專利名稱：對蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對蝦桃拉綜合征病毒(TSV)膠體金檢測試紙條，屬于膠體金免疫檢測 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對蝦桃拉綜合征(Taura Syndrome，TS)是由對蝦桃拉綜合征病毒(Taura SyndromeVirus, TSV)感染引起的一種疾病，能在其主要宿主凡納濱對蝦(Penaeus vannamei)和細(xì)角對蝦(P. stylirostris)中爆發(fā)流行和導(dǎo)致高死亡率。其感染凡納濱對蝦 的累計死亡率為40% 100%。該病于1992年由厄瓜多爾研究人員在桃拉河口附近的凡 納濱對蝦養(yǎng)殖場中發(fā)現(xiàn)，并以桃拉河地區(qū)命名了這種新的疾病，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 必須要求申報的動物疫病。目前，診斷TS和其病原TSV可行的方法包括傳統(tǒng)方法，免疫學(xué)方法和分子生物學(xué) 的方法。傳統(tǒng)的方法如臨床癥狀、組織病理學(xué)、動物實驗。免疫學(xué)方法如ELISA、免疫電鏡 等。分子生物學(xué)的方法如探針，RT-PCR等。在臨床檢測中，上述幾種方法對該病毒的診斷均具有一定的意義。ELISA法較為成 熟，但易出現(xiàn)非特異性；電鏡觀察法直觀，但費(fèi)用昂貴；RT-PCR法敏感、快速，但費(fèi)用昂貴而 且有設(shè)備限制。迄今為止，還未見有TSV免疫膠體金試紙條方法建立的報道。膠體金免疫 試紙條與其他診斷方法相比較，體現(xiàn)出以下特點(diǎn)①快捷迅速，可在5 15min內(nèi)顯示結(jié)果； ②靈敏準(zhǔn)確，結(jié)果受外因影響較小，可在對蝦養(yǎng)殖場現(xiàn)場進(jìn)行檢測；③操作簡單，不需要任 何特殊儀器和設(shè)備，尤其適合在基層推廣應(yīng)用；④成本低廉，所需樣本和試劑量少；⑤保存 和運(yùn)輸方便，一般保存于4°C冰箱，甚至可常溫保存；⑥安全穩(wěn)定，膠體金無毒性，不造成環(huán) 境污染，其膠體金顆粒與抗原是物理吸附不改變抗原的性質(zhì)，可最大限度的保持抗原的活 性。因此，研制TSV膠體金試紙條能更直觀地診斷對蝦桃拉綜合征病毒，為該病的檢測、檢 疫提供良好的工具。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是以多克隆抗體為基礎(chǔ)，通過免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)研制 一種操作簡單、成本低廉、快捷迅速的檢測對蝦桃拉綜合征病毒的膠體金檢測試紙條。技術(shù)方案本發(fā)明是以多克隆抗體為基礎(chǔ)，通過免疫膠體金標(biāo)記技術(shù)研制檢測對 蝦桃拉綜合征病毒的膠體金檢測試紙條。首先是TSV兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體和鼠抗 pET32a-VPlCr多克隆抗體的制備，純化及膠體金標(biāo)記，其次為劃線，然后將試紙條各組成成 分進(jìn)行組裝，最后對試紙條的特異性、敏感性、重復(fù)性、再現(xiàn)性、穩(wěn)定性進(jìn)行試驗，最終制備 檢測對蝦桃拉綜合征病毒的試紙條。對蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條，其特征是，由底板(1)、固相硝酸纖維素膜，簡稱NC膜(2)、檢測線即T線(3)、質(zhì)控線即C線 (4)、膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)、吸水紙(6)和樣品墊玻璃纖維膜(7)組成。底板(1) 一端表面粘貼膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維 膜(5)，5mmX5mm ；重疊膠體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)0. 2cm 粘上樣品墊玻璃纖維膜(7)長2. 5cm，抗體固相硝酸纖維素膜，簡稱NC膜(2)，長1.8cm，粘 貼在底板(1)表面中間段，此NC膜一端與玻璃纖維膜(5)重疊0. 2cm，另一端與吸水紙(6) 重疊0.2cm;底板(1)另一端表面粘貼吸水紙(6)，長3. 0cm。