專利名稱：結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及新型的結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻 紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
藻膽蛋白(phycobiliprotein)是藍藻和紅藻光合作用捕光復合物的功能組分。根據(jù)其吸收光譜和熒光 光譜特征，藻膽蛋白可以分為藻紅蛋白(phycoerythrin,簡稱CPE)、藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin,簡 稱PEC)、藻藍蛋白(phycocyanin，簡稱CPC)和變藻藍蛋白(allophycocyanin，簡稱APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亞基，每個亞基中藻膽色素(phycobilin)通過硫醚鍵與藻膽蛋白脫輔基蛋白
(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸殘基的巰基共價結(jié)合，其種類及其與脫輔基蛋白的相互作用決定藻膽蛋白 的光譜性質(zhì)。藻膽色素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)象，使得CPE主要吸收約560nm的可見光， 發(fā)射約580nm的熒光；PEC吸收約570nm的可見光，發(fā)射約630nm的熒光；CPC吸收約620nm的可見光， 發(fā)射約640nm的熒光；APC吸收約650 660nm的可見光，發(fā)射約660 670nm的熒光。CPE結(jié)合的輔基 色素為藻紅膽素(phycoerythrobilin，簡稱PEB); PEC的alpha亞基結(jié)合的輔基色素為藻紫膽素
(phycoviolobilin，簡稱PVB); PEC的beta亞基結(jié)合的輔基色素為藻藍膽素(phycocyanobilin，簡稱PCB); CPC和APC結(jié)合的輔基色素都為藻藍膽素PCB。
PEC的alpha亞基可以通過大腸桿菌基因工程菌來生產(chǎn)(Tooley AJ， Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-alpha subunit in a heterologous host J Bacteriol. 2002; 184(17): 4666 4671 )。與前人的方法不同，我們發(fā)現(xiàn)Anabaena sp. PCC7120中afr0677基 因編碼beta裂合酶，在其它藍藻中也存在同源的beta裂合酶。這類beta裂合酶不僅能催化藻藍膽素PCB 與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的84位半胱氨酸巰基(或同源的半胱氨酸巰基)共價結(jié)合生成藻紅藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)，還能催化藻紅膽素PEB與PEC的beta亞基及其同源蛋白質(zhì)的84位半胱氨酸巰基(或 同源的半胱氨酸巰基)共價結(jié)合生成一種新型的結(jié)合了 PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。藻紅膽素PEB 可由HOK PebA、 PebB協(xié)同催寸七生成(Alvey，R.M.,Karty，J.A.etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis in Fremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and Pigment Biosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。在絕大部分的藍藻和紅藻中， 都存在有編碼CPE脫輔基蛋白、CPC脫輔基蛋白、APC脫輔基蛋白、beta裂合酶以及PEB生物合成所需 的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有異形胞的藍藻中存在PEC;隱藻中沒有藻膽體，不存在上述基因中 的APC的基因。
藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可以應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域。目前使用的藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723, 2002.04.17。 一種水華藍藻制備藻藍蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用 藻類作為原料，而是利用基因工程方法生產(chǎn)新型的藻紅藍蛋白。藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)具 有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，這種結(jié)合PEB的新型藻紅藍蛋白，為開發(fā)新型熒光探針提供了更多的選 擇。本方法為藻紅藍蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域 奠定了基礎。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合藻紅膽素(FEB)的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的方法，它 是應用beta裂合酶催化PEB與藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，從而制備新型藻紅藍蛋白 類熒光蛋白質(zhì)(天然狀態(tài)下藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白是與PCB結(jié)合)。將含有beta裂合酶基 因、藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入宿主菌，得到 相應的工程菌，通過如此設計的基因工程菌生產(chǎn)新型藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法， 包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta 裂合酶表達質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達 載體中，得到脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和/^Z^或其同源基因克隆于第 三個表達載體中，得到力o/和peZ^表達質(zhì)粒；
(4) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個表 達載體中，得到peM表達質(zhì)粒；
(5) 將beta裂合酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、力o7和peZ^表達質(zhì)粒和pe/W表 達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用 此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提 純技術(shù)，提純得到相應的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案也可以是這樣的 一種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制
備方法，包括下述步驟
(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基 因或其同源基因同時克隆于表達載體中，得到beta裂合酶和脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；
(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和；7eZ^或其同源基因克隆于第三個表達載體中，得到力o7和peZ^表達質(zhì)粒；
(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因；^似或其同源基因克隆于第四個表
達載體中，得到/^M表達質(zhì)粒；
(4) 將beta裂合酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、力o7和peM表達質(zhì)粒和pe似表 達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用 此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提 純技術(shù)，提純得到相應的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
