定量的針對(duì)不同待測(cè)的目標(biāo)基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段，該內(nèi)對(duì)照DNA片段與(A)中對(duì) 應(yīng)的多重PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物高度一致，為對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列缺失或插入少數(shù)1-50個(gè)堿 基的序列；
(C)至少一對(duì)參照基因的多重PCR引物，每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo)記；
(D)定量的參照基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段，該內(nèi)對(duì)照DNA片段與(C)中對(duì)應(yīng)的參照基因高 度一致，為參照基因的序列缺失或插入少數(shù)1-50個(gè)堿基的序列；
上述同種熒光標(biāo)記的多重PCR引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度有差異，以至于擴(kuò)增產(chǎn)物在毛 細(xì)管電泳分析中任意兩個(gè)產(chǎn)物條帶不重疊。本發(fā)明的另一目的是提供一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，該方法是基于競(jìng)爭(zhēng)性 PCR原理并結(jié)合多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增以及毛細(xì)管電泳長(zhǎng)度差異片段分離技術(shù)對(duì)參照基因和多 個(gè)目標(biāo)基因同時(shí)進(jìn)行定量，并利用參照基因?qū)z測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正后獲取多個(gè)目標(biāo)基因的正 確拷貝數(shù)，
一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，主要包括以下步驟
(1)針對(duì)待測(cè)的目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的多重PCR引物，每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo) 記；設(shè)計(jì)至少一對(duì)參照基因的多重PCR引物；每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo)記；上述同種熒 光標(biāo)記的多重PCR引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度有差異；
(2)設(shè)計(jì)針對(duì)不同待測(cè)的目標(biāo)基因和參照基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段，所述內(nèi)對(duì)照DNA片段 與(1)中對(duì)應(yīng)的多重PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物高度一致，為對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列缺失或插入少數(shù)1-50個(gè)堿基的序列；
(3)對(duì)所有內(nèi)對(duì)照DNA片段嚴(yán)格定量；
(4)將每種內(nèi)對(duì)照DNA片段等量混合，與所述多重PCR引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多重?zé)晒?PCR擴(kuò)增；
(5)擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性毛細(xì)管電泳將不同長(zhǎng)度的片段分開(kāi)，得到每個(gè)條帶的位置信息 以及熒光強(qiáng)度。優(yōu)選的，步驟(5)之后還包括以下步驟計(jì)算每個(gè)基因位點(diǎn)的樣本條帶/內(nèi)對(duì)照 DNA條帶的熒光峰高或面積比，然后將目標(biāo)基因的該比值除以參照基因的該比值再乘以參 照基因的拷貝數(shù)即得目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝數(shù)。如果存在目標(biāo)基因拷貝數(shù)已知的參照樣本，可以將待測(cè)樣本目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝 數(shù)除以參照樣本對(duì)應(yīng)目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝數(shù)再乘以參照樣本該目標(biāo)基因拷貝數(shù)即得待測(cè) 樣本該目標(biāo)基因的精確拷貝數(shù)。本技術(shù)發(fā)明是在認(rèn)真總結(jié)現(xiàn)有技術(shù)中各種多重檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)的基礎(chǔ)上再經(jīng) 過(guò)自主創(chuàng)新后開(kāi)發(fā)成功的，它綜合了 QMPSF —步PCR —步檢測(cè)的簡(jiǎn)單快速以及MassArray 絕對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)中多重競(jìng)爭(zhēng)性PCR的高精度，是一種簡(jiǎn)單快速、高通量、高精確的先進(jìn) 基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù)，在對(duì)疾病致病基因研究等領(lǐng)域?qū)?huì)有廣泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，主要具有以下優(yōu)點(diǎn)
