專利名稱：一種提高產(chǎn)1，3-丙二醇融合菌篩選效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用基因組重排技術(shù)制備產(chǎn)1，3-丙二醇基因工程融合菌的篩選方法，特別是提高篩選效率的方法，屬于工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
1，3_丙二醇(PDO)是一種重要的化工和醫(yī)藥中間體原料，可作為有機(jī)溶劑應(yīng)用于油墨、印染、乳化劑、抗凍劑等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)的單體。PTT是目前國際上公認(rèn)的六大石化新產(chǎn)品之一。與聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龍等比較，PTT具有良好的印染特性、富有彈性、抗紫外線、靜電性能好、可生物降解并再生利用等多種優(yōu)良特性，因此PTT在紡織服裝業(yè)、地毯裝飾業(yè)、工程塑料等眾多領(lǐng)域有著十分廣闊的應(yīng)用前景。據(jù)估計(jì)，目前僅我國每年就需求PDO上百萬噸，而且在未來十年我國對PDO的需求量還將繼續(xù)增大。PTT生產(chǎn)的關(guān)鍵在于單體原料PDO的來源，其生產(chǎn)成本直接影響著PTT的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用規(guī)模。1，3_丙二醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法目前僅有國外DuPont和Siell公司以及國內(nèi)的少數(shù)幾家單位在進(jìn)行小規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。技術(shù)路線分別是德國Degussa公司的丙烯醛合成法專利技術(shù)和Siell公司開發(fā)的環(huán)氧乙烷合成法， 并用于聚合生產(chǎn)PTT。為了壟斷市場，這兩家跨國公司不對外銷售用于PTT生產(chǎn)的PD0，而只向客戶銷售PTT切片及其下游產(chǎn)品。同時(shí)，化學(xué)合成法存在設(shè)備投資大、工藝要求嚴(yán)格、 操作條件苛刻、有毒副產(chǎn)物多、產(chǎn)品提取難度大、三廢處理成本高以及生產(chǎn)原料依賴于不可再生的石油資源等問題，導(dǎo)致PTT材料及其原料產(chǎn)品PDO的價(jià)格一直居高不下，制約其進(jìn)一步的發(fā)展。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PD0，以可再生資源——碳水化合物為原料，具有操作簡便、反應(yīng)條件相對溫和、副產(chǎn)物少、污染少且容易處理以及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，引起了國內(nèi)外相關(guān)企業(yè)和研究單位的高度重視，將具有廣泛的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力。微生物發(fā)酵法的生產(chǎn)方法包括一是利用從自然界獲得的菌株以甘油為底物直接發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙二醇；二是構(gòu)建基因工程菌以葡萄糖或甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)1，3_丙二醇； 基因工程菌構(gòu)建策略主要有5種(1)強(qiáng)化原始菌株中還原途徑限速酶的表達(dá)及阻止副產(chǎn)物的代謝途徑；(2)將1，3-丙二醇生產(chǎn)菌的關(guān)鍵酶基因dhaB、dhaT基因克隆到甘油生產(chǎn)菌中，以希望能獲得將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的基因工程菌；(3)將甘油生產(chǎn)菌的DAR1、GPP2基因克隆到1，3_丙二醇生產(chǎn)菌中，以希望能獲得將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3-丙二醇的基因工程菌；(4)將產(chǎn)1，3_丙二醇的dha調(diào)控子基因克隆到大腸桿菌中，獲得能轉(zhuǎn)化甘油為1， 3-丙二醇的基因工程菌；(5)將1，3_丙二醇生產(chǎn)菌的關(guān)鍵酶基因dhaB、dhaT基因和甘油生產(chǎn)菌的DARl、 GPP2基因克隆到大腸桿菌中，從而獲得能將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1，3_丙二醇的基因工程菌。目前，國外DuPont公司已經(jīng)在大腸桿菌中成功構(gòu)建了以葡萄糖為底物發(fā)酵1. 3-丙二醇的途徑，產(chǎn)量高達(dá)135g/L。國內(nèi)眾多研究機(jī)構(gòu)也紛紛針對產(chǎn)1，3-丙二醇途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行了深入的研究，在模式大腸桿菌成功表達(dá)關(guān)鍵酶基因，但產(chǎn)量水平較低，而針對原始生產(chǎn)菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鮮見報(bào)道，隨著國際范圍內(nèi)生物柴油工業(yè)的廣泛興起，將產(chǎn)生大量的剩余副產(chǎn)品甘油，為利用發(fā)酵法制備1，3_丙二醇提供了豐富的原料?