上述結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法中，所述的宿主菌為大腸桿菌； 所述的beta裂合酶基因是指與力朋力ae/7a sp. PCC7120中s化W77基因同源的基因；所述的 藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因是指與sp. PCC7120或必7aw'/7a ^ sp. PCC7603中 pec5基因同源的基因。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點
1、 不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌繁殖快， 可以大大縮短周期；
2、 與藻類相比，大腸桿菌細胞壁容易破碎，純化過程中可節(jié)省能源；
3、 通過大腸桿菌生產(chǎn)，目標蛋白含量高，有His-tag標記，且體系中幾乎沒有性質(zhì)類似 的蛋白，提取方便；
4、 生成結(jié)合PEB的新型藻紅藍蛋白，具有與天然藻紅藍蛋白不同的光譜特性，為發(fā)展熒 光藻膽蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料提供更多選擇。


圖1為本發(fā)明中Alr0617催化下生成的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的吸收與熒 光光譜；其中實線為吸收光譜，而虛線為熒光光譜。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。 實施例1
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^7a6ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， ^ 7a肌';7as"s sp. PCC7603和Ca"t/ r眾sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^ sZ73e/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec仏a7rW7;7、力o7); ^ Ja犯V o仰s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(peM); CWoz^r" sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因。eM和peZ^)。通過基因工程方法，將力/7a力ae/7asp. PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-sJ^^77，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將力朋Zwe朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec^克隆于Novagen 公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍 蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o/和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ e似，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因/^"在pET30中是在化oRV和J力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因 aZrt W7在pETDuet-1中，處于第二個多克隆位點設7II和之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶peM和/ eM)， 7 o7和pe/^在同一個載體pCDFDuet-1中，力W在第一個多克隆位 點I和尸"I之間，peM在第二個多克隆位點y\4/e I和I力o I之間，peZ^在pACYCDuet-l 中第二個多克隆位點^^ill和27w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-alrt^77、 pET30-; ec厭pCDFDuet-力o卜peM和pACYCDuet-/7eM轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophyl thiof D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L, 2CTC至37。C振蕩表達約12小時， 生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破 碎細胞后，離心收集上清液，通過N;T親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。其吸收與熒光光譜見圖1所示，其中實線為吸收光譜，而虛線為 熒光光譜。將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式如下
從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，接種于5mLLB培養(yǎng)基，37°C 振蕩培養(yǎng)過夜;取100ML飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mL LB培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 3 0.4時，將菌液轉(zhuǎn)移至5mL無菌離心管中，冰上放置10min;離心lmin (10000g， 4")棄去 上清，收集沉淀菌體;用lmL預冷的O, lmol/LCaCl2無菌溶液重懸菌體，離心30s (10000g, 4'C) 去上清，菌體沉淀用100nL預冷的0. lmol/L CaCl2重懸，放置于冰上，加入一定量的構(gòu)建好 的質(zhì)粒，混勻后冰浴放置30min， 42。C熱休克90s，冰浴5min后加入300^ LB培養(yǎng)基，37°C 低速振蕩培養(yǎng)45min，無菌涂布在含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，倒置于37。C培養(yǎng)箱至 形成可見的單克隆菌斑。
提取3個左右菌落，分別接種到5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至飽和；分 別從中取100pL轉(zhuǎn)接至5ml含相應抗生素的LB培養(yǎng)基中；37'C振蕩培養(yǎng)至0D6。。=0. 5-0. 7時， 冰浴約30min，加入IPTG誘導表達；避光、20°C、 150轉(zhuǎn)/分，表達約12小時。離心收集細 胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測其產(chǎn)物熒光量，選取熒光產(chǎn)量高的菌株進行大量表 達。
實施例2
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種勘Wae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M J柳i/70S〃s sp. PCC7603和CaJot/zr^sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力/736ae/ a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pet^、 3ZrW77、 /w/);