NC膜(2)上劃有一條鼠抗 pET32a-VPlcr多克隆抗體作為檢測線T線(3)和一條羊抗兔IgG作為質(zhì)控線C線(4)。上述對蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條的制備方法，包括(1)重組蛋白pET32a-VPlcr的制備與純化擴(kuò)增VPl保守區(qū)基因(VPlcr)，構(gòu)建高效表達(dá)載體pET32a-VPlcr，表達(dá)融合蛋白， 用鎳柱純化包涵體蛋白。(2)重組蛋白pET32a-VPlcr多克隆抗體制備及測定常規(guī)方法制備兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體及鼠抗pET32a-VPlcr多克隆抗體， 該多克隆抗體效價分別為1 102400和1 25600，用Protein G親和層析柱純化多克隆 抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并調(diào)整為lmg/mL。(3)膠體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物的制備和純化①調(diào)到最佳pH8. 2的20nm膠體金溶液(購自上海捷寧生物技術(shù)有限公司)20mL， 在磁力攪拌下，緩慢加入濃度為lmg/mL的兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體至終濃度為 15 μ g/mL,在室溫下攪拌30min ；②加質(zhì)量體積比10 % BSA牛血清白蛋白2mL至終濃度1 %，室溫攪拌5min ；③加質(zhì)量體積比10% PEG聚乙二醇20000 0. 4mL至終濃度0. 2%，室溫攪拌5min ；④4°C，17000rpm，離心 50min，棄去上清；⑤沉淀溶于2mL膠體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體保存液中，用0. 45 μ m濾 膜過濾，以上所得到的溶液為膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物原液，置4°C保 存?zhèn)溆?。保存液配制方法為BSAlg, PEG20000 0. 05g, NaN3 0. lg, NaCl 0. 8775g，用 20mmol/LTris-HCl緩沖液溶解并定容至100mL。4°C保存?zhèn)溆茫行?個月。(4)膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜的制備進(jìn)口 玻璃纖維膜(Ahlstrom8964)剪成 5mmX25mm，用 20mM 的 Tris-HCl 緩沖液 (PH8.2)將進(jìn)口玻璃纖維膜漂洗三次，3min/次，去掉表面的雜質(zhì)。然后，于干凈平皿中放 置兩個白色槍頭，將漂洗好的玻璃纖維膜小心放置在上面，37°C烘干。將膠體金-兔抗 pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物原液用20mM pH8. 2的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行1 2倍稀 釋，然后吸取100 μ L均勻的噴在玻璃纖維膜上面，37°C吸附lh，4°C保存。(5)抗體固相硝酸纖維素膜的制備選擇型號為Millipore 135的NC膜，將NC膜剪成1. 8X 2. 5cm，用2 μ L的移液槍 將鼠抗pET32a-VPlCr多克隆抗體用包被液稀釋小心在NC膜的一端劃線(濃度為2yg/cm) 作為檢測線(T線)，在NC膜的另一端用包被液稀釋過的羊抗兔IgG(博士德公司產(chǎn)品)(濃 度為1. 6 μ g/cm)劃線作為質(zhì)控線(C線)。檢測線和質(zhì)控線間距0. 6cm。室溫放置IOmin, 待印上的抗體完全吸附于膜上后，將膜轉(zhuǎn)移至盛有適量封閉液的平皿中，置于搖床中37°C，