；蚪M重排技術(shù)作為新型的育種技術(shù)，基于原生質(zhì)體融合技術(shù)之上，使不同基因組發(fā)生重排的過程。其主要機(jī)制在于利用原生質(zhì)體融合達(dá)到全基因組片段交換、重組，經(jīng)過多輪遞歸融合后促使正向突變表型聚集，相較誘變育種、原生質(zhì)體融合人技術(shù)等，基因組重排技術(shù)具有更高的效率。基因組重排技術(shù)基于多親本之間的遞歸融合，具有更大基因突變來源；遞歸融合還能使正向突變的表型聚集，多輪融合極大的提高了基因交換的概率。其次，基因組重排技術(shù)可以無需了解相關(guān)微生物的代謝途徑、關(guān)鍵酶的表達(dá)基因、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等知識背景，尤其適合微生物代謝途徑的遺傳改造。此外，基因組重排技術(shù)操作簡單，容易推廣，不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，而且見效快。因此，基因組重排育種很適合工業(yè)菌株的改造工程，不僅體現(xiàn)成本經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，還具備高效性?；蚪M重排技術(shù)充分結(jié)合了細(xì)胞工程和代謝工程的優(yōu)勢，不僅可以進(jìn)行菌種表型快速高效優(yōu)化，還可為不同種類的微生物復(fù)雜的代謝和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了信息來源。目前，基因組重排技術(shù)主要應(yīng)用于提高微生物代謝產(chǎn)物產(chǎn)率，增強(qiáng)菌株對環(huán)境的耐受性以及底物的利用率。在 2009 年，Jin 等(Jin ZH, Xu B, Lin SZ, Jin Q, Cen P. Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling. Appl BiochemBiotechnol 2009. doi :10. 1007/sl2010-008-8500_0)研究了 Saccharopolyspora spinosa的基因組重排育種工作，經(jīng)過四輪重排后，篩選到了兩株高產(chǎn)多殺菌素的融合菌，生產(chǎn)能力比原始出發(fā)菌株提高了 201%和436%。Burkhard Otte等(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec.2009， p.7610-7616Vol.75, No.240099-2240/09/ doi :10. 1128/AEM. 01774-09)首次結(jié)合傳統(tǒng)誘變育種和基因組重排技術(shù)，以Clostridium diolis為親本菌株，篩選到了高耐甘油和1，3-丙二醇的工程菌，其中一株融合菌的1，3-丙二醇濃度達(dá)到了 85g/L。采用基因組重排過程獲得優(yōu)良目的菌株的工作量較大，主要過程包括原生質(zhì)體的獲取、原生質(zhì)體的滅活誘變、原生質(zhì)體的融合、融合子的篩選等步驟?；蚪M重排一般需要多輪操作，每步驟的條件稍有變化對最終結(jié)果都可能產(chǎn)生明顯的影響，基因組重排過程需要大量人力、物力和時(shí)間?？茖W(xué)高效的融合子篩選方法是基因組重排育種技術(shù)過程成功的關(guān)鍵，而目前一般的篩選方法普遍采用提高單因子通量來篩選。該方法有一定理論基礎(chǔ)和實(shí)踐基礎(chǔ)，但是對于微生物整個(gè)發(fā)酵體系而言，缺乏科學(xué)性。微生物發(fā)酵體系對微生物后期有害脅迫和毒害作用是多因子作用的結(jié)果，并不是單一因子作用的結(jié)果。本發(fā)明利用初始菌株補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液并經(jīng)過濾除菌后作為選擇培養(yǎng)基，包含了各種對菌體不利因素，而且模擬了實(shí)際發(fā)酵體系，篩選到的菌株理論上具備更強(qiáng)的生產(chǎn)強(qiáng)度。本發(fā)明為工業(yè)菌株改良篩選提供了新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供提高產(chǎn)1，3_丙二醇融合菌篩選效率的方法，本發(fā)明方法可以提高目標(biāo)菌株的使用性能，同時(shí)提高目標(biāo)菌株的篩選效率。本發(fā)明提高產(chǎn)1，3_丙二醇融合菌篩選效率的方法包括如下過程(1)選擇親本菌株，或菌種經(jīng)適宜培養(yǎng)得到親本菌株；(2)親本菌株進(jìn)行酶解脫壁得到原生質(zhì)體；(3)原生質(zhì)體進(jìn)行滅活處理得到滅活原生質(zhì)體；(4)滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合；(5)用含有目的發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基篩選融合子，選擇性能優(yōu)良的目的融合菌；(6)步驟(5)獲得的優(yōu)良融合菌株作為親本進(jìn)入下一輪基因組重排過程，至獲得綜合性能優(yōu)良的菌株。其中步驟(5)中每輪獲得目的融合菌補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌后作為選擇培養(yǎng)基，用于篩選下一輪目的融合菌。