專利名稱：一種人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及體外診斷技術(shù)和檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種基因芯片，以及包括該芯片的檢測人生物學(xué)性狀相關(guān)基因各基因型的寡核苷酸芯片套組和方法。背景遺傳與環(huán)境對人類身心健康發(fā)展的作用探討一直是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的焦點。通過比較同卵雙生和異卵雙生孿生子的研究表明，人體的生長發(fā)育以及大腦各部分功能的發(fā)展與完善受到遺傳因素和環(huán)境因素的影響和制約，其中大約40-50%受遺傳因素的影響。由于遺傳因素目前人們無法掌控，而環(huán)境因素卻是人們可以創(chuàng)造和調(diào)節(jié)，因此可根據(jù)兒童本身的遺傳因素，為其創(chuàng)設(shè)量身定做的外部環(huán)境(包括自然和社會環(huán)境)，強化優(yōu)勢天賦，消除潛在的不良人格，因材施教，進(jìn)行個性化教育培養(yǎng)。Clonigner 白勺三維人格|、可卷(Tridimensional Personality Questionnaire, TPQ) 基于三維人格理論，將人格分為三個相互獨立的維度，即獵奇性(Novelty-kekingjS)、躲避傷害性(Harm-Avoidance，HA)和獎賞依賴性(Reward-D印endence，RD)，分別與多巴胺 (DA)神經(jīng)遞質(zhì)、5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)遞質(zhì)和去甲腎上腺素(NA)神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。多巴胺主要與大腦的情欲和感覺有關(guān)，傳遞興奮及快樂的信息，也與上癮有關(guān)。腦部多巴胺含量多， 人會變得極富好奇心，愛冒險，積極進(jìn)取。愛情其實就是腦里產(chǎn)生大量多巴胺作用的結(jié)果。 所以，吸煙和吸毒都可以增加多巴胺的分泌，使上癮者感到開心及興奮。若多巴胺較少時， 便會導(dǎo)致優(yōu)柔寡斷而冷漠的個性，缺乏啟動力和積極性。5-羥色胺可以直接影響人的心理功能和生理功能，比如人的喜怒哀樂、睡眠、食欲等。血液中5-羥色胺水平低，兒茶酚胺濃度較高的人脾氣容易急躁，性格比常人剛強、倔犟，遇事好沖動。反之，血液中5-羥色胺濃度較高，兒茶酚胺濃度偏低的人性情比常人溫和，遇事較冷靜，不易產(chǎn)生急躁情緒。與這些神經(jīng)遞質(zhì)相關(guān)基因的遺傳變異在不同程度上影響了個體的人格。大腦是一切心理活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，大腦結(jié)構(gòu)發(fā)育差異不僅影響個體的智商，同時也影響個體的人格。如BDNF基因參與與大腦海馬發(fā)育，低BDNF活性的個體比正常人的大腦海馬的體積要小11%，從而影響部分記憶功能，并與焦慮、抑郁等相關(guān)。不良性格的人在人際交往、社會支持度和事業(yè)等方面，相對不易獲得成功，嚴(yán)重者甚至存在嚴(yán)重的心理障礙、自殺等精神疾病，關(guān)系到社會的穩(wěn)定。另一方面，個體的身高、運動能力等也受到遺傳因素影響。在兒童教育培養(yǎng)上，年紀(jì)越小可塑性越強，良好的人格越容易培養(yǎng)。利用人類行為遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，通過檢測生物學(xué)性狀相關(guān)基因，即可判斷兒童最初的潛能，以正確的撫養(yǎng)方式對孩子的先天弱點進(jìn)行“基因治療”，對孩子的先天優(yōu)點進(jìn)行強化。

發(fā)明內(nèi)容
1.發(fā)明目的本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人生物學(xué)性狀基因檢測芯片，能有效地檢測生物學(xué)性狀相關(guān)基因的多態(tài)性，從而使家長、教師及心理醫(yī)生能及時了解孩子的遺傳信息， 預(yù)測兒童最初的性格和潛能，并根據(jù)兒童所具有的遺傳特性，創(chuàng)造合適的生活環(huán)境，制定針對性的教育計劃，制定合理的個性化培養(yǎng)方案，充分發(fā)揮兒童的優(yōu)勢天賦，取長補短，因材施教，培養(yǎng)兒童健康成長。為此，本發(fā)明還要提供應(yīng)用該芯片檢測人生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)檢測芯片，包括固相載體和探針，所述探針與待測的人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)相關(guān)基因的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交。本發(fā)明中所述固相載體可選用領(lǐng)域周知的載體，只要所述載體與所述反應(yīng)物相容，不會影響檢測結(jié)果就可以。優(yōu)選的，本發(fā)明所述固相載體選材為玻片、硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜和高分子材料中的一種或它們的任意組合。所述待測人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)相關(guān)多態(tài)性包括rs927544、rs363039、rs363016、 COMTVal 158Met、ADRB2Argl6Gly、SLC6A2T-182C、rs572227、BDNF Val66Met、rsl3212041、 rs429358、rs6323、D4DR C-521T、ACTN3R577X、ALDH2Glu504Lys、GSTP I105V、rsl042725、 rs2143340、rsll225308 和 rs3791786。