7a肌V oms sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec5); CaJoz^r& sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(peW和peZ^)。通過基因工程方法，將 sp.PCC7120中的alrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a/r^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將^7a&e朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec5(C1551)克隆于 Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-pec^(C1551)，在大腸桿菌中能表達脫 輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/w7和/^M)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o/-/ Wi9，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因/ ec5(C155I)在pET30中是在fcoRV和i%o I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因a7^ W7在pETDuet-1中，處于第二個多克隆位點^^1I禾Q J力o I之間；PEB合成酶 基因是3個(力o厶peM和peM)，力o7和； eM在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7在第一個 多克隆位點AfcoI禾B尸"I之間，pe65在第二個多克隆位點Abtel和J力ol之間，pe似在 pACYCDuet-l中第二個多克隆位點^ill和J/wI之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-alrt ^ 7、 pET30-pec5(C1551) 、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isopr叩hyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l鵬ol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例3
(1)從GeneBank中可以査到，藻種^a&e朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， #. 7a肌'/7os"s sp. PCC7603和C3"t力r&sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^ a力ae/ asp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec^、 aJi^W7、力o7); 必Ja肌'/70s〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(z e^); Ca7"力wi sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通過基因工程方法，將A W朋/ a sp. PCC7120中的W^^77基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因/ ec萬克隆于Novagen公司的 pETDuet-l中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pec^alr^77，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白類脫輔 基蛋白B和beta裂合酶。根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和pe力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7，e/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因。e似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec5和裂合酶基因Wr0577在pETDuet-1中，pecA處于第一個多克 隆位點，酶切位點是^boR I和尸"I ， a介W77處于第二個多克隆位點《^ n和J力o I之間； PEB合成酶基因是3個(力o厶peW和peM)，力o/和； eM在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7 在第一個多克隆位點vVco I和Z5" I之間，/ eM在第二個多克隆位點AWe I和屈o I之間，pe^ 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點5WII和Wo I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: 1混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec&aZrt W7、 pCDFDuet-力o7-peZ^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基 中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破 碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例4
(1)從GeneBank中可以查到，藻種^ a力ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
yK Ja/iw7 awssp. PCC7603和C^"/ r&sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。///73/ ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec仏a介W77、力o7);
M 7a/w'/ osM sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序列中找到所需基因(/ ec^); "A t力rj', sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe似和peZ^)。通過基因工程方法，將Z/^tee朋 sp. PCC7120中的a&M77基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec貝C1551)克隆于Novagen 公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pec5 (C155I) -WrM/7，在大腸桿菌中能表達 藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白B和beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe力歷克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM,在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^ (C155I)和裂合酶基因WrW77在pETDuet-1中，pec5處于第 一個多克隆位點，酶切位點是^boR I和戶W I ， a77^W7處于第二個多克隆位點A^ni和 I之間；PEB合成酶基因是3個(Z o入peM和pe65)， Z o7和；7e65在同一個載體pCDFDuet-l 中，力o7在第一個多克隆位點Afco I和,"I之間，peM在第二個多克隆位點We I和i7 o I 之間，pe/W在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點份7II和J/w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec^(C1551) -aZrt W7、 pCDFDuet-Z o7-pe6^和pACYCDuet-peiW轉(zhuǎn)入
大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的
LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-f3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl
thio-p-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為l腿ol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時，
生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破
碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白
質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。實施例5