1、快速檢測(cè)在獲得內(nèi)對(duì)照DNA后，只要將樣本DNA與內(nèi)對(duì)照DNA混勻后進(jìn)行多重 PCR，然后將PCR產(chǎn)物直接上毛細(xì)管熒光電泳儀(如ABI測(cè)序儀)即可，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程僅需要 一步PCR循環(huán)和一步毛細(xì)管電泳，耗時(shí)不到4個(gè)小時(shí)；
2、多個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)由于采用了多重PCR體系，一個(gè)反應(yīng)通?？梢酝瑫r(shí)擴(kuò)增12 個(gè)位點(diǎn)以上，也就意味著如果選用2個(gè)參照基因，那么一個(gè)反應(yīng)可以同時(shí)檢測(cè)10個(gè)以上目 標(biāo)基因位點(diǎn)；
3、高精確性由于目標(biāo)基因片段與其內(nèi)對(duì)照DNA之間僅有少數(shù)幾個(gè)堿基差別，這兩個(gè) 模板的擴(kuò)增效率將體現(xiàn)高度一致性，因此最后的擴(kuò)增產(chǎn)物真實(shí)的反應(yīng)了擴(kuò)增前兩個(gè)模板濃 度比例，根據(jù)我們預(yù)測(cè)試結(jié)果，一個(gè)競(jìng)爭(zhēng)性PCR反應(yīng)重復(fù)3次的標(biāo)準(zhǔn)方差在5%之內(nèi)，而且如 果將目標(biāo)基因片段與內(nèi)對(duì)照DNA按不同稀釋梯度混合進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性PCR，我們發(fā)現(xiàn)樣本峰與 內(nèi)對(duì)照峰面積之比與兩個(gè)模板的原始濃度比的相關(guān)性達(dá)到99. 9%以上。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。圖1是本發(fā)明所述檢測(cè)方法的原理示意圖； 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中樣品1檢測(cè)結(jié)果示意圖； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中樣品2檢測(cè)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，參見(jiàn)圖1，主要包括以下步驟
1)針對(duì)多個(gè)目標(biāo)基因以及參照基因進(jìn)行多重PCR引物設(shè)計(jì)，每對(duì)引物中一條將標(biāo)上熒 光引物，同種熒光引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度必須有差別；2)針對(duì)每個(gè)基因的擴(kuò)增片段，合成或克隆獲得與對(duì)應(yīng)引物擴(kuò)增產(chǎn)物序列對(duì)比缺失或插 入1-50個(gè)堿基的DNA片段作為內(nèi)對(duì)照DNA，并進(jìn)行精確定量；在圖1中，內(nèi)對(duì)照DNA相對(duì)于 樣本DNA片段缺2個(gè)堿基；
3)將適量樣本DNA與適量?jī)?nèi)對(duì)照DNA混勻，混入的每種內(nèi)對(duì)照DNA的分子數(shù)量相等并 估計(jì)與樣本DNA中參照基因的分子數(shù)量一致；
4)對(duì)樣本/內(nèi)對(duì)照DNA混合物進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增；
5)擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性毛細(xì)管電泳將不同長(zhǎng)度的片段分開(kāi)，收集每個(gè)條帶的位置信息 以及熒光強(qiáng)度；這一步通常在測(cè)序儀上完成如美國(guó)應(yīng)用生物公司的測(cè)序儀ABI3130以及 ABI3730 等；
6)由于不同基因的擴(kuò)增產(chǎn)物在長(zhǎng)度以及熒光標(biāo)記上不同，而且同一基因位點(diǎn)上樣本 DNA以及內(nèi)對(duì)照DNA擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度也不同(附圖中為2bp差異)，因此根據(jù)毛細(xì)管電泳峰形圖 可以明確每個(gè)基因位點(diǎn)上樣本DNA以及對(duì)照DNA各自擴(kuò)增產(chǎn)物量。由于樣本DNA以及對(duì)照 DNA在每個(gè)基因位點(diǎn)上擴(kuò)增引物一致而且序列上僅有微量差異，因此樣本與內(nèi)對(duì)照DNA的 擴(kuò)增量比可以估計(jì)為反應(yīng)前樣本DNA與內(nèi)對(duì)照DNA的分子數(shù)量比。計(jì)算每個(gè)基因位點(diǎn)的樣 本DNA峰(S峰)與內(nèi)對(duì)照DNA峰(I峰)的峰高或面積比(S/I)。7)將每個(gè)目標(biāo)基因位點(diǎn)的S/I比值分別除以參照基因的S/I比值然后乘以參照基 因的拷貝數(shù)即可獲得目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝數(shù)(附圖中參照基因拷貝數(shù)為2)。8)如果存在目標(biāo)基因拷貝數(shù)已知的參照樣本，7)中的結(jié)果可以用參照樣本對(duì)應(yīng)基 因的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的校正，獲取目標(biāo)基因的精確拷貝數(shù)。