所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要能完成與目的核苷酸序列特異性結(jié)合。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對之間的為最佳。所述探針的自身互補序列最好少于6個堿基對，以免影響雜交效率。本發(fā)明檢測芯片的探針為DNA，包括(1)與待測rs927544雜交的(a) SEQ ID NO 1 SEQID NO :2所示序列，(b) SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :2所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :2所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(2)與待測 rs363039 雜交的(a) SEQ ID NO 3 SEQ ID NO 4 所示序列，(b) SEQ ID NO :3 SEQ ID NO :4所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO :3 SEQ ID NO: 4所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(3)與待測 rs363016 雜交的(a) SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 6 所示序列，(b) SEQ ID NO 5 SEQ ID NO 6所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 5 SEQID NO 6所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(4)與待測 COMT Vall58Met 雜交的(a) SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8 所示序列， (b) SEQ IDNO 7 SEQ ID NO 8所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 8所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(5)與待測 ADRB2 Argl6Gly 雜交的(a) SEQ ID NO 9 SEQ IDNO 10 所示序列， (b)SEQ IDNO :9 SEQ ID NO :10所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO :9 SEQ ID NO :10所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(6)與待測 SLC6A2T-182C 雜交的(a) SEQ ID NO :11 SEQ ID NO 12 所示序列， (b)SEQ IDNO :11 SEQ ID NO 12所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 11 SEQ ID NO :12所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(7)與待測 rs572227 雜交的(a) SEQ ID NO :13 SEQ ID NO 14 所示序列，(b) SEQIDNO 13 SEQ ID NO 14所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 13 SEQ ID NO 14所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(8)與待測 BDNF Val66Met 雜交的(a) SEQ ID NO :15 SEQ ID NO 16 所示序列， (b)SEQ IDNO 15 SEQ ID NO 16所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 15 SEQ ID NO :16所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(9)與待測 rsl3212041 雜交的(a) SEQ ID NO :17 SEQ ID NO: 18 所示序列，(b) SEQ IDN0:17 SEQ ID NO :18所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID N0:17 SEQ ID NO 18所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(10)與待測 rs429358 雜交的(a) SEQ ID NO :19 SEQ ID NO 20 所示序列，(b) SEQ IDNO 19 SEQ ID NO 20所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 19 SEQ ID NO 20所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列；(11)與待測 rs6323 雜交的(a) SEQ ID NO :21 SEQ ID NO 22 所示序列，(b) SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 22所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 21 SEQ ID NO 22所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(12)與待測 D4DR C-521T 雜交的(a) SEQ ID NO :23 SEQ ID N0:24 所示序列， (b)SEQ IDNO 23 SEQ ID NO 24所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 