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^7a&e朋sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， 尨7a歷i/7os"s sp. PCC7603和Ca/"/ rj>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力"a/ ae/7a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(/7ecA、 aZrt W7、 Zw/); 必7a肌V70s"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因。ecA); Ca^t力rA sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(pe^和pe6幼。通過基因工程方法，將^7aZ^e朋 sp.PCC7120中的a7rOW7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a介。W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將^朋&e朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因； ec5克隆于Novagen 公司的表達載體pCOLADuet-l中，所得質(zhì)粒叫pCOLADuet-; ecA在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(Zw7和； eZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe/^,在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因p"5在pCOLADuet-l第一個多克隆位點feoR I和Pst I兩個酶切位點 之間；裂合酶基因a^M77在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點《WII和之間； PEB合成酶基因是3個(力o厶/ e似和/ eM)，力o7和pe6v 在同一個載體pCDFDuet-1中，力o7 在第一個多克隆位點〃co I和尸W I之間，peM在第二個多克隆位點M/e I和J力o I之間，/ e力力 在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點處7II和i7w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-alrW77、 pCOLADuet-pec仏pCDFDuet-力o/-pe/^和pACYCDuet-pe似轉(zhuǎn)
11入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0
的LB培養(yǎng)基中，37t:振蕩培養(yǎng)至ODe。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例6
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種j/7a力朋朋sp. PCC7120的全序列己經(jīng)測定完成， vK 7柳i"ows sp. PCC7603和CaJoMrji sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。A aZjae/7a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因。ec仏aZrt W7、力o/); 必7a^'/70^s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(; ecv9); Ca7"力r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(/7eM和；;e6^)。通過基因工程方法，將力/7aZ^朋a sp. PCC7120中的WrW77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-W^ W 7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將^朋6ae朋sp.PCC7120中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pecMC1551)克隆于 Novagen公司的表達載體pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-pec^(C1551)，在大腸桿菌 中能表達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe65)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-; eZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pecMC155I)在pC0LADuet-1第一個多克隆位點￡boR I和Pst I兩個
酶切位點之間；裂合酶基因Wi^W7在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點5^HI和J力o
I之間；PEB合成酶基因是3個(力o入peM和/ e力5)， Zw7和/ e/^在同一個載體pCDFDuet-1
中，力o7在第一個多克隆位點I和At I之間，peM在第二個多克隆位點M/e I和i7 oI
之間，pe/M在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點份7II和Wo I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-aZrW7;7 、 pC0LADuet-/ ecW(C1551) 、 pCDFDuet-/ o卜/ e力A和 pACYCDuet-;^W轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-(J-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37 'C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌 體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應 的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例7
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種勘atee朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， iK 7a/w'/ os"s sp. PCC7603和CaJo^ r^sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力/7a6ae/7asp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec^、 alrt^77、力o7); #. 7a肌'加s〃s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(; ec^); CW"力rh sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和pe力5)。通過基因工程方法，將 sp.PCC7120中的a7/^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-a7rW7 7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中查到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將必7柳i/3oms sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec萬克隆于Novagen 公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-;^c萬，在大腸桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍 蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peM)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，
所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/w7-/7eZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/^W)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec5在pET30中是在化oRV和J力o I兩個酶切位點之間；裂合酶基因 Wr^W7在pETDuet-1中，處于第二個多克隆位點5^11和i7 o I之間；PEB合成酶基因是3 個(力o厶pe/W和； eM)，力o7和pe65在同一個載體pCDFDuet-1中，Z o7在第一個多克隆位 點Afco I和尸W I之間，/ eZ^在第二個多克隆位點We I和J7 o I之間，在pACYCDuet-l 中第二個多克隆位點《WII和o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZr。677、 pET30-pec仏pCDFDuet-力o/-peZ^和pACYCDuet-pe似轉(zhuǎn)入大 腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7.0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D6。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時， 生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破 碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例8