550rpm作用lh。然后，用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 2)漂洗三次，3min/次，置于37°C 烘箱中干燥。4°C保存。將已劃線的硝酸纖維膜于24°C，相對濕度40%以下，真空干燥2h，鋁箔袋密封，標(biāo) 明半成品批號，放置4°C保存。包被液配制=NaCl 0. 85g，蔗糖4g，Tween-20 100 μ L，加入Tris-HCl緩沖液溶解 并定容至IOOmL ；封閉液配制BSA3g，蔗糖4g，加入Tris-HCl緩沖液溶解并定容至100mL。(6)組裝將PVC底板剪成2. 5cm寬/條，先將劃有鼠抗pET32a-VPlcr多克隆抗體的NC膜 小心平貼其上(注意T線和C線的方向不要弄反了)，再將膠體金-兔抗pET32a-VPlcr 多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜重疊2mm貼于劃有T線的NC膜端，然后重疊膠體金_兔抗 pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜2mm處小心平貼樣品墊玻璃纖維膜(GF-06購 自上海捷寧生物技術(shù)有限公司)，最后在劃有C線的NC膜端重疊2mm貼上吸水紙。將組裝 好的試紙板放于兩玻璃平板間壓緊，用剪刀剪成5mm/條，密封干燥，4°C保存。試紙條的組 裝如圖5。對蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條的檢測方法，包括將隨機(jī)抽取的試紙條插入樣品中，室溫下作用5 15min，陽性反應(yīng)出現(xiàn)上下兩條 玫瑰紅線，即下端檢測線T線和上端質(zhì)控線C線，T線顯示該樣品中含有對蝦桃拉綜合征病 毒；陰性反應(yīng)只在質(zhì)控線C線出現(xiàn)一條玫瑰紅線。有益效果本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)如下本發(fā)明使用的對蝦桃拉綜合征病毒多克隆 抗體特異性好、效價高，有利于增強(qiáng)該試紙條的特異性，降低其使用成本；由于使用抗體作 為基本試劑，生物安全性好，不存在試紙條擴(kuò)散對蝦桃拉綜合征病毒的潛在危險；膠體金免 疫試紙條與其他診斷方法相比較，體現(xiàn)出以下特點(diǎn)快捷迅速、操作簡單、成本低廉、保存和 運(yùn)輸方便，另外，該方法靈敏準(zhǔn)確，結(jié)果受外因影響較小，可在對蝦養(yǎng)殖場現(xiàn)場進(jìn)行檢測；安 全穩(wěn)定，膠體金無毒性，不造成環(huán)境污染，其膠體金顆粒與抗原是物理吸附不改變抗原的性 質(zhì)，可最大限度的保持抗原的活性。因此，研制對蝦桃拉綜合征病毒膠體金試紙條能更直觀 地診斷對蝦桃拉綜合征病毒，為對蝦桃拉綜合征病毒的檢驗、檢疫提供良好的工具。試驗證明，本發(fā)明研制的對蝦桃拉綜合征病毒多克隆抗體特異性好、效價高，可以 作為對蝦桃拉綜合征病毒多種檢測方法的重要試劑。試驗結(jié)果顯示，該試紙條具有特異性 強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好，同時具備可重復(fù)性和再現(xiàn)性等優(yōu)點(diǎn)。


圖1膠體金試紙條縱向剖面圖2膠體金試紙條俯視3膠體金試紙條模式4試紙條結(jié)果判定圖5試紙條的組裝示意6膠體金試紙條成品7試紙條檢測結(jié)果中1.PVC底版2.NC膜3.檢測線T線4.質(zhì)控線C線5.膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜6.吸水紙7.樣品墊玻璃纖維膜。
具體實施例方式本發(fā)明采用的具體技術(shù)路線的步驟一、TSV重組蛋白pET32a_VPlcr的制備與純化1 TSV 重組蛋白 pET32a_VPlcr 的制備擴(kuò)增VPl保守區(qū)基因VPlcr (擴(kuò)增位置7949bp_8789bp，全基因組序列已發(fā)布登陸 號DQ104696，黃新新，陸承平.桃拉綜合征病毒中國株ZHZC3全基因測序及分子結(jié)構(gòu)預(yù)測 [J] ·中國病毒學(xué)，2006，21 (3) =267-272)，構(gòu)建高效表達(dá)載體pET32a_VPlcr，轉(zhuǎn)化至B121菌 株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。2 TSV 重組蛋白 pET32a_VPlcr 的純化待確定重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)后，將包涵體用包涵體洗滌液洗滌一 次，4°C，IOOOOg離心lOmin。沉淀用Binding buffer重懸，4°C溶解過夜或者30°C水浴 lh，4°C，12000g 離心 20min，上清用 0.45μπι 的濾膜進(jìn)行過濾。用 His Trap affinity columns (GEHealthcare公司產(chǎn)品)進(jìn)行純化。