實(shí)施例1
利用本發(fā)明所述多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法對(duì)兩個(gè)21三體患者進(jìn)行21號(hào)染色體、X染 色體以及Y染色體的拷貝數(shù)檢測(cè)。一 構(gòu)建多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒 目標(biāo)基因序列及內(nèi)對(duì)照DNA序列信息
選取了 3個(gè)目標(biāo)基因和1個(gè)參照基因做檢測(cè)，參照基因?yàn)楹颂呛怂崦窹亞基(P0P1)， 3個(gè)目標(biāo)基因?yàn)樘剖暇C合癥關(guān)鍵區(qū)鈣調(diào)磷酸1調(diào)控子(RCANl)、Y染色體上性別決定區(qū) (SRY)以及X染色體上高多樣同源框(HDX)。這些基因?qū)?yīng)擴(kuò)增序列的原序列與內(nèi)對(duì)照 DNA序列信息見(jiàn)下面描述(黃色背景藍(lán)色字體處為人參照序列與內(nèi)對(duì)照序列差別處)。內(nèi)對(duì) 照DNA由上海生工進(jìn)行克隆合成。POPl基因(參照基因)
人標(biāo)準(zhǔn)序列，253bp (SEQ ID NO 1)
tgaaatgatgateteatggttgaaatatgtttttcttttattgttttcttttcccttaaatgttctctgtct ttaattttactaTGACtggggaccttccagggccagacattgtgtaagatgctgggatagatgacttagatgtggtc aaagaagtacagggcactcaggaaacctctagaaggggtactgagctcagatgagaaaaatgaggccagcctcctga tggaagagcaggcatttgaactgactc
內(nèi)對(duì)照 DNA 序列，25Ibp (SEQ ID NO 2)
tgaaatgatgatctcatggttgaaatatgtttttcttttattgttttcttttcccttaaatgttctctgtct ttaattttactaTCtggggaccttccagggccagacattgtgtaagatgctgggatagatgacttagatgtggtcaaagaagtacagggcactcaggaaacctctagaaggggtactgagetcagatgagaaaaatgaggccagcctcctgatg gaagagcaggcatttgaactgactc HDX基因(目標(biāo)基因) 人標(biāo)準(zhǔn)序列，(SEQ ID NO 3)
gtaaaaattgctttcagctcatattacagtgtgcacaggagactaagctggacttcagtgtagtcagggtaa gtattgaggtcttacactcaaatttaaagcttcttattacaagtgatatttgcttaatatgagaaaaaatattcagg gtatgaAGTCactaattttataaacagcttcacttccctggtataacaatactattttaaaaataaatagggctaat catttagtatgtatttgtttctataaataccttgaacacacagaaacccttg 內(nèi)對(duì)照 DNA 序列，276bp (SEQ ID NO :4)
gtaaaaattgctttcagctcatattacagtgtgcacaggagactaagctggacttcagtgtagtcagggtaa gtattgaggtcttacactcaaatttaaagcttcttattacaagtgatatttgcttaatatgagaaaaaatattcagg gtatgaACactaattttataaacagcttcacttccctggtataacaatactattttaaaaataaatagggctaatca tttagtatgtatttgtttctataaataccttgaacacacagaaacccttg SRY基因(目標(biāo)基因) 人標(biāo)準(zhǔn)序列，350bp (SEQ ID NO :5)
gcaagtagtcaacgttactgaattaccatgttttgcttgagaatgaatacattgtcagggtactagggggta ggctggttgggcggggttgagggggtgttgagggcggagaaatgcaagtttcattacaaaagttaacgtaacaaaga atctggtagaagtgagttttggatagtaaaataagtttcgaactctggcacctttcaattttgtcgcactctccttg ttttTGACaatgcaatcatatgcttctgctatgttaagcgtattcaacagcgatgattacagtccagctgtgcaaga gaatattcccgctctccggagaagctcttccttcctttgcactgaaa 內(nèi)對(duì)照 DNA 序列，348bp (SEQ ID NO :6)
gcaagtagtcaacgttactgaattaccatgttttgcttgagaatgaatacattgtcagggtactagggggta ggctggttgggcggggttgagggggtgttgagggcggagaaatgcaagtttcattacaaaagttaacgtaacaaaga atctggtagaagtgagttttggatagtaaaataagtttcgaactctggcacctttcaattttgtcgcactctccttg ttttTCaatgcaatcatatgcttctgctatgttaagcgtattcaacagcgatgattacagtccagctgtgcaagaga atattcccgctctccggagaagctcttccttcctttgcactgaaa RCANl基因(目標(biāo)基因) 人標(biāo)準(zhǔn)序列，354bp (SEQ ID NO :7)