本發(fā)明方法中，親本菌株一般為兩株，可以是肺炎克雷伯氏桿菌同種之間融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌間跨屬融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與大腸桿菌之間跨屬融合等具體方式。親本菌株可以源來市售商品，也可以是實(shí)驗(yàn)室保藏菌種經(jīng)培養(yǎng)獲得，菌種培養(yǎng)的方法可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法。本發(fā)明方法中，親本菌株酶解脫壁可以采用Tris-Cl (Tris鹽酸緩沖液)溶解的溶菌酶溶液進(jìn)行酶解脫壁處理。親本菌株在酶解脫壁處理之前可以進(jìn)行適宜的預(yù)處理過程，預(yù)處理如紫外誘變、NTG (亞硝基胍)誘變、DES (硫酸二乙酯)誘變、Tris-Cl緩沖液預(yù)處理等一種或幾種。本發(fā)明方法中，原生質(zhì)體進(jìn)行滅活處理可以采用常規(guī)的方法，如紫外滅活、熱滅活等方法，不同的親本原生質(zhì)體可以采用不同的滅活方法處理，具體滅活方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的內(nèi)容。本發(fā)明方法中，采用菌株同種之間融合時(shí)，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質(zhì)體滅活等步驟優(yōu)選分別進(jìn)行；采用不同菌株跨屬融合時(shí)，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質(zhì)體滅活等步驟可以分別進(jìn)行，也可以在同一體系中同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明方法中，酶解脫壁得到原生質(zhì)體或滅活原生質(zhì)體可以進(jìn)行膜過濾處理，膜過濾處理優(yōu)選采用0. 22 0. 85 μ m濾膜過濾除去對原生質(zhì)體融合有影響的菌體，優(yōu)選對酶解脫壁得到原生質(zhì)體進(jìn)行膜過濾處理。本發(fā)明方法中，滅活原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合的操作可以采用本領(lǐng)域常規(guī)方法，如滅活原生質(zhì)與聚乙二醇溶液(如聚乙二醇6000溶液)混合，在適宜溫度(如30 400C )下進(jìn)行融合一定時(shí)間(如3 30分鐘)。本發(fā)明方法中，融合子的篩選過程與常規(guī)基因組重組方法相同，如采用補(bǔ)料發(fā)酵方式在培養(yǎng)基中和適宜的條件下對融合子進(jìn)行篩選，主要特點(diǎn)在于以每輪篩選的補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌后作為下一輪融合子篩的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中跟據(jù)需要添加適宜的營養(yǎng)物質(zhì)。本發(fā)明方法中，各步驟的其它條件和操作方式可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法。本發(fā)明方法中，在融合子篩選過程中，通過采用適宜的培養(yǎng)基，用于篩選目的融合菌，即利用初始菌株補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液，經(jīng)過濾除菌后直接用于篩選目的融合菌，獲得的融合菌具備對發(fā)酵體系更高的耐受性。實(shí)驗(yàn)證明，使用本發(fā)明中補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液并經(jīng)過濾除菌，明顯提高了融合菌的生產(chǎn)強(qiáng)度，提高了產(chǎn)物的最終濃度及轉(zhuǎn)化率，提高經(jīng)濟(jì)經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)由于補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)發(fā)酵液的對融合子的有效篩選作用，可以進(jìn)一步提高獲得使用性能目標(biāo)菌株的篩選效率，實(shí)驗(yàn)表明，采用該方法進(jìn)行菌株篩選比采用普通培養(yǎng)基篩選時(shí)可以提高效率20 %以上。本發(fā)明方法中，原生質(zhì)體在融合前進(jìn)行膜過濾操作，可以選擇適宜的原生質(zhì)體進(jìn)行融合篩選，有效去除對融合操作有影響的菌體，減少篩選過程中的干擾，顯著提高了目的融合菌的篩選效率，實(shí)驗(yàn)表明，采用這種方法可以提高篩選效率20%以上。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的方案和效果。實(shí)施例1基因組重排育種，以肺炎克雷伯氏桿菌為初始親本菌株菌種肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)由撫順石油化工研究院篩選，保藏于中國微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號為0798。再生培養(yǎng)基(固體):A、蔗糖171.5g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏 5g/L，MgCl24. 273g/L，NaC15g/L，瓊脂 15g/L。LB培養(yǎng)基(固體)胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC15g/L，瓊脂15g/L。溶菌酶用10mM/L的Tris-Cl (pH8. 0)溶解溶菌酶，配置成20mg/mL的貯存液，分