23 SEQ ID NO 24所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(13)與待測 ACTN3R577X 雜交的(a) SEQ ID NO :25 SEQ ID NO 26 所示序列， (b)SEQ IDNO 25 SEQ ID NO 26所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 25 SEQ ID NO J6所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(14)與待測 ALDH2Glu504Lys 雜交的(a) SEQ ID NO :27 SEQID NO :28 所示序列， (b) SEQID NO 27 SEQ ID NO 28所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 27 SEQ ID NO J8所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(15)與待測 GSTP I105V 雜交的(a) SEQ ID NO :29 SEQ ID NO :30 所示序列， (b)SEQ IDNO 29 SEQ ID NO 30所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 29 SEQ ID NO :30所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(16)與待測 rsl042725 雜交的(a) SEQ ID NO :31 SEQ ID NO 32 所示序列，(b) SEQ IDNO 31 SEQ ID NO 32所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 31 SEQ ID NO 32所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(17)與待測 rs2143340 雜交的(a) SEQ ID NO :33 SEQ ID NO 34 所示序列，(b) SEQ IDNO 33 SEQ ID NO 34所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 33 SEQ ID NO 34所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(18)與待測 rsll225308 雜交的(a)SEQ ID NO :35 SEQ ID NO :36 所示序列， (b)SEQ IDNO 35 SEQ ID NO 36所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 35 SEQ ID NO :36所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。(19)與待測 rs3791786 雜交的(a) SEQ ID NO :37 SEQID NO 38 所示序列，(b) SEQ IDNO 37 SEQ ID NO 38所示序列中每條序列的互補鏈，(c)與SEQ ID NO 37 SEQ ID NO 38所示的序列中每條序列有至少70%同源性的序列。優(yōu)選的，本發(fā)明檢測芯片的探針選自SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 38所示序列。
所述探針序列可包含1 10個錯配堿基，較佳地，可包含1 5個錯配堿基，更佳地，可包含1 2個錯配堿基。本發(fā)明檢測芯片還包括至少一種對照探針，所述對照探針選自陰性對照探針、陽性對照探針、雜交對照探針和固定化對照探針。所述探針可通過連接臂固定于固相載體上。連接臂可以為探針形成雙鏈的部分提供一個自由的空間以減少空間位阻，有助于雜交反應(yīng)的進(jìn)行[Afanassiev V,HanemannV, Wolfl S. Preparation of DNA and protein micro arrays on glass slides coated with an agarose film. Nucleic Acids Res. 2000,28 :e66 ；USA Patent No. 5556752]。連接臂越長，雜交效率越高。典型的連接臂包括15 30個功能基團(tuán)長度。連接臂可以選用適當(dāng)形式的功能基團(tuán)，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇與Poly T(A、C或G)的嵌合體、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其組合物。所述探針或連接臂通過連接分子固定于固相載體上。探針固定到載體上可以通過 C-C鍵實現(xiàn)，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷鍵(玻璃或二氧化硅作支持物時使用)。硅氧烷鍵鍵合可以通過支持物和連接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基團(tuán)反應(yīng)完成。氨基烷基硅烷、輕基烷基硅烷、2—輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、輕乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或輕丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基團(tuán)。所述探針可以被修飾，修飾方法可以是5’ -NH2修飾、5’ -SH修飾、5’ -Poly T(A、C 或G)修飾、5’-生物素修飾、3’-NH2修飾、3’-SH修飾、3’-Poly T(A、C或G)修飾和3’-生物素修飾等。