(1)從GeneBank中可以查到，藻種^朋A朋朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
7柳i77omssp. PCC7603和CW"/^ijrsp. PCC7601部分序列己經(jīng)測定。如aZ^e朋sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec5、 W2^W7、 Z o7);
必7a/w'/70幼s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序
列中找到所需基因(peM); Ck "/ rj> sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為
AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(/ eW和pe6A)。通過基因工程方法，將力/ 36ae"a
sp.PCC7120中的alrt W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫
pETDuet-aZrt W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將尨h肌'/mms sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pecMC155I)克隆 于Novagen公司的表達載體pET30中，所得質(zhì)粒叫pET30-pec^(C1551)，在大腸桿菌中能表 達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(/w/和； e力5)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7-pe力A在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peW)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-; e力A在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pecMC155I)在pET30中是在化oRV和I兩個酶切位點之間；裂 合酶基因aZrt 《77在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點^^1I和i7 oI之間；PEB合成酶 基因是3個(力o厶； e/^和； e/^),力o7和pe秘在同一個載體pCDFDuet-1中，Z o7在第一個 多克隆位點Afcol禾卩尸"I之間，； e/^在第二個多克隆位點AWeI和X力oI之間，/ ei^在 pACYCDuet-l中第二個多克隆位點份7II和之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生
素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5) 將pETDuet-aZr^77、 pET30-pec5(C1551) 、 pCDFDuet-/ o7—peZ 5和pACYCDuet— 轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)至OD咖為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio_(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例9
(1)從GeneBank中可以查到，藻種^朋6ae/ a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成，
yK Ja肌'"os"s sp. PCC7603和Ca7ot/ rj>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。A a力ae/ja sp, PCC7120在GeneBank中編號為BA000019，可從所查到序列中找到所需基因(pec5、 a7/^W7、 Zw7); iZ "加'y os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254，可從所査到序 列中找到所需基因(/ ec幼；Ca2"力h;sr sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peW和pe/^)。通過基因工程方法，將力/7stee/7a sp. PCC7120中的a7r^77基因和必^肌V7oms sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基 因pec^克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pec&a7/^577，在大腸 桿菌中能表達藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白B和beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-Z o7-v9eZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(pe似)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-l中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-peW，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^和裂合酶基因a77^W7在pETDuet-1中，pec^處于第一個多克 隆位點，酶切位點是^boR I和尸st I ， W^^77處于第二個多克隆位點5g7II和I之間； PEB合成酶基因是3個(力o厶peM禾t]pe/^)，力W和pe65在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7 在第一個多克隆位點Wco I和尸W I之間，/ eM在第二個多克隆位點/fefe I和o I之間，/ e^ 在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點餘JII和J力o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec5"Wr^77、 pCDFDuet-力o7-pe/^和pACYCDuet-轉(zhuǎn)入大腸桿菌，
當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基
中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isopr叩hyl
thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 2(TC至37。C振蕩表達約12小時，
生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破
碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni"親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白
16質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。 實施例10
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力朋力ae朋sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， M h/z i/7o幼s sp. PCC7603和CaJ"力rAsp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。^朋Z ae朋sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec仏a^rt W7、力o/);
