專利名稱：亞歷山大藻熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種亞歷山大藻熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，用于海洋 赤潮藻的分子生物學(xué)檢測，屬于微生物分子技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國自1972年以來因赤潮造成的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)10億元以上，有些特大赤潮 一次就能影響到幾千平方公里的海域，造成幾億元的經(jīng)濟(jì)損失。尤其是近年來赤潮頻繁發(fā) 生，給國家造成了巨大損失。因此，赤潮藻的檢測尤為重要，赤潮藻的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢 測，可以起到預(yù)警赤潮爆發(fā)的作用?，F(xiàn)在主要通過形態(tài)學(xué)分類方法、免疫學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)對有毒赤潮藻進(jìn)行檢測。 形態(tài)學(xué)分類方法常常由于樣品中低的生物濃度等困難，限制了人們對赤潮藻的鑒定。免疫 學(xué)方法存在抗原抗體特異性識(shí)別問題和抗原抗體交叉干擾等的缺陷。分子生物學(xué)技術(shù)因其 操作簡便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)彌補(bǔ)了兩種方法的不足。我國沿海赤潮生物有40多個(gè)屬，150余種，除屬于原生動(dòng)物的紅色中縊蟲外均為 浮游植物，其中甲藻70余種。亞歷山大藻是一種可產(chǎn)生麻痹性貝毒素(PSP)的海洋甲藻， 其適應(yīng)能力強(qiáng)、生存范圍廣，是引起赤潮的主要藻。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)Real-time PCR技術(shù)(Real-time FluorescentQuantitative Polymerase Chain Reaction, real-time PCR),是指在 PCR 反 應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對 未知模板進(jìn)行定量分析的方法。Real-time PCR的質(zhì)量保證最為重要的一個(gè)因素就是標(biāo)準(zhǔn) 品的使用。定量結(jié)果的準(zhǔn)確性在很大程度上依賴標(biāo)準(zhǔn)品的準(zhǔn)確性，因此定量標(biāo)準(zhǔn)品的制備 就顯得尤為重要。以往以DNA或PCR產(chǎn)物做標(biāo)準(zhǔn)品都存在不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，容易引起結(jié)果不 準(zhǔn)確現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種亞歷山大藻熒光定量聚合酶鏈 反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，方法簡便，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)品能用于快速、方便的進(jìn)行亞歷山大藻的 real-time PCR檢測，檢測靈敏度高。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明利用基因克隆和real-time PCR技術(shù)，構(gòu)建亞歷山大藻 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)品。通過提取的亞歷山大藻A. catenella ACDHOl的DNA為模板，聚合 酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增A. catenella的18S rDNA到28S rDNA基因片段，并將擴(kuò)增產(chǎn)物和T載體連 接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)確認(rèn)的重組質(zhì)粒梯度稀釋成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)準(zhǔn)品；以5. 8S-b5’和 5. 8S-b3’為引物，以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，real-time聚合酶鏈反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)中的臨界 循環(huán)數(shù)以及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明方法可以應(yīng)用于亞歷山大藻的real-time PCR檢測。本發(fā)明方法具體步驟如下
1.對培養(yǎng)的亞歷山大藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，提取亞歷山大藻A. catenellaA⑶HOl的DNA，并 測定DNA在260nm的吸光值；2.以提取的 Acatenella ACDHOl 的 DNA 為模板，以 18S rDNA 序列 5 ‘ -CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG-3，和 28S rDNA 序列 5 ‘ -GGAGGGACCAGCTACTA-3，為引物，聚合 酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增18S rDNA-28S rDNA區(qū)的片段；擴(kuò)增的1600bp片段與pEASY-Blunt Simple 載體連接成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌Transl-Tl，提取宿主菌Transl-Tl內(nèi)重組質(zhì) 粒，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定及測序分析確認(rèn)；3.檢測經(jīng)確認(rèn)的重組質(zhì)粒260nm吸光值，確定重組質(zhì)粒的原液拷貝濃度，并將重 組質(zhì)粒原液稀釋，得到梯度濃度為107-102COpieS/mL數(shù)量級(jí)的real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；4.以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以5.8S-b5，5 ‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3，禾口5.8S-b3，5 ‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3，為引物，進(jìn)行real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，根據(jù)反應(yīng)中的臨界循環(huán)數(shù)以及重組質(zhì) 粒標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度，制作real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用本發(fā)明方法，可以準(zhǔn)確、高效、快速地構(gòu)建亞歷山大藻real-time PCR的標(biāo)準(zhǔn) 品?？