所述探針可以有一條或幾條，甚至全部都是經(jīng)過標(biāo)記的，所述標(biāo)記包括熒光素標(biāo)記、生物素標(biāo)記、放射性元素標(biāo)記、酶標(biāo)記和熒光共振能量轉(zhuǎn)移標(biāo)記。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種應(yīng)用上述芯片對心腦血管疾病進(jìn)行藥物遺傳學(xué)檢測的方法，包括如下步驟(1)在固相載體表面點載與待測人生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的核苷酸序列和/ 或其互補序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測樣品的核酸；(3)制備待測人生物學(xué)性狀相關(guān)基因的目的核苷酸序列；(4)標(biāo)記步驟(3)的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(1)所述的點載在固相載體上的探針進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的目的核苷酸序列，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。(7)將步驟(6)中的基因分型結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀分析軟件進(jìn)行受檢者生物學(xué)性狀分析。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種應(yīng)用上述芯片對人生物學(xué)性狀進(jìn)行基因多態(tài)性檢測的方法，包括如下步驟(1)標(biāo)記與待測生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的核苷酸序列和/或其互補序列進(jìn)行雜交的探針；(2)抽提待測樣品的核酸；(3)制備待測生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的目的核苷酸序列；
(4)在固相載體表面點載步驟(3)所述的目的核苷酸序列；(5)在適于與步驟(4)所述的點載在固相載體上的目的核苷酸序列進(jìn)行雜交的條件下，加入經(jīng)標(biāo)記的探針，并使其反應(yīng)足夠時間；(6)檢測雜交反應(yīng)的結(jié)果。(7)將步驟(6)中的基因分型結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀分析軟件進(jìn)行受檢者生物學(xué)性狀分析。所述目的核苷酸序列的制備可包括擴增的步驟，用分離的靶樣本中含核酸的細(xì)胞直接擴增，也可用抽提的靶核酸直接擴增。如用磁珠從全血中分離白細(xì)胞，直接用分離的白細(xì)胞或用全血抽提的核酸作模板，擴增目的核酸序列。擴增得到的單鏈或雙鏈的DNA或RNA 可含有熒光或生物素標(biāo)記，標(biāo)記的DNA或RNA可不經(jīng)純化直接用于雜交。與本發(fā)明中所述芯片雜交的優(yōu)選靶核苷酸分子是單鏈核酸分子，雙鏈核酸分子經(jīng)過變性等處理后也于本發(fā)明所述芯片雜交。目的核苷酸序列可使用任何適當(dāng)?shù)臄U增方法進(jìn)行富集，如聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction，PCR)，多重 PCR，連接酶鏈反應(yīng)(ligase chain reaction， LCR)，滾環(huán)擴增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的擴增(nucleic acid sequence-based amplification， NASBA)，鏈置換擴增(strand displacement amplification，SDA)禾口轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(transcription medicated amplification,TMA)寸。在本發(fā)明的一個實施例中，目的核苷酸序列的制備采用PCR擴增方法，該方法所用引物含有SEQ ID N0:39 SEQ ID NO :78所示序列的核苷酸鏈或其互補鏈。所述探針或目的核苷酸序列都適合用于標(biāo)記。探針在合成引入標(biāo)記，目的核苷酸序列可以在擴增中引入標(biāo)記，或者擴增后用合適的方法引入標(biāo)記。合適的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記、發(fā)色團(tuán)、發(fā)光體、FRET、酶、生物素或有特殊結(jié)合配體的配基。本發(fā)明方法的雜交可在任何適當(dāng)?shù)臏囟认逻M(jìn)行，如25°C 65°C，所述雜交時間為 2分鐘 18小時?？梢愿淖冸s交條件以提高或降低雜交的嚴(yán)謹(jǐn)程度、雜交特異性。本發(fā)明生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，使家長、教師及心理醫(yī)生及時掌握兒童大量遺傳信息，從而可以結(jié)合兒童實際情況，制定個體化的教育培養(yǎng)方案，充分發(fā)揮兒童的優(yōu)勢天賦，取長補短，因材施教，培養(yǎng)兒童健康成長。同時對于心理疾病患者，也可為臨床心理醫(yī)生提供用藥參考。


圖1是本發(fā)明的實施例1中多重PCR擴增后的電泳檢測結(jié)果圖；圖2是本發(fā)明的實施例1中PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測結(jié)果圖；圖3是本發(fā)明實施例1的人生物學(xué)性狀遺傳學(xué)檢測芯片的雜交結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。實施例1反向雜交
