一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法
【專利摘要】一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法，涉及一種基因工程。1)構(gòu)建獲得包含有兩個插入序列、gfp基因、nptII標(biāo)記基因和Ap標(biāo)記基因的螺旋藻整合篩選質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km；2)供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km的超聲轉(zhuǎn)化和篩選：用EcoRⅠ酶切pEGFP-IS-IS-Km，獲得線狀質(zhì)粒，兩端各有一個IS序列，與轉(zhuǎn)座子特征結(jié)構(gòu)類似，用實驗室超聲轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化螺旋藻869s，以芐青霉素和G418(nptII)篩選出插入突變的螺旋藻株，兩步篩選法篩選突變株，抗性平板初篩，梯度稀釋后利用熒光顯微鏡挑出單根綠色熒光藻，然后超聲波復(fù)篩，進行擴大培養(yǎng)，篩選出優(yōu)良性狀藻株。
【專利說明】一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因工程，尤其是涉及一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 螺旋藻（Spirulina)在分類學(xué)上屬于藍藻門，顫藻綱，螺旋藻屬，是一種多細胞、 微型、不分枝、無異形胞的螺旋狀體，靠分裂增殖，光合自養(yǎng)生物。其作為一種新的基因轉(zhuǎn)化 載體，具有高安全性、高營養(yǎng)性和高營養(yǎng)價值的特點，并且還有許多獨到之處，如：對外源蛋 白質(zhì)容受力高，繁殖迅速、再生快、培養(yǎng)條件簡單等。螺旋藻作為一種具有重要開發(fā)應(yīng)用價 值的原核生物具有巨大的潛力。
[0003] 近年來，理化誘變廣泛用于篩選目標(biāo)菌株，獲得優(yōu)良螺旋藻的傳統(tǒng)手段一般都是 自然馴化和不斷自然篩選而得，改造其基因結(jié)構(gòu)，獲得不同品系的更優(yōu)良螺旋藻也有不少 研究。Li jianhong等用紫外誘變螺旋藻獲得了富含藻藍蛋白的突變體。Cohen等用除草劑 SAN-9785作為生長抑制劑，從鈍頂螺旋藻和紫球藻中篩選獲得突變株，其生長速度及糖脂 含量均高于出發(fā)株，且鈍頂螺旋藻突變株富含亞麻酸。物理誘變因素（Y-射線、紫外 線等）和化學(xué)誘變因素（EMS、MNNG等）均能使螺旋藻絲體或細胞發(fā)生變異，產(chǎn)生耐低溫、耐 鹽、富含某種氨基酸或藻藍蛋白以及藻絲加長、高產(chǎn)的突變體。
[0004] 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)大多只適用于單細胞的藍藻，對于絲狀的螺旋藻尚沒有成熟的 遺傳轉(zhuǎn)化方法。螺旋藻之所以難以轉(zhuǎn)化，除了研究者們公認的，由于螺旋藻基因組自身的完 美性和復(fù)雜性而對外源基因產(chǎn)生強烈的排斥作用外，尚未建立有效的篩選、純化系統(tǒng)和方 法也是限制其轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。Zeng等、茅云翔等分別報道利用超聲波、電擊等轉(zhuǎn) 化方法轉(zhuǎn)化了螺旋藻單細胞，獲得了具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化藻株。Kawata等人采用建立基 于Tn5基礎(chǔ)上的轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶進行了鈍頂螺旋藻轉(zhuǎn)化體系的研究。徐虹等利用超聲 波轉(zhuǎn)化獲得了具有G418抗性的轉(zhuǎn)化藻株，并使外源基因成功的表達。張海生等通過自然轉(zhuǎn) 化法將帶有GFP報告基因的表達載體導(dǎo)入鈍頂螺旋藻A9細胞中，實現(xiàn)了 GFP在螺旋藻細胞 中的瞬時表達。在上述試驗中普遍采用的篩選標(biāo)記系統(tǒng)是利用抗生素基因作為篩選標(biāo)記， 但是選擇何種抗生素以及抗生素的濃度卻眾說紛紜，更為重要的是單單采用抗生素標(biāo)記篩 選出的轉(zhuǎn)基因藻在長時間的培養(yǎng)過程中往往會出現(xiàn)雜交信號不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)性狀退化等 現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象，一方面是由于整合基因丟失，但更為主要的無疑是由于野生藻污染， 轉(zhuǎn)化藻純度不高所造成的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的旨在提供利用nptll抗性標(biāo)記基因和gfp基因，以及兩步篩選法對 轉(zhuǎn)化子進行篩選、純化，提高螺旋藻轉(zhuǎn)化子的篩選、純化效率，為轉(zhuǎn)基因螺旋藻的篩選和育 種提供途徑方便，并為后續(xù)基因功能研究提供參考的一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法。
[0006] 本發(fā)明包括以下步驟：
[0007] 1)構(gòu)建犾得包含有兩個插入序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因和Ap標(biāo)記基因的螺 旋藻整合篩選質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km ;
[0008] 2)供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km的超聲轉(zhuǎn)化和篩選：用EcoR I酶切 pEGFP-IS-IS-Km，獲得線狀質(zhì)粒，兩端各有一個IS序列，與轉(zhuǎn)座子特征結(jié)構(gòu)類似，用實驗室 超聲轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化螺旋藻869s，以芐青霉素（Ap)和G418(nptII)篩選出插入突變的螺旋藻 株，兩步篩選法篩選突變株，抗性平板初篩，梯度稀釋后利用熒光顯微鏡挑出單根綠色熒光 藻，然后超聲波復(fù)篩，進行擴大培養(yǎng)，篩選出優(yōu)良性狀藻株。