gcactggaaaatccaggcagttttaggccattttcacttttcaccctagtgtgagggtgaggcatgcggttt ctcagatttaaattctgaataaaatttccccttaaatgatcttatctccaatatggtatagagtttaatttatttgg gaaggttcagaatgttgtacatttttgaaagctacatgttacatatgtgcgaagtttattttcagttttccactatt tctctaattttagggtttcTGACtctaaaatcagatgtttttcacatccagagctgctttaaatcctcctcaccact ccaccccctaacaactgcttggttcccctctcagctcaatctgctgtcacc
內(nèi)對(duì)照 DNA 序列，352bp (SEQ ID NO :8) gcactggaaaatccaggcagttttaggccattttcac ttttcaccctagtgtgagggtgaggcatgcggtttctcagatttaaattctgaataaaatttccccttaaatgatct tatctccaatatggtatagagtttaatttatttgggaaggttcagaatgttgtacatttttgaaagctacatgttac atatgtgcgaagtttattttcagttttccactatttctctaattttagggtttcTCtctaaaatcagatgtttttca catccagagctgctttaaatcctcctcaccactccaccccctaacaactgcttggttcccctctcagctcaatctgc tgtcacc引物序列其中，[FAM]表示為熒光標(biāo)記。POPlF [FAM]TGAAATGATGATCTCATGGTTGAAA (SEQ ID NO 9) POPlR GAGTCAGTTCAAATGCCTGCTCTT (SEQ ID NO: 10)
HDXF GTAAAAATTGCTTTCAGCTCATATTACAGTG (SEQ ID NO 11) HDXR [FAM]CAAGGGTTTCTGTGTGTTCAAGGTATTT (SEQ ID NO :12) SRYF GCAAGTAGTCAACGTTACTGAATTACCA (SEQ ID NO :13) SRYR [FAM]TTTCAGTGCAAAGGAAGGAAGAGC (SEQ ID NO :14) RCANlF: [FAM]GCACTGGAAAATCCAGGCAGTT (SEQ ID NO :15) RCANlR: GGTGACAGCAGATTGAGCTGAGA (SEQ ID NO :16)
二 檢測(cè)樣本樣本A為臨床核型分析為21三體的男性，樣本B為臨床核型分析為21 三體的女性。三檢測(cè)方法
主要包括以下步驟
(1) 將臨床上已經(jīng)證明是21三體綜合癥的2個(gè)分別為男性和女性樣本的DNA用 Biophotomerter/77w5 (Eppendor)進(jìn)行精確定量，然后稀釋至IOng/ μ 1作為待測(cè)DNA樣本待(2) 配置PCR引物混合液，分別含4對(duì)PCR引物P0P1F/R、HDXF/R、RCAN1F/R和 SRYF/R,每條引物濃度各2 μ M。(3) 內(nèi)對(duì)照DNA用Biophotomerter/^iAs (Eppendor)進(jìn)行多次定量后取平均 值，然后配置4個(gè)內(nèi)對(duì)照DNA混合液，終濃度均為Ing/ μ 1，然后將此混合液再梯度稀釋 200，000 倍(標(biāo)為 iDNA)。
(4) 多重PCR體系(20 μ 1)配置 IOxBuffer (Qiagen) 2μ 1 PCR引物混合液2μ1
MgCl2 (25mM)0. 8 μ 1
dNTP(IOmM)0. 4 μ 1
樣本DNA1 μ 1
iDNA1 μ 1
HotstarTaq (5U/ μ 1, Qiagen) ddH20
PCR程序 95 °C 15min
94 °C20s
64°C -0. 5°C /cycle 40s 72 °C2min
94 °C 20s
0. 2μ 1 12. 6μ 1
χ !!cycles取1μ IPCR產(chǎn)物用ddH20稀釋10倍，然后取1μ 1加入到8·8μ 1的Hi-Di (ABI) 和0.2μ1 1的LIZ500分子內(nèi)標(biāo)(ABI)中，95°C 5min變性后，置于3130XL測(cè)序儀上進(jìn)行 毛細(xì)管電泳。(6) 結(jié)果使用GeneMapperf. 0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，讀取峰高等數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析表

權(quán)利要求
1.一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，其特征是，主要包括有(A)針對(duì)待測(cè)的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的多重PCR引物，每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo)記；(B)定量的針對(duì)不同待測(cè)的目標(biāo)基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段，該內(nèi)對(duì)照DNA片段與(A)中對(duì) 應(yīng)的多重PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物高度一致，為對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列缺失或插入少數(shù)1-50個(gè)堿 基的序列；(C)至少一對(duì)參照基因的多重PCR引物，每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo)記；(D)定量的參照基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段，該內(nèi)對(duì)照DNA片段與(C)中對(duì)應(yīng)的參照基因高 度一致，為參照基因的序列缺失或插入少數(shù)1-50個(gè)堿基的序列；上述同種熒光標(biāo)記的多重PCR引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度有差異，以至于擴(kuò)增產(chǎn)物在毛 細(xì)管電泳分析中任意兩個(gè)產(chǎn)物條帶不重疊。