純化方法如下 用5mL注射器吸滿蒸餾水，擰開柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器接上， lmL/min流速洗柱，避免空氣進(jìn)入柱中。 用 IOmLBinding buffer 平衡，lmL/min 流速。 將融合蛋白上樣(收集流出部分，SDS-PAGE檢測)。 用 IOmLBinding buffer 淋洗(收集流出部分，SDS-PAGE 檢測)。 用 5-15mLElution buffer (分管收集，每管 ImL)。 用 IOmLBinding buffer 洗柱，最后用 5mL20% 乙醇洗柱。Binding buffer 配制20mM Na3PO4 · 12H20 ；0. 5M NaCl ；20mM 咪唑；8M 脲； ImM β-巰基乙醇。ρΗ7. 4，0. 45μπι濾器過濾Elution buffer 配制:20mM Na3PO4 · 12H20 ；0. 5M NaCl ；500mM 咪唑；8M 脲； ImM β-巰基乙醇。ρΗ7. 4，0. 45μπι濾器過濾包涵體洗滌液配制:20mMNa3PO4 · 12H20 ；0. 5M NaCl ；20mM 咪唑；2M 脲。ρΗ7· 4。二、TSV多克隆抗體制備、測定和膠體金標(biāo)記1兔抗pET32a_VPlcr多克隆抗體及鼠抗pET32a_VPlcr多克隆抗體制備、測定桃拉綜合征病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)中國株ZHZC3由黃新新等人于 2004年分離于中國福建，并且測定了其全基因組。GenBank登陸號DQ104696。常規(guī)方法制備兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體，用作制備膠體金-抗體結(jié)合 物；鼠抗pET32a-VPlCr多克隆抗體，作檢測線，該多克隆抗體效價分別為1 102400和 1 25600。Protein G親和層析柱(GE Healthcare公司產(chǎn)品)純化多克隆抗體IgG，用凱 基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體濃度并調(diào)整為lmg/mL。2兔抗pET32a_VPlcr多克隆抗體與膠體金標(biāo)記和純化2. 1兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體與膠體金結(jié)合的最佳pH確定用膠體金梯度法確定抗體與膠體金結(jié)合的最佳pH值①取若干個1. 5mL小EP管，分別加入ImL膠體金((20nm，上海捷寧生物技術(shù)有限
7公司購買)；②用0. 2M/LK2C03調(diào)整pH為7、8、9、10。取膠體金100 μ L加入各管中，然后每管 分別加入3 μ L濃度為lmg/mL的兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體，混和均勻，室溫下放置 15min。③每管分別加入20 μ L濃度為10% NaCl溶液，混合均勻，室溫下放置15min ；④觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低PH(X)。⑤重復(fù)上述步驟，pH梯度為 X-0. 6 ；X-0. 3 ；X ；X+0. 3 ；X+0. 6，X+1。⑥觀察膠體金顏色變化直至室溫下放置2h，記錄仍保持紅色的為最佳結(jié)合pH。⑦實驗結(jié)果顯示，pH對兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體與膠體金結(jié)合的影響不大， 本實驗確定最佳PH為8. 2。2. 2膠體金和兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合的最佳濃度確定以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例(王福勇.膠體金探針的制備與 應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗學(xué)分冊，1991，12(4) :145-148)。取6個1. 5mL試 管，把兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體蛋白原液用5mM/L Tris-HCl (pH7. 5)2倍比稀釋(見 下表)，然后各吸取20 μ L按濃度由低到高分別加入最佳pH的膠體金溶液100 μ L，混勻，室 溫放置15min左右后，每管分別加入20 μ L濃度為10% NaCl溶液，室溫15min。顏色保持 紅色的最小蛋白用量擬定為最小蛋白結(jié)合量，室溫下放置2h仍然保持紅色者確定為最小 結(jié)合蛋白量，再此基礎(chǔ)增加20%即為最佳蛋白量。重復(fù)三次。若反應(yīng)不明顯可將反應(yīng)體系 擴(kuò)大至ImL。最佳蛋白量的確定