[0009] 在步驟2)中，所述初篩的方法如下：通過超聲轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的螺旋藻整合篩選 質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km(事先用Not I線性化）轉(zhuǎn)化螺旋藻，以含有200ii g/mL Amp和60ii g/ ml G418的Zarrouk固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化藻株；10?15天后，轉(zhuǎn)化組在含有G418和Amp的 抗性平板上長出綠色藻落，即為轉(zhuǎn)化藻株；
[0010] 所述復(fù)篩的方法如下：從初篩的抗性平板上分別挑取若干單藻落，接到含有 100 ii g/mL Amp和30 i! g/mL G418的Zarrouk液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10?20天，吸取少許 藻液于載玻片上，在熒光正置顯微鏡下觀察，用自制的微吸管分離吸取發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)化 藻株至5ml EP管中，繼續(xù)培養(yǎng)15天后，用超聲波將其處理成3?5個細胞的短藻絲體后， 再加入100 U g/mL Amp和30 ii g/mL G418,繼續(xù)培養(yǎng)20?30天；再次進行上述步驟，如此 反復(fù)直至所有藻絲體在熒光顯微鏡下均發(fā)綠色熒光為止。
[0011] 本發(fā)明按照設(shè)計從藍藻（包括螺旋藻）染色體DNA上PCR擴增出轉(zhuǎn)座子IS序列， 構(gòu)建了含兩個插入序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因的供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km，同時建立 了含轉(zhuǎn)座子IS序列的螺旋藻介導(dǎo)整合和兩步法篩選系統(tǒng)。本發(fā)明提高了螺旋藻轉(zhuǎn)基因的 篩選效率，使篩選周期從以往的半年縮短到2個月，同時也大大提高了轉(zhuǎn)化藻的純度，其篩 選方法簡單，成本低，具有很大的應(yīng)用前景，為螺旋藻優(yōu)良品種的遺傳改造和選育打下了基 礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為螺旋藻轉(zhuǎn)化子初篩效果圖。
[0013] 圖2為螺旋藻轉(zhuǎn)化子復(fù)篩純化效果圖。

【具體實施方式】
[0014] 下面由實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0015] 步驟一螺旋藻轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)建
[0016] 1. 1藍藻轉(zhuǎn)座子序列（IS)的克隆
[0017] 根據(jù)NCBI上提供的藍藻IS基因序列設(shè)計一組引物IS1-1、IS1-2、IS1-3,其中在 IS1-1、IS1-2、IS1_3 上分別設(shè)置了 Not I、ClaI 和 EcoR I 位點：

【權(quán)利要求】
1. 一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 構(gòu)建獲得包含有兩個插入序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因和Ap標(biāo)記基因的螺旋澡 整合篩選質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km ; 2) 供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km的超聲轉(zhuǎn)化和篩選：用EcoR I酶切pEGFP-IS-IS-Km，獲 得線狀質(zhì)粒，兩端各有一個IS序列，與轉(zhuǎn)座子特征結(jié)構(gòu)類似，用實驗室超聲轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化螺 旋藻869s，以芐青霉素和G418 (nptll)篩選出插入突變的螺旋藻株，兩步篩選法篩選突變 株，抗性平板初篩，梯度稀釋后利用熒光顯微鏡挑出單根綠色熒光藻，然后超聲波復(fù)篩，進 行擴大培養(yǎng)，篩選出優(yōu)良性狀藻株。
2. 如權(quán)利要求1所述一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法，其特征在于在步驟2)中，所述 初篩的方法如下：通過超聲轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建好的螺旋藻整合篩選質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km轉(zhuǎn)化 螺旋藻，以含有200 y g/mL Amp和60 y g/ml G418的Zarrouk固體培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化藻株； 10?15天后，轉(zhuǎn)化組在含有G418和Amp的抗性平板上長出綠色藻落，即為轉(zhuǎn)化藻株。
3. 如權(quán)利要求1所述一種螺旋藻基因轉(zhuǎn)化篩選的方法，其特征在于在步驟2)中，所述 復(fù)篩的方法如下：從初篩的抗性平板上分別挑取若干單藻落，接到含有100 Ug/mL Amp和 30 ii g/mL G418的Zarrouk液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10?20天，吸取少許藻液于載玻片上， 在熒光正置顯微鏡下觀察，用自制的微吸管分離吸取發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)化藻株至5ml EP管 中，繼續(xù)培養(yǎng)15天后，用超聲波將其處理成3?5個細胞的短藻絲體后，再加入100 y g/mL Amp和30 ii g/mL G418,繼續(xù)培養(yǎng)20?30天；再次進行上述步驟，如此反復(fù)直至所有藻絲體 在熒光顯微鏡下均發(fā)綠色熒光為止。
【文檔編號】C12N15/74GK104450766SQ201510003572
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2015年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月6日
【發(fā)明者】章軍, 徐虹, 丁旭東, 杜正偉, 鄭天凌 申請人:廈門大學(xué)