裝使用。SMM 緩沖液0. 5mol/L 蔗糖，0. 02mol/L MgCl, 0. 02mol/L 順丁烯二酸。Tris-Cl 緩沖液還含有 0. 01mol/L 的 EDTA，0. 5mol/L 蔗糖。補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基酵母膏5g/l，K2HPO4 · 3H20 10g/l，KH2P042g/l，NH4ClO. 8-lg/l， NaCl 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. lg/1，F(xiàn)eCl3 · 6H20 30mg/l，CoCl2 · 6H205mg/l，VitaminB125mg/ 1，甘油30g/l ；實(shí)料發(fā)酵過程甘油控制在15 20g/L。補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)條件37°C，300rpm,空氣 0. 25 0. 5vvm?；蚪M重排過程(1)菌體預(yù)處理從_80°C甘油管保藏下的雙親本菌株在固體培養(yǎng)板上活化4代，液體LB活化 14h。預(yù)先紫外誘變?nèi)?，接種到LB固體斜面。轉(zhuǎn)到LB液體培養(yǎng)基活化10h，按2%接種量接種到含甘氨酸濃度為0.8%的25mL LB培養(yǎng)基的搖幷S培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，130rpm， 4h。用Tris-Cl緩沖液預(yù)處理。在恒溫震蕩儀37°C下，IOOrpm,時(shí)間為30min。用SMM緩沖液洗滌一次離心去上清，離心條件為4000g，4°C，IOmin0(2)酶解脫壁用SMM配制的溶菌酶母液(pH8. 0，溶菌酶濃度為20mg/mL)加入離心洗滌后的菌體，使最終濃度為0. 5mg ang，充分混勻，置恒溫振蕩儀中37°C，lOOrpm，Ih后離心去上清， 離心條件為3000g，4°C，lOmin。用SMM緩沖液洗滌兩次，離心條件同上。(3)原生質(zhì)體滅活用紫外和熱分別滅活兩份酶解脫壁的原生質(zhì)體，紫外滅活條件距離紫外燈20cm， 照射時(shí)間為30min，熱滅活條件為60°C，時(shí)間池，然后收集菌液。(4)原生質(zhì)體融合
由上步收集到的菌液按等體積混勻離心，加入濃度為40%的PEG6000 (SMM配制)， 37°C溫箱中40rpm，融合時(shí)間為6_8min。(5)融合子篩選融合后的原生質(zhì)體在再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)生長，以克雷伯氏桿菌補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液并經(jīng)過濾除菌后作為選擇培養(yǎng)基，將再生培養(yǎng)基上長出的融合菌株接種到搖弁瓦中，初步篩選耐受發(fā)酵體系優(yōu)良的融合子。HPLC(高效液相色譜)測定搖瓶發(fā)酵液1， 3_丙二醇的產(chǎn)物濃度并進(jìn)一步通過發(fā)酵罐培養(yǎng)確定。每輪獲得的優(yōu)良菌株作為親本進(jìn)入下輪融合。而每輪獲得目的融合菌補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液并經(jīng)過濾除菌后作為選擇培養(yǎng)基， 篩選下輪目的融合菌。經(jīng)過3 6輪的基因組重排篩選，可以獲得性能優(yōu)良的菌株。實(shí)施例2以肺炎克雷伯氏桿菌和大腸桿菌作為親本菌株，基因組重排技術(shù)育種選擇肺炎克雷伯氏桿菌和大腸桿菌為親本菌株，預(yù)先用LB液體培養(yǎng)基活化14h， 對雙親菌株(肺炎克雷伯氏桿菌和大腸桿菌)分別進(jìn)行紫外誘變和NTG誘變。其余步驟方法同例1，經(jīng)過3 6輪的基因組重排篩選，可以獲得性能優(yōu)良的菌株。實(shí)施例3以肺炎克雷伯氏桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌作為親本菌株，基因組重排技術(shù)育種選擇肺炎克雷伯氏桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌為親本菌株，預(yù)先用LB液體培養(yǎng)基活化14h，對雙親菌株(肺炎克雷伯氏桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌)分別進(jìn)行紫外誘變和NTG 誘變。其余步驟方法同例1，經(jīng)過3 6輪的基因組重排篩選，可以獲得性能優(yōu)良的菌株。實(shí)施例4與比較例實(shí)施例4采用初始菌株補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液并經(jīng)過濾除菌后，作為選擇培養(yǎng)基，比較例采用前述補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基(補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基組成為酵母膏5g/l，K2HPO4 · 3H20 10g/l，KH2P042g/l，NH4Cl 0. 8-lg/l，NaCl 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. lg/1，F(xiàn)eCl3 · 6H20 30mg/ 1，CoCl2 ·6Η20 5mg/l，VitaminB125mg/l，甘油 30g/l)，培養(yǎng)條件37°C，300rpm，空氣 0. 