1.基因芯片的制備(1)探針溶解將SEQ ID NO :1 SEQ ID NO 38所示序列探針的每條探針用TE溶液稀釋，終濃度為10mM。將濃度為IOmM的探針與濃度為200mM的PBS溶液于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心，_20°C保存，以備點樣使用。(2)點樣將預(yù)先設(shè)計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。片基采用Cell Associates CSS-100醛基片基，GeneMachine公司的OminigridlOO型號的點樣儀，在濕度65-75% (以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25°C的條件下點樣，點樣完畢后，放置半小時后，將芯片取出，室溫干燥保存。2.待測樣品的處理和標(biāo)記(1)人基因組DNA抽提及目的基因的擴增采用FlexiGene DNA Kit (250) (QIAGEN, Cat. No. 51206)試劑盒抽提人外周血中基因組DNA。取Iul進(jìn)行電泳(1%瓊脂糖凝膠，0. 5XTBE，EB，80MV，1. 5小時電泳)，在FR-200 紫外與可見分析裝置上拍攝照片，并對照marker (Lambda DNA/EcoRI+HindIII)進(jìn)行定量。用rs927544 的引物(SEQ ID NO :39、40)、rs363039 的引物(SEQ ID NO :41、 42)、rs363016 的引物(SEQ ID NO :43、44)、COMT Vall58Met 的引物(SEQ ID NO :45、46)、 ADRB2Argl6Gly 的引物(SEQ ID NO 47 48)、SLC6A2T-182C 的引物(SEQ ID NO :49、 50)、rs572227 的引物(SEQ ID NO :51、52)、BDNF Val66Met 的引物(SEQ ID NO :53、54)、 rsl3212041 的引物(SEQ ID NO :55、56)、rs^9;358 的引物(SEQ ID NO :57、58)、rs6323 的引物(SEQ ID NO :59,60)、D4DR C-521T 的引物(SEQ ID NO :61、62)、ACTN3R577X 的引物 (SEQ ID NO :63、64)、ALDH2 Glu504Lys 的引物(SEQ ID NO :65、66)、GSTP I105V 的引物(SEQ ID NO :67、68)、rsl042725 的引物(SEQ ID NO :69、70)、rs2143340 的引物(SEQ ID NO :71、 72)、rsll225308 的引物(SEQ ID NO :73,74)和 rs3791786 的引物(SEQ ID NO :75 76) 進(jìn)行目的核苷酸序列的擴增。PCR擴增用30 μ 1反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0.3mM dNTP、 IOmM Tris-HCl、50mM KCl、2mM MgC12,20% Q solution^jiagen)、上游和下游引物的濃度 0. 16 μ Μ、基因組 DNA 10ng，Taq 酶 0· 6U (Takara)。應(yīng)用 Touch-down PCR 反應(yīng)程序[Don RH, Cox PT,Wainwright BJ,Baker K,Mattick JS. 'Touchdown' PCR to circumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res. 1991,19 :4008] :94 °C 變性 5min ；94°C變性40s，64°C退火lmin,每個循環(huán)降低0. 5°C，72°C延伸50s，共10個循環(huán)；然后 94 V變性40s，59 V退火40s，72°C延伸50s，共30個循環(huán)；最后72°C延伸5min。PCR結(jié)束后用1. 5%瓊脂糖凝膠檢測擴增結(jié)果。當(dāng)進(jìn)行多重PCR反應(yīng)時，將SEQ ID NO 39 SEQ ID NO 78所示序列的引物放入一個反應(yīng)體系中進(jìn)行擴增，體系為50 μ 1。多重PCR的反應(yīng)體系為每種dNTP 0. 3ymol/L, Tricine-KOH (PH8. 7)40mmol/L, KCl 16mmol/L, MgCl23. 5mmol/L, BSA 3. 75μ g/ml，每條引物 2ymol/L，DNA 80ng 和 2· 2 X Titanium Taq DNA 聚合酶(Clontech，USA)。多重 PCR 反應(yīng)條件95°C變性:3min ；95°C變性30s，66 °C退火2min，68°C延伸^iin，共40個循環(huán)；最后 68°C延長lOmin。PCR擴增后，取3 μ 1 PCR反應(yīng)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1。 這些PCR產(chǎn)物經(jīng)處理后可用于下面的雜交步驟。
(2) PCR產(chǎn)物純化和片段化每個樣品的所有PCR產(chǎn)物混合，用QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. No. 28106)純化。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測定濃度后，用DNase I進(jìn)行片段化。片段化的反應(yīng)體系包括30μ 1 純化 PCR 產(chǎn)物(10μ g)，4y 1 的 IOXDNase I 緩沖液，0. 12μ 1 的 DNase I， 5. 88 μ 1的ddH20。反應(yīng)條件為37°C溫浴5min，然后95°C 15min。片段化后的產(chǎn)物跑4% 瓊脂糖凝膠，保證絕大多數(shù)的片段處于30-200個堿基對，電泳檢測結(jié)果如圖2所示。