7柳j'/ os"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所査到序 列中找到所需基因(pec^); Ca7W力ri義sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679,可從所査到序列中找到所需基因(/^M和pe/^)。通過基因工程方法，將力朋6朋朋 sp. PCC7120中的aZrt^/7基因和M ^啦V os"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基 因pec5 (C155I)克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫pETDuet-pec5 (C155I) -a7/^W7，在大腸桿菌中能表達藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白B和beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力W和peZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-力o7，eM，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因/ ec5 (C155I)和裂合酶基因a7/^W7在pETDuet-1中，； ec^處于第 一個多克隆位點，酶切位點是^boR I和尸"I ， WrM77處于第二個多克隆位點5《711和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o入pe似和peM)，力o7和peZ^在同一個載體pCDFDuet-1 中，力o7在第一個多克隆位點I和尸W I之間，/ eM在第二個多克隆位點AWe I和J/ o I 之間，/ e/M在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點和J/w I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(4) 將pETDuet-pec5(C1551) -aZrt 《/7、 pCDFDuet-Zw卜/ eM和pACYCDuet-; aM轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0的 LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(is叩rophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L， 20。C至37。C振蕩表達約12小時， 生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞，加入緩沖液、破 碎細胞后，離心收集上清液，通過Ni2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍蛋白類熒光蛋白 質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例11
(1) 從GeneBank中可以查到，藻種^73力ae"a sp. PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， vK z3肌'/ os"s sp. PCC7603和C37"/ w>sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力/7a63e/7a sp. PCC7120 在GeneBank中編號為BA000019，可從所査到序列中找到所需基因(pec^、 a7r。W7、 Z o7); ^7柳i/JO幼ssp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(pec5); 6^ot/ n';r sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所查到序列中找到所需基因(peM和/ ^^)。通過基因工程方法，將力朋&e朋 sp. PCC7120中的a^W77基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-Wj^W 7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，利用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將#. 7a肌'/7os"s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因peci9克隆于Novagen 公司的表達載體pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-pecA在大腸桿菌中能表達脫輔基 蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和； eZ^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中， 所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o/-在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。
(4) 將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-pe^，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pec^在pC0LADuet-l第一個多克隆位點^boR I和Pst I兩個酶切位點
之間；裂合酶基因WrOW7在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點^^71I和之間；
PEB合成酶基因是3個(力o入peM和peM)， / o7和；7e65在同一個載體pCDFDuet-l中，力o7
在第一個多克隆位點vVco I和尸W I之間，peM在第二個多克隆位點A^e I和i7 o I之間，pe^
在pACYCDuet-l中第二個多克隆位點《§711和J力o I之間?；虿迦胼d體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致l: l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5)將pETDuet-aZrt ^/;7、 pC0LADuet-/ ec5、 pCDFDuet-力o卜peZ^和pACYCDuet-pe^轉(zhuǎn) 入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工程菌接種于pH 7. 0 的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0De。。為0.5至0.8，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷 (isoprophyl thio—(3—D—galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 20。C至37。C振蕩表 達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌體細胞， 加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過附2+親和層析，可提純得到相應的藻紅藍 蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
實施例12
(1) 從GeneBank中可以査到，藻種力/7a/ ae朋sp.PCC7120的全序列已經(jīng)測定完成， Ja/w'/7as"s sp. PCC7603和CaJ"力ri;sr sp. PCC7601部分序列已經(jīng)測定。力朋力ae/7a sp. PCC7120
在GeneBank中編號為BA000019,可從所査到序列中找到所需基因(pec^、 a7rM/7、力o7); M Ja7u';7as"s sp. PCC7603中所用到基因序列在GeneBank中編號為M34254,可從所查到序 列中找到所需基因(pec5); C^ot/ r^ sp. PCC7601中所用到基因序列在GeneBank中編號為 AY363679，可從所査到序列中找到所需基因(; e6/I和peZw9)。通過基因工程方法，將^7a6ae朋 sp. PCC7120中的a7/^W7基因克隆于Novagen公司的pETDuet-1中，所得質(zhì)粒叫 pETDuet-3^^W7，在大腸桿菌中能表達beta裂合酶。
根據(jù)GeneBank中査到的基因序列，設計引物，禾U用相應的藻種提取總DNA作為模板，通 過PCR擴增得到所需片段，通過上下游引物中設計的酶切位點，把目標片段轉(zhuǎn)入相應質(zhì)粒中 同樣的酶切位點上。