成分(μ )1.5mL Eppendorf 管編號1:101:201:401:801:1601:320lmg/mL兔抗多克隆抗體202020202020膠體金溶液體積10010010010010010010%NaCl2020202020202. 3膠體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物的制備和純化①取調(diào)到最佳pH8. 2的20nm膠體金溶液20mL，在磁力攪拌下，緩慢加入濃度為 lmg/mL的兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體至終濃度為15 μ g/mL，在室溫下攪拌30分鐘；②加質(zhì)量體積比10 % BSA牛血清白蛋白2mL至終濃度1 %，室溫攪拌5min ；③加質(zhì)量體積比10% PEG聚乙二醇20000 0. 4mL至終濃度0. 2%，室溫攪拌5min ；④4°C，17000rpm,離心 50min，棄去上清；⑤沉淀溶于2mL膠體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體保存液中，用0. 45 μ m濾 膜過濾，以上所得到的溶液為膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物原液，置4°C保 存?zhèn)溆谩Ｄz體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體保存液配制方法為BSA lg, PEG200000. 05g, NaN3 0. lg, NaCl 0. 8775g，用 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液溶解并定容至 100mL。4°C保存?zhèn)溆?br> 三、試紙條各組成部分的制備及組裝1試紙條各組成部分的制備1. 1膠體金-兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜的制備進(jìn)口 玻璃纖維膜(Ahlstrom8964)剪成 5mmX25mm，用 20mM 的 Tris-HCl 緩沖液 (PH8.2)將進(jìn)口玻璃纖維膜漂洗三次，3min/次，去掉表面的雜質(zhì)。然后，于干凈平皿中放 置兩個白色槍頭，將漂洗好的玻璃纖維膜小心放置在上面，37°C烘干。將膠體金-兔抗 pET32a-VPlcr多克隆抗體結(jié)合物原液用20mM pH8. 2的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行1 2倍稀 釋，然后吸取100 μ L均勻的噴在玻璃纖維膜上面，37°C吸附lh，4°C保存。1. 2硝酸纖維素膜(NC膜)的確定用純化的鼠抗pET32a-VPlcr多克隆抗體對不同型號的硝酸纖維素膜Mi 11 ipore 135, whatman Prima 40, whatman ImmunoporeFP, whatmanAE 99 (無背襯)，Sartorius CN 140進(jìn)行流速試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Millipore 135背景顏色淺，無需特殊處理，流速時間適應(yīng)，無 彌散現(xiàn)象，因此本實驗選擇Millipore 135膜為層析材料。1. 3檢測線(Τ線)及質(zhì)控線(C線)條件的優(yōu)化對NC膜上T線及C線設(shè)置幾個抗體濃度梯度，選擇出最優(yōu)的一組作為鼠 抗pET32a-VPlCr多克隆抗體濃度(T線)和羊抗兔IgG濃度(C線)。結(jié)果顯示，鼠抗 pET32a-VPlcr多克隆抗體(T)線濃度為2 μ g/cm和羊抗兔IgG濃度(C線)為l.eyg/cm。1.4T線及C線的劃線方法選擇型號為Millipore 135的NC膜，將NC膜剪成1. 8cmX 2. 5cm，用2 μ L的移液槍 將鼠抗pET32a-VPlCr多克隆抗體用包被液稀釋小心在NC膜的一端劃線(濃度為2yg/cm) 作為檢測線(T線)，在NC膜的另一端劃上包被液稀釋過的羊抗兔IgG (博士德公司產(chǎn)品) (濃度為1. 6 μ g/cm)作為質(zhì)控線(C線)。