(3)熒光素標(biāo)記利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3’末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記，標(biāo)記的40 μ 1反應(yīng)體系包括 25μ 1片段化PCR產(chǎn)物，8μ 1的5Χ脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液，1 μ 1的CY3-N6_ddCTP (ImM)， 3 μ 1的脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(20U/ μ 1)，3 μ 1的ddH20。反應(yīng)條件為37°C溫浴120min，然后 95°C 加熱 15min。3.雜交、洗滌和結(jié)果檢測熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物95 °C變性lOmin，立即置于冰上，用于雜交，雜交反應(yīng) 20μ 1 體系包括熒光素標(biāo)記的 PCR 產(chǎn)物 15μ 1，20XSSPE 1. 2 μ 1,1% Triton 0. 2μ 1, IOXDenhandtsO. 9μ1，甲酰胺 0. 5μ1，ddH20 2. 2 μ1。反應(yīng)條件為 48°C溫浴 120min，然后相繼用IX洗滌緩沖液I(5XSSC，0. SDS)、1 X洗滌緩沖液II (2XSSC,0. 1 % SDS)和 IX洗滌緩沖液III(IXSSC)在42°C各洗滌lOmin，最后用ddH20洗滌0. 5min。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。掃描雜交后的芯片得到的雜交結(jié)果如圖3所示，再用GenePix Pro 處理圖像得到數(shù)據(jù)文件，然后對數(shù)據(jù)文件利用人生物學(xué)性狀評估軟件(上海芯超生物科技有限公司)進(jìn)行處理就可以得到受檢者生物學(xué)性狀的結(jié)果，從而指導(dǎo)家長、教育學(xué)家或心理醫(yī)生為制定個性化的教育方案或心理治療方案。實施例2正向雜交1.人生物學(xué)性狀相關(guān)基因多態(tài)性的擴增和芯片制備用rs927544 的引物(SEQ ID NO :39,40)、rs363039 的引物(SEQ ID NO :41、 42)、rs363016 的引物(SEQ ID NO :43、44)、COMT Vall58Met 的引物(SEQ ID NO :45、46)、 ADRB2Argl6Gly 的引物(SEQ ID NO 47 48)、SLC6A2T-182C 的引物(SEQ ID NO :49、 50)、rs572227 的引物(SEQ ID NO :51、52)、BDNF Val66Met 的引物(SEQ ID N0:53、54)、 rsl3212041 的引物(SEQ ID NO :55、56)、rs^9;358 的引物(SEQ ID NO :57、58)、rs6323 的引物(SEQ ID NO :59,60)、D4DR C-521T 的引物(SEQ ID NO :61,62)、ACTN3R577X 的引物 (SEQ ID NO :63、64)、ALDH2Glu504Lys 的引物(SEQ ID NO :65、66)、GSTP I105V 的引物(SEQ ID NO :67、68)、rsl042725 的引物(SEQ ID NO :69、70)、rs2143340 的引物(SEQ ID NO :71、 72)、rsll225308 的引物(SEQ ID NO :73,74)和 rs3791786 的引物(SEQ ID NO :75 76) 擴增基因。PCR擴增用100 μ 1反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)體系是0. 3mM dNTP, IOmM Tris-HCl, 50mM KCl,2mM MgCl2, 20% Q solution (Qiagen), 0. 01 μ M SHV-F,0. 2μΜ SHV-R，IOOng 基因組 DNA，3U Ex Taq 酶(Takara)。循環(huán)參數(shù)94°C變性 5min ；94°C變性 40s，65°C退火 lmin, 72°C延伸 lmin，共 40 個循環(huán)；最后 72°C延伸 5min。PCR產(chǎn)物用 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Cat. No. 28106)純化。將純化的PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整至400ng/ μ 1。將濃度為400ng/ μ 1的PCR產(chǎn)物與100 %的DMSO于384孔板中等體積混合，以粘膠片封好384孔板，室溫下振蕩2分鐘，離心。將200ng/ μ 1的PCR產(chǎn)物通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片、硅片等材質(zhì)的固相載體片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型號的點樣儀，在濕度65-75% (以FullMoon片基為準(zhǔn))，溫度為25°C的條件下點樣， 點樣完畢放置半小時后，將芯片放于飽和食鹽水盒中，37°C水化過夜，次日取出，600mJ交聯(lián)，交聯(lián)完畢之芯片即可使用。2.芯片雜交雜交反應(yīng)體系包括2nM熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針(SEQ ID NO :1 SEQ ID NO: 54), 1. 2μ 1 20XSSPE，0. 2μ 1 1 % Triton, 0. 9 μ 1 10 XDenhandts，0. 5 μ 1 甲酰胺，2. 2 μ 1 ddH20。反應(yīng)條件為50°C溫浴2小時，然后相繼用1 X洗滌緩沖液I (5 X SSC, 0. 1 % SDS)、1 X 洗滌緩沖液IK2XSSC，0. 1% SDS)和IX洗滌緩沖液III(IXSSC)在42°C各洗滌IOmin, 最后用ddH20洗滌10秒。洗滌后的芯片，經(jīng)甩干后，用GenePix 4000B共聚焦激光掃描儀進(jìn)行掃描(也可以用其他的激光掃描儀)。實施例3 受檢者生物學(xué)性狀評估樣本一吸煙受檢者(男性，5歲)按照實施例1的檢測操作流程進(jìn)行檢測，其中，該受檢者目的基因多重PCR擴增后的電泳檢測結(jié)果見圖1，PCR產(chǎn)物片段化后的電泳檢測結(jié)果見圖2，檢測芯片雜交結(jié)果見圖 3，電泳檢測基因缺失結(jié)果見圖4。將所得檢測結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀評估軟件，得到本實施例中的受檢者的性格為B，情感為C，智商為A、運動為B、體質(zhì)為C。