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述缺失或插入的 堿基的個(gè)數(shù)為1一 5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，其特征是，所述缺失或插入的 堿基的個(gè)數(shù)為2個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1一 3任一項(xiàng)所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，其特征是，還包含有 多重PCR反應(yīng)緩沖液及熱穩(wěn)定DNA聚合酶或兩者預(yù)混和液。
5.一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，其特征是，主要包括以下步驟(1)針對(duì)待測(cè)的目標(biāo)基因，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的多重PCR引物，每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo) 記；設(shè)計(jì)至少一對(duì)參照基因的多重PCR引物；每對(duì)引物中的一條具有熒光標(biāo)記；上述同種熒 光標(biāo)記的多重PCR引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度有差異；(2)設(shè)計(jì)針對(duì)不同待測(cè)的目標(biāo)基因和參照基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段，所述內(nèi)對(duì)照DNA片段 與(1)中對(duì)應(yīng)的多重PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物高度一致，為對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列缺失或插入少 數(shù)1-50個(gè)堿基的序列；(3)對(duì)所有內(nèi)對(duì)照DNA片段嚴(yán)格定量；(4)將每種內(nèi)對(duì)照DNA片段等量混合，與所述多重PCR引物對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行多重?zé)晒?PCR擴(kuò)增；(5)擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)變性毛細(xì)管電泳將不同長(zhǎng)度的片段分開(kāi)，得到每個(gè)條帶的位置信息 以及熒光強(qiáng)度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，其特征是，步驟(5)之后還包括以 下步驟計(jì)算每個(gè)基因位點(diǎn)的樣本條帶/內(nèi)對(duì)照DNA條帶的熒光峰高或面積比，然后將目標(biāo) 基因的該比值除以參照基因的該比值再乘以參照基因的拷貝數(shù)即得目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝數(shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，其特征是，所述缺失或插入的堿 基的個(gè)數(shù)為1 一 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法，其特征是，所述缺失或插入的堿 基的個(gè)數(shù)為2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒，主要包括有針對(duì)待測(cè)的目標(biāo)基因設(shè)計(jì)的多重PCR引物；定量的針對(duì)不同待測(cè)的目標(biāo)基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段；至少一對(duì)參照基因的多重PCR引物；定量的參照基因的內(nèi)對(duì)照DNA片段；上述同種熒光標(biāo)記的多重PCR引物對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度有差異，以至于擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳分析中任意兩個(gè)產(chǎn)物條帶不重疊。本發(fā)明還公開(kāi)了一種多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)方法。本發(fā)明多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，不僅能多個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)快速檢測(cè)，而且具有很高的精確性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102086474SQ20101018055
公開(kāi)日2011年6月8日 申請(qǐng)日期2010年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日
發(fā)明者姜正文, 馬瑞曉 申請(qǐng)人:上海天昊生物科技有限公司