檢測線和質(zhì)控線間距0. 6cm。室溫放置IOmin, 待印上的抗體完全吸附于膜上后，將膜轉(zhuǎn)移至盛有適量封閉液的平皿中，置于搖床中37°C， 50rpm作用lh。然后，用20mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 2)漂洗三次，3min/次，置于37°C 烘箱中干燥。4°C保存。將已劃線的硝酸纖維膜于24°C，相對濕度40%以下，真空干燥2h，經(jīng)檢查外觀、長 度和干燥情況等，合格后鋁箔袋密封，標(biāo)明半成品批號，放置4°C保存。包被液配制NaCl 0. 85g，蔗糖4g，Tween-20 100 μ L加入Tris-HCl緩沖液溶解并 定容至IOOmL ；封閉液配制BSA3g，蔗糖4g，加入Tris-HCl緩沖液溶解并定容至100mL。2 組裝將PVC底板剪成2. 5cm寬/條，先將劃有抗體的NC膜小心平貼其上(注意T線和 C線的方向不要弄反了)，再將膠體金_兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜 重疊2mm貼于劃有T線的NC膜端，然后重疊膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物 玻璃纖維膜2mm處小心平貼樣品墊玻璃纖維膜(GF-06購自上海捷寧生物技術(shù)有限公司)， 最后在劃有C線的NC膜端重疊2mm貼上吸水紙。將組裝好的試紙板放于兩玻璃平板間壓 緊，用剪刀剪成5mm/條，密封干燥，4°C保存。試紙條的組裝如圖5。四、結(jié)果判定先用60 μ L20mM的Tris-HCl緩沖液(pH8. 2)檢測，當(dāng)只有質(zhì)控線顯紅色，檢測線 不顯紅色，表明陰性結(jié)果成立后，再用粗提的TSV病毒60 μ L檢測。TSV首先與膠體金-兔
9抗pET32a-VPlcr多克隆抗體形成復(fù)合物，在毛細(xì)作用下向前移動至鼠抗pET32a-VPlcr多 克隆抗體時被捕獲形成雙抗夾心的三明治結(jié)構(gòu)，在檢測線處膠體金顆粒富集呈紅色，沒有 結(jié)合的金標(biāo)多抗繼續(xù)向前層移動，與固定于NC膜上的羊抗兔IgG結(jié)合形成復(fù)合物，膠體金 顆粒標(biāo)記的抗體在質(zhì)控線處富集而呈現(xiàn)紅色。五、試紙條的特異性、敏感性、重復(fù)性、再現(xiàn)性、穩(wěn)定性試驗1試紙條的特異性試驗用對蝦的常見病毒，對蝦的白斑綜合征病毒(康樺華，陸承平，對蝦白斑綜合癥病 毒中國地方株變異區(qū)基因的比較.病毒學(xué)報，2007，23 (6) 490-493)和傳染性皮下與造血 組織壞死病毒(楊冰等，對蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)PCR檢測方法的建 立.2005，26(2) 1-5)代替TSV樣品，對試紙條的特異性進(jìn)行測定。檢測結(jié)果顯示，TSV膠體 金試紙條不與對蝦白斑綜合征病毒和對蝦傳染性皮下與造血組織壞死病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。2試紙條的敏感性試驗分別檢測100，10，1,0. 1,0. 01，0. 001 μ g/mL的含TSV的病毒液，對試紙條的敏感 性進(jìn)行測定。檢測結(jié)果顯示，試紙條的敏感性高。3重復(fù)性試驗①試紙條的批內(nèi)重復(fù)性測試選取在4°C保存的同一批組裝好的膠體金試紙條，每天檢測一次三個不同TSV病 毒液(設(shè)3個重復(fù))，連續(xù)7天。通過檢測試紙條的顯色變化來確定試紙條的重復(fù)性。實驗 結(jié)果顯示，批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)為3.0%。②試紙條的批間重復(fù)性測試選取保存于4°C的3個不同批次制做的膠體金試紙條，選定在同一時間，同時檢測 同一 TSV對蝦樣品(設(shè)3個重復(fù))。然后通過檢測試紙條的顯色變化來確定試紙條的重復(fù) 性。實驗結(jié)果顯示，批間重復(fù)的變異系數(shù)為4.5%。4試紙條的再現(xiàn)性試驗將同一批次的試紙條由不同的人員在同一實驗室和同一人員在不同的實驗室進(jìn) 行操作，通過試紙條顯色效果來確定試紙條的再現(xiàn)性，結(jié)果顯示，該試紙條具有再現(xiàn)性。