(2) 將M 73/w'加犯s sp. PCC7603中的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因pec5(C155I)克隆 于Novagen公司的表達載體pC0LADuet-1中，所得質(zhì)粒叫pC0LADuet-pec79(C1551)，在大腸
桿菌中能表達脫輔基蛋白藻紅藍蛋白B。
(3) 將藻紅膽素生物合成酶基因(力o7和pe/^)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1中，
所得質(zhì)粒叫pCDFDuet-/ o/-peZ^，在大腸桿菌中能同時表達H01和PebB。(4)將藻紅膽素生物合成酶基因(peM)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-1中，所得 質(zhì)粒叫pACYCDuet-/ eM，在大腸桿菌中能表達PebA。
即脫輔基蛋白基因pe^(C155I)在pC0LADuet-1第一個多克隆位點￡boR I和Pst I兩個 酶切位點之間；裂合酶基因a7^ W7在pETDuet-l中，處于第二個多克隆位點^ 7II和J力o I之間；PEB合成酶基因是3個(力o7、 /7eW和pe力萬)，力o7和pe/^在同一個載體pCDFDuet-1 中，力W在第一個多克隆位點Abo I和/^f I之間，pe/^在第二個多克隆位點We I和J7w I 之間，在pACYCDuet-1中第二個多克隆位點^ill和i7 o I之間。
基因插入載體的步驟為根據(jù)基因序列設計引物，分上下游， 一對；上游下游引物分別 帶有酶切位點；利用相應的藻種提取總DNA作為模板；經(jīng)過PCR擴增得到所需基因片段，把 所得基因片段進行電泳，回收；所得片段用設計的限制性內(nèi)切酶進行酶切，同時把載體用同 樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收基因片段和載體；基因片段和載體大致h l混合，在 T4連接酶作用下連接一定時間(一般4 6小時)；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含抗生 素的平板篩選，挑取克隆，驗證正確即可。
(5 ) 將 pETDuet-3ZrW77 、 pC0LADuet—; ec5(C1551) 、 pCDFDuet-力o —peZ S禾口 pACYCDuet-pe/^轉(zhuǎn)入大腸桿菌，當這些質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入大腸桿菌后得到大腸桿菌工程菌；將此工 程菌接種于pH 7. 0的LB培養(yǎng)基中，37。C振蕩培養(yǎng)至0D,為0. 5至0. 8，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophyl thio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為1腸1/L， 2(TC至37 'C振蕩表達約12小時，生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B;離心收集菌 體細胞，加入緩沖液、破碎細胞后，離心收集上清液，通過N:T親和層析，可提純得到相應 的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)藻紅膽素-藻紅藍蛋白B。
將所用到的質(zhì)粒的組合轉(zhuǎn)入大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化方式與實施例1相同。
上述制備方法適用于采用各種藍藻中的beta裂合酶、藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白、藻紅膽 素生物合成酶基因或其同源基因來制備藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)，但涉及到微生物菌種公開 的問題，本發(fā)明只選用了 GenBank中已公開全序列的藍藻^7a6ae/7a sp. PCC7120和已經(jīng)部分 測序的尨7a肌7ws"s sp. PCC7603和Ca"^rj> sp. PCC7601為例對本發(fā)明方法加以說明，本 領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述公開的內(nèi)容采用其它原料實施本發(fā)明。
權(quán)利要求
1. 一種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1)用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因克隆于表達載體中，得到beta裂合酶表達質(zhì)粒；(2)用基因工程方法，將藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因克隆于第二個表達載體中，得到脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；(3)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因bol和pebB或其同源基因克隆于第三個表達載體中，得到hol和pebB表達質(zhì)粒；(4)用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pebA或其同源基因克隆于第四個表達載體中，得到pebA表達質(zhì)粒；(5)將beta裂合酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、hol和pebB表達質(zhì)粒和pebA表達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提純技術(shù)，提純得到相應的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
2. —種結(jié)合藻紅膽素的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于包括下述步驟(1) 用基因工程方法，將beta裂合酶基因或其同源基因和藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基 因或其同源基因同時克隆于表達載體中，得到beta裂合酶和脫輔基蛋白表達質(zhì)粒；(2) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因力o7和/je65或其同源基因克隆于第 三個表達載體中，得到力o/和pe力^表達質(zhì)粒；(3) 用基因工程方法，將藻紅膽素生物合成酶基因pe^或其同源基因克隆于第四個表 達載體中，得到peM表達質(zhì)粒；(4) 將beta裂合酶表達質(zhì)粒、脫輔基蛋白表達質(zhì)粒、力o/和pe幼表達質(zhì)粒和pe^表 達質(zhì)粒依次轉(zhuǎn)入配套的宿主菌，當這些表達質(zhì)粒都轉(zhuǎn)入宿主菌后，得到相應的工程菌，應用 此工程菌通過發(fā)酵工程生產(chǎn)結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，按常規(guī)蛋白質(zhì)提 純技術(shù)，提純得到相應的結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的beta裂合酶基因是指與 sp. PCC7120中WrOW7基因同源的基因。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白基因 是指與^朋Aae朋sp. PCC7120或必J棚i/7os"5 sp. PCC7603中；pecS基因同源的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種結(jié)合藻紅膽素(PEB)的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，是通過應用藻膽蛋白beta裂合酶催化藻紅膽素與藻紅藍蛋白類脫輔基蛋白共價結(jié)合，制備結(jié)合PEB的藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明的方法應用生物過程生產(chǎn)藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法。藻紅藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)能應用于食品、保健與醫(yī)藥功能材料領(lǐng)域，特別是應用為生物和醫(yī)學分子監(jiān)測領(lǐng)域的熒光探針。
文檔編號C12N15/60GK101481700SQ20081002574
公開日2009年7月15日 申請日期2008年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者佟順剛, 坤 夏 申請人:廣州天寶頌原生物科技開發(fā)有限公司