25 0.5vvm。當(dāng)發(fā)酵液中1，3-丙二醇濃度不再提高，甘油停止消耗時(shí)視為發(fā)酵終點(diǎn)。表1實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種提高產(chǎn)1，3-丙二醇融合菌篩選效率的方法，包括如下過程(1)選擇親本菌株，或菌種經(jīng)適宜培養(yǎng)得到親本菌株；(2)親本菌株進(jìn)行酶解脫壁得到原生質(zhì)體；(3)原生質(zhì)體進(jìn)行滅活處理得到滅活原生質(zhì)體；(4)滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合；(5)用含有目的發(fā)酵產(chǎn)物的培養(yǎng)基篩選融合子，選擇性能優(yōu)良的目的融合菌；(6)步驟( 獲得的優(yōu)良融合菌株作為親本進(jìn)入下一輪基因組重排過程，至獲得綜合性能優(yōu)良的菌株；其特征在于步驟(5)中每輪獲得目的融合菌補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌后作為選擇培養(yǎng)基，用于篩選下一輪目的融合菌。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于親本菌株為兩株，為肺炎克雷伯氏桿菌同種之間融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌間跨屬融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與大腸桿菌之間跨屬融合。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于親本菌株酶解脫壁采用Tris-Cl(Tris鹽酸緩沖液)溶解的溶菌酶溶液進(jìn)行酶解脫壁處理。
4.按照權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于親本菌株在酶解脫壁處理之前進(jìn)行預(yù)處理過程，預(yù)處理過程包括紫外誘變、亞硝基胍誘變、硫酸二乙酯誘變、Tris-Cl緩沖液預(yù)處理中的一種或幾種。
5.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于原生質(zhì)體進(jìn)行滅活處理采用紫外滅活或熱滅活方法。
6.按照權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于采用菌株同種之間融合時(shí)，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質(zhì)體滅活步驟分別進(jìn)行；采用不同菌株跨屬融合時(shí)，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質(zhì)體滅活步驟分別進(jìn)行，或者在同一體系中同時(shí)進(jìn)行。
7.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于酶解脫壁得到原生質(zhì)體或滅活原生質(zhì)體進(jìn)行膜過濾處理。
8.按照權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于膜過濾處理采用0.22 0. 85 μ m濾膜過濾除去對原生質(zhì)體融合有影響的菌體。
9.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于滅活原生質(zhì)體在聚乙二醇溶液中進(jìn)行融合O
10.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于融合子的篩選過程采用補(bǔ)料發(fā)酵方式在培養(yǎng)基中對融合子進(jìn)行篩選，以每輪篩選的補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)的發(fā)酵液經(jīng)過濾除菌后作為下一輪融合子篩的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高產(chǎn)1，3-丙二醇融合菌篩選效率的方法，主要過程包括選擇親本菌株；親本菌株進(jìn)行酶解脫壁得到原生質(zhì)體；原生質(zhì)體進(jìn)行滅活處理；滅活的原生質(zhì)體進(jìn)行原生質(zhì)體融合；篩選融合子，選擇性能優(yōu)良的目的融合菌；優(yōu)良融合菌株作為親本進(jìn)入下一輪基因組重排過程，至獲得綜合性能優(yōu)良的菌株；其中每輪獲得目的融合菌補(bǔ)料發(fā)酵終點(diǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行過濾除菌后作為選擇培養(yǎng)基，用于篩選下一輪目的融合菌。與現(xiàn)有基因工程融合菌篩選方法相比，本發(fā)明方法具有操作方便，不需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，篩選效率高，適合于工業(yè)菌株育種等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N15/03GK102311946SQ201010220778
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月7日
發(fā)明者師文靜, 李曉姝, 王崇輝, 王領(lǐng)民, 金平 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院