5試紙條的穩(wěn)定性試驗將同一批次的試紙條分別用塑料袋及鋁箔密封，加干燥劑于4°C、_20°C、室溫保存 和在37°C做加速破壞試驗，在不同的保存期與新制備的試劑條插入同一對蝦TSV樣品中進(jìn) 行測定，通過檢測試紙條顯色的變化來確定試紙條的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果顯示，同一批次的試紙條于4°C保存6個月的期間，每周測定的結(jié)果顯色 條帶的顏色均很清晰，說明試紙條在4°C可保存6個月以上，還在繼續(xù)檢測；同一批次的試 紙條于-20°C保存6個月的期間，分別每半個月檢測一次，迄今為止試紙條還沒出現(xiàn)顯色強(qiáng) 度有所下降的變化，還在繼續(xù)檢測；同一批次的試紙條于37°C破壞試驗期間，每天都進(jìn)行 試紙條的檢測，在第12天時試紙條顏色的強(qiáng)度有所降低。說明試紙條在37°C可保存11天 半，相當(dāng)于2 8°C存放17個月左右，穩(wěn)定性符合國家所規(guī)定的指標(biāo)。
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權(quán)利要求
對蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條，其特征是，由底板(1)、固相硝酸纖維素膜，簡稱NC膜(2)、檢測線即T線(3)、質(zhì)控線即C線(4)、膠體金 兔抗pET32a VP1cr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)、吸水紙(6)和樣品墊玻璃纖維膜(7)組成；底板(1)一端表面粘貼膠體金 兔抗pET32a VP1cr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)，5mmx5mm；重疊膠體金 兔抗pET32a VP1cr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜(5)0.2cm粘上樣品墊玻璃纖維膜(7)長2.5cm，NC膜(2)長1.8cm，粘貼在底板(1)表面中間段，此NC膜一端與玻璃纖維膜(5)重疊0.2cm，另一端與吸水紙(6)重疊0.2cm；底板(1)另一端表面粘貼吸水紙(6)，長3.0cm，NC膜(2)上劃有一條鼠抗pET32a VP1cr多克隆抗體檢測線T線(3)和一條羊抗兔IgG質(zhì)控線C線(4)，檢測線和質(zhì)控線間距0.6cm。
2.權(quán)利要求1所述對蝦桃拉綜合征病毒膠體金檢測試紙條的制備方法，包括(1)重組蛋白pET32a-VPlcr的制備與純化擴(kuò)增VPl保守區(qū)基因VPlcr，構(gòu)建高效表達(dá)載體pET32a-VPlCr，表達(dá)融合蛋白，用鎳柱 純化包涵體蛋白；(2)重組蛋白pET32a-VPlcr多克隆抗體制備及測定常規(guī)方法制備重組蛋白pET32a-VPlcr多克隆抗體即兔抗pET32a-VPlcr多克隆抗體 和鼠抗pET32a-VPlcr多克隆抗體，該多克隆抗體效價分別為1 102400和1 25600，用 Protein G親和層析柱純化多克隆抗體IgG，用凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒測定抗體 濃度并調(diào)整為lmg/mL ；(3)膠體金-抗體結(jié)合物的制備和純化①調(diào)到pH8.2的20nm膠體金溶液20mL，在磁力攪拌下，緩慢加入濃度為lmg/mL的兔抗 pET32a-VPlcr多克隆抗體至終濃度為15 μ g/mL，在室溫下攪拌30min ；②加10%BSA牛血清白蛋白2mL至終濃度1%，室溫攪拌5min ；③加10%PEG聚乙二醇20000 0. 4mL至終濃度0. 2%，室溫攪拌5min ；④40C，17000rpm,離心50min,棄去上清；⑤沉淀溶于2mL保存液中，用0.45 μ m濾膜過濾，以上所得到的溶液為膠體金_抗體 結(jié)合物原液，置4°C保存?zhèn)溆?；膠體金-抗體保存液配制方法為BSA lg, PEG20000 0. 05g, NaN3O. lg，NaCl 0. 8775g，用 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液溶解并定容至 lOOmL，4°C保存?zhèn)溆茫?有效期6個月；(4)膠體金-抗體結(jié)合物玻璃纖維膜的制備進(jìn)口玻璃纖維膜Ahlstrom8964剪成5mmX 25mm，用20mM pH8. 