權(quán)利要求
1.一種人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，包括步驟1)提取受檢者樣本DNA；2)對樣本DNA進(jìn)行目的基因SNP的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標(biāo)記，所述目的基因 SNP 包括 rs927544、rs363039、rs363016、COMT Vall58Met、ADRB2Argl6Gly、 SLC6A2T-182C、rs572227、BDNF Val66Met、rsl3212041、rs429358、rs6323、D4DR C-521T、 ACTN3R577X、ALDH2Glu504Lys、GSTP I105V、rsl042725、rs2143340、rsll225308 禾口 rs3791786 ；3)熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因芯片雜交，檢測目的基因的SNP位點；4)根據(jù)步驟幻得到的基因分型結(jié)果，評估受檢者的生物學(xué)性狀。
2.如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于所述步驟2)中的rs927544的引物是SEQ ID NO :39 40所示序列的引物，rs363039的引物是SEQ ID NO :41 42所示序列的引物，rs363016的引物是SEQ ID NO 43 44所示序列的引物,COMT Vall58Met的引物是SEQ ID NO :45 46所示序列的引物，ADRB2Argl6Gly的引物是SEQ ID NO 47 48所示序列的引物，SLC6A2T-182C的引物是SEQ ID NO 49 50 所示序列的引物，rs572227的引物是SEQ ID NO :51 52所示序列的引物，BDNF Val66Met 的引物是SEQ ID NO 53 54所示序列的引物，rsl3212041的引物是SEQ ID NO 55 56 所示序列的引物，rs^9358的引物是SEQ ID NO 57 58所示序列的引物，rs6323的引物是SEQ IDN0:59 60所示序列的引物，D4DR C-521T的引物是SEQ ID NO :61 62所示序列的引物，ACTN3R577X的引物是SEQ ID NO 63 64所示序列的引物，ALDH2Glu504Lys的引物是SEQ ID NO 65 66所示序列的引物，GSTP I105V的引物是SEQ IDNO 67 68所示序列的引物，rsl042725的引物是SEQ ID NO 69 70所示序列的引物，rs2143340的引物是SEQ ID NO :71 72所示序列的引物，rs 11225308的引物是SEQ ID NO 73 74)和 rs3791786的引物是SEQ ID NO 75 76所示序列的引物。
3.如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于所述步驟2、中的片段化是將純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)測定濃度后，用DNaseI進(jìn)行片段化；所述熒光素標(biāo)記是將片段化PCR產(chǎn)物利用脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶在3’末端進(jìn)行熒光素標(biāo)記。
4.如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于所述步驟幻基因芯片的制備是將預(yù)先設(shè)計并合成好的探針通過接觸式點樣或噴墨式點樣點載到玻片或硅片材質(zhì)的固相載體片基上，其中，探針是SEQID NO :1 SEQ ID NO 38所示序列的DNA探針。
5.如權(quán)利要求1所述的人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，其特征在于所述步驟4)中的基因分型結(jié)果導(dǎo)入人生物學(xué)性狀評估軟件進(jìn)行受檢者生物學(xué)性狀評估。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人生物學(xué)性狀基因芯片及其檢測套組和方法，包括步驟1)提取受檢者樣本DNA；2)對樣本DNA進(jìn)行目的基因的PCR擴增、純化、片段化及熒光素標(biāo)記；3)熒光素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因芯片雜交，檢測目的基因的SNP位點；4)根據(jù)步驟3)得到的基因分型結(jié)果，評估受檢者的生物學(xué)性狀。通過相關(guān)基因分型，可以對兒童進(jìn)行生物學(xué)性狀預(yù)估，從而制訂最科學(xué)的個體化培養(yǎng)計劃，提高教育培養(yǎng)成功率。
文檔編號C12Q1/68GK102329854SQ20101022477
公開日2012年1月25日 申請日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者盛海輝, 郜恒駿, 陳然 申請人:上海芯超生物科技有限公司