朔藗鹘y(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察方法費(fèi)時(shí)、不準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，以及克服了以DNA或者PCR產(chǎn)物作為 real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。本發(fā)明成功構(gòu)建了包含A. catenella ACDHOl核糖體18S rDNA到28S rDNA基因 片段的重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒作為real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為IO2 IO7 拷貝，閾值循環(huán)數(shù)與起始模板量的對數(shù)值之間有著良好的線性關(guān)系(r = 0. 99),E = 1. 16， 擴(kuò)增效率較好。本發(fā)明適合亞歷山大藻分子生物學(xué)檢測中real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建和亞歷山 大藻的real-time PCR檢測。


圖1為本發(fā)明的方法流程圖。圖2為亞歷山大藻核糖體DNA模式圖。圖 3A. catenelIaACDH 01 的目的基因 PCR 電泳圖。圖4為本發(fā)明中real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。以下實(shí)施例不構(gòu)成對 本發(fā)明的限定。圖1為本發(fā)明方法的流程框圖。如圖1所示，本發(fā)明首先提取亞歷山大藻 A. catenella ACDHOl 的 DNA，以 A. catenella ACDHOl 的 DNA 為模板，以 18SrDNA 序列和 28S rDNA序列為引物，PCR擴(kuò)增18S rDNA_28S rDNA區(qū)的片段，擴(kuò)增的片段與pEASY-Blunt Simple載體連接，重組質(zhì)粒測序后，作為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。利 用此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對待測的亞歷山大藻進(jìn)行real-time PCR檢測。
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本發(fā)明實(shí)施例按以下步驟進(jìn)行1.亞歷山大藻的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)亞歷山大藻A. catenellaA⑶H 01分別接種到f/2 人工海水培養(yǎng)基中，20°C，光照培養(yǎng)14h，黑暗培養(yǎng)10h。培養(yǎng)器皿為經(jīng)高壓滅菌的250mL三 角燒瓶，每個(gè)瓶中加入150mL培養(yǎng)液后，按5 1的比例加入藻液，置于光照箱中靜置培養(yǎng)， 通過傳統(tǒng)的顯微鏡方法進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，吸取0. Im L不同濃度藻液，置于容量為0. Im L、表 面積為20mmX20mm的計(jì)數(shù)框內(nèi)，在顯微鏡下全部計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)3次取其平均值。亞歷山大藻DNA的提取取4mL藻細(xì)胞液離心并加入150 μ L緩沖液 (20mMTris-HCL, ρΗ 7. 5)沖洗 2 次，細(xì)胞沉淀用 Qiagen DNeasy Blood&tissue kit 試劑 盒提取DNA。對提取的DNA進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(DU-650，Beckman)，根據(jù)0D260nm/ 0D280nm值對DNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行評(píng)估。2. A. catenella ACDHOl 的 18S-28S rDNA 基因擴(kuò)增及克隆以 A. catenella ACDHOl 的 18S rDNA 5 ‘-CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG-3，和 28S rDNA 5 ‘-GGAGGGACCAGCTACTA-3，為引物，以 A. catenellaACDHOl 的 DNA 為模板，PCR 擴(kuò) 增18S-28S rDNA目的條帶。亞歷山大藻核糖體DNA模式圖如圖2所示，包括18S rDNA, ITSl (內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，internaltranscribedspacer)，5. 8S rDNA, ITS2 和 28S rDNA。反應(yīng) 體系(25 μ L) :5XPCR buffer，5· 0μ L ;2· 5mMdNTP mixture，2· 5 μ L (各 0· 2mmol/L)；上 游引物，0. 5μ L(0. 5ymol/L)；下游引物 0. 5μ L(0. 5ymol/L)；模板 DNA，2. 0yL(30ng)； Transstart Fastpfu DNA polymerase, 0· 5 μ L ；滅菌雙蒸 7jC, 13. 5 μ L。反應(yīng)條件 95°C 2min ；95°C 20s, 52°C 20s, 72°C 2min，30 循環(huán)；72°C 8min。1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收試劑盒(上海生物工程有限公司)回收并純化 1600bp片段。圖3為常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增A. catenella ACDH01的18SrDNA_28S rDNA 區(qū)1600bp片段。純化產(chǎn)物與載體PEASY-Tl (北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接，并轉(zhuǎn)化 大腸桿菌 Transl-Tl (980(/acZ)AM15A/acX74fct/R(rk"mk+) ArecA1398e t/Alto A)，采用質(zhì)