2的Tris-HCl緩沖液將 進(jìn)口玻璃纖維膜漂洗三次，3min/次，去掉表面的雜質(zhì)；然后，于干凈平皿中放置兩個白色 槍頭，將漂洗好的玻璃纖維膜小心放置在上面，37°C烘干，將膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多 克隆抗體結(jié)合物原液用20mM pH8. 2的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行1 2倍稀釋，然后吸取100 μ L 均勻的噴在玻璃纖維膜上面，37°C吸附lh，制得膠體金-兔抗pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié) 合物玻璃纖維膜，4°C保存；(5)抗體固相硝酸纖維素膜的制備選擇型號為Millipore 135的NC膜，將NC膜剪成1. 8cmX 2. 5cm，用2 μ L的移液槍將 鼠抗pET32a-VPlCr多克隆抗體用包被液稀釋濃度為2 μ g/cm在NC膜的一端劃線作為檢測線T線，在NC膜的另一端用包被液稀釋過的濃度為1. 6 μ g/cm羊抗兔IgG劃線作為質(zhì)控線 C線，室溫放置lOmin，待印上的抗體完全吸附于膜上后，將膜轉(zhuǎn)移至盛有封閉液的平皿中， 置于搖床中37°C，50rpm作用Ih ；然后，用20mM pH8. 2的Tris-HCl緩沖液漂洗三次，3min/ 次，置于37°C烘箱中干燥，4°C保存；將已劃線的硝酸纖維膜于24°C，相對濕度40%以下，真空干燥2h，鋁箔袋密封，標(biāo)明半 成品批號，放置4°C保存；包被液配制方法為=NaCl 0. 85g，蔗糖4g，Tween-20 100 μ L，加入Tris-HCl緩沖液溶 解并定容至IOOmL ；封閉液配制方法為BSA 3g，蔗糖4g，加入Tris-HCl緩沖液溶解并定容 至 IOOmL ；(6)組裝將PVC底板剪成2. 5cm寬/條，先將印有抗體的NC膜小心平貼其上，再將膠體金-抗 體結(jié)合物玻璃纖維膜重疊NC膜端2mm貼于劃有 T線的一端，然后重疊膠體金_兔抗 pET32a-VPlCr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜2mm處平貼樣品墊玻璃纖維膜，最后重疊NC膜 端2mm在劃有C線的一端貼上吸水紙，即為組裝好的試紙板，再將組裝好的試紙條放于兩塊 玻璃平板間壓緊后，用剪刀剪成5mm/條，密封干燥，4°C保存。
3.權(quán)利要求1或2所述試紙條用于對蝦桃拉病毒病毒檢測的方法，包括將隨機(jī)抽取的試紙條插入檢測樣品中，室溫下作用5 15min，陽性反應(yīng)出現(xiàn)上、下兩 條玫瑰紅線，即檢測線T線和質(zhì)控線C線，T線顯示該樣品中含有對蝦桃拉綜合征病毒；陰 性反應(yīng)只在質(zhì)控線C線出現(xiàn)一條玫瑰紅線，顯示該樣品中沒有對蝦桃拉綜合征病毒。
4.權(quán)利要求1或2所述對蝦病毒綜合征病毒膠體金檢測試紙條在制備對蝦桃拉綜合征 病毒診斷試劑盒方面的應(yīng)用。全文摘要
本發(fā)明涉及一種對蝦桃拉綜合征病毒(TSV)膠體金檢測試紙條，屬于膠體金免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。試紙條底板一端為膠體金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗體結(jié)合物玻璃纖維膜，抗體固相硝酸纖維素膜位于中間，其上劃有一條鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗體檢測線(T線)和一條羊抗兔IgG質(zhì)控線(C線)，底板另一端為吸水紙。當(dāng)被檢樣品中帶TSV時，TSV首先與膠體金-兔抗pET32a-VP1cr多克隆抗體形成復(fù)合物，在毛細(xì)作用下前移至鼠抗pET32a-VP1cr多克隆抗體時被捕捉，即發(fā)生雙抗夾心特異結(jié)合，在檢測線處膠體金顆粒富集呈紅色，因而可檢測樣品中是否含有TSV。該方法具有快速、準(zhǔn)確、方便等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合現(xiàn)場檢測和初篩檢驗，具有廣闊的前景。
文檔編號C12N15/63GK101915834SQ20101018976
公開日2010年12月15日 申請日期2010年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月2日
發(fā)明者柏琴琴, 費(fèi)榮梅, 趙彥華, 陸承平 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)