粒提取試劑盒(北京博邁德科技發(fā)展有限公司)提取白色重組菌落的重組質(zhì)粒，用載體引 物T7/M13進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，并對擴(kuò)增結(jié)果陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序(上海美季生物技術(shù) 有限公司)確認(rèn)。在http://www. ncbi. nlm. nih. rov上采用Blast軟件進(jìn)行序列同源性比 對。3. Real-timePCR 標(biāo)準(zhǔn)品的測定檢測經(jīng)確認(rèn)的重組質(zhì)粒260nm吸光值，確定重組質(zhì)粒的原液拷貝濃度，并將重組 質(zhì)粒原液稀釋，得到梯度濃度為107-102COpieS/mL數(shù)量級(jí)的real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重 組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。4. Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以 5. 8S-b5，5 ‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3，和 5. 8S-b3，5 ‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3，為引物，進(jìn)行 real-time 聚合酶鏈?zhǔn)椒?應(yīng)。冰上配制 real-time PCR 反應(yīng)液SYBR Premix Ex Taq II 10. 0 μ L，上游引物 5.8S-b5，(10. 0μΜ)0. 8μ L,下游引物 5. 8S_b3，(10. 0 μ Μ) 0. 8 μ L, ROX ReferenceDye 0. 4μ L, DNA 模板 6· 0μ L，共 20μ L ；real-time PCR 程序95°C 2min ；95°C 15s，52°C 15s, 72°C 20s,40循環(huán)。每個(gè)樣品3次重復(fù)，根據(jù)反應(yīng)中的臨界循環(huán)數(shù)(Threshold cycle, Ct) 以及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度對數(shù)值，制作real-time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。獲得的real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。本發(fā)明用于亞歷山大藻real-time PCR檢測的實(shí)例四株待測藻(A. catenella, A. affine, A. Iusitanicum 禾口 k. minutum)的 DNA 定量并稀釋后作為模板，以重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，以5. 8S-b5’和5.8S-b3’為引物，進(jìn)行 real-time PCR檢測。能夠檢測到最少的細(xì)胞數(shù)目分別為24 (A. catenella) ,35 (A. affine)、 78 (A. lusitanicum)禾口 105 (A. minutum)個(gè)細(xì)胞。
權(quán)利要求
一種亞歷山大藻熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)對培養(yǎng)的亞歷山大藻細(xì)胞計(jì)數(shù)，提取亞歷山大藻A.catenella ACDH01的DNA，并測定DNA在260nm的吸光值；2)以提取的A.catenella ACDH01的DNA為模板，以18S rDNA序列5‘ CTTAGAGGAAGGAGAAGTCG 3’和28S rDNA序列5‘ GGAGGGACCAGCTACTA 3’為引物，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增18S rDNA 28S rDNA區(qū)的片段；擴(kuò)增的1600bp片段與pEASY Blunt Simple載體連接成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌Trans1 T1，提取宿主菌Trans1 T1內(nèi)重組質(zhì)粒，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定及測序分析確認(rèn)；3)檢測經(jīng)確認(rèn)的重組質(zhì)粒260nm吸光值，確定重組質(zhì)粒的原液拷貝濃度，并將重組質(zhì)粒原液稀釋，得到梯度濃度為107 102copies/mL數(shù)量級(jí)的real time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；4)以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，以5.8S b5’5‘GATGAAGAATGCAGCAAAATG3’和5.8S b3’5‘CAAGCAAACCTTCAAGAATATCC3’為引物，進(jìn)行real time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，根據(jù)反應(yīng)中的臨界循環(huán)數(shù)以及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度對數(shù)值，制作real time聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種亞歷山大藻熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建方法，通過提取A.catenella ACDH01的DNA，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增A.catenella的18SrDNA到28S rDNA基因片段，并將擴(kuò)增產(chǎn)物和T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)確認(rèn)的重組質(zhì)粒梯度稀釋成聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)標(biāo)準(zhǔn)品；以5.8S-b5’和5.8S-b3’為引物，以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，real-time聚合酶鏈反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)中的臨界循環(huán)數(shù)以及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的梯度濃度對數(shù)值制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明建立了帶有A.catenella的18S rDNA-28S rDNA基因片段的重組質(zhì)粒real-time聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，采用一對通用引物，可以準(zhǔn)確、高效、快速地對待測的亞歷山大藻進(jìn)行real-time聚合酶鏈反應(yīng)檢測。
文檔編號(hào)C12R1/89GK101914615SQ201010186100
公開日2010年12月15日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者張風(fēng)麗, 李志勇 申請人:上海交通大學(xué)