一種檢測犬細(xì)小病毒的基因芯片的制作方法
【專利說明】一種檢測犬細(xì)小病毒的基因芯片
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域以及信息技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測犬細(xì)小病毒的基因芯片。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]基因芯片，是指將許多已知序列寡核苷酸或cDNA片段有規(guī)律地排列在基片上，將待測的樣品與芯片互補(bǔ)配對原則進(jìn)行雜交。通過熒光檢測系統(tǒng)對芯片進(jìn)行掃描，并配以計算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號做出檢測和比較，可以迅速得出實驗結(jié)果。基因芯片可以對大量基因的表達(dá)水平進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效地檢測，且只需要少量樣品?；蛐酒夹g(shù)有效且應(yīng)用廣泛。
[0005]犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus, CPV)是一種主要感染犬的傳染性病毒。該病傳染性強(qiáng)。犬之間通過對于其糞便的直接或間接接觸而傳播該病。沒有母源抗體或疫苗保護(hù)的幼犬的癥狀尤為嚴(yán)重。該病有兩種表現(xiàn)型:心肌炎型與腸炎型。腸炎型的共同癥狀為嚴(yán)重的嘔吐與嚴(yán)重的出血性腹瀉。心肌炎型可以導(dǎo)致幼犬呼吸與心血管的衰竭。疫苗可以防止該病感染，但感染后未經(jīng)治療該病死亡率可達(dá)91%。
[0006]犬細(xì)小病毒有兩種類型:CPV1和CPV2。CPV2引起了這種最嚴(yán)重的疾病，家犬和野生犬類動物均可感染。CPV2有3種變異型:在CPV-2a、CPV_2b和CPV_2c。2a和2b型與CPV2原型的區(qū)別在于其毒力，它們還具有感染貓導(dǎo)致發(fā)病的能力。2c是CPV-2新分離出的變異型，其與2b類似。2c的病毒蛋白與2b有一個氨基酸不同，但這個區(qū)別被認(rèn)為是具有重要意義的。
[0007]通常細(xì)小病毒具有宿主特異性。但是從進(jìn)化的角度看，犬細(xì)小病毒和牛細(xì)小病毒、HBoV具有高度同源性，進(jìn)化距離短，說明人類博卡病毒很可能是犬細(xì)小病毒變異后從犬傳染給人后形成的一種新物種。因此，在未來犬細(xì)小病毒有可能感染人類。
[0008]目前國內(nèi)外的進(jìn)行了較多的各細(xì)小病毒分離株異同及分子生物學(xué)特性，為犬細(xì)小病毒分子生物學(xué)診斷和基因工程疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)；但是，目前的犬細(xì)小病毒檢測技術(shù)是依據(jù)單株病毒或標(biāo)準(zhǔn)株的基因序列分析，達(dá)不到在犬細(xì)小病毒流行時，最大限度地對所有可能成為傳染源的犬細(xì)小病毒進(jìn)行快速生物檢測的技術(shù)要求。因此，有必要建立一整套細(xì)小病毒快速生物檢測系統(tǒng)。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于公開檢測犬細(xì)小病毒(CanineParvovirus, CPV)的基因芯片，其特征在于包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，以及其靶序列的制備。
[0011]本發(fā)明是通過以下方案來實現(xiàn)上述發(fā)明目的:
一種檢測犬細(xì)小病毒的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，以及其靶序列的制備。
[0012]通過以上技術(shù)方案，本發(fā)明首次提供了檢測犬細(xì)小病毒的基因芯片，可快速、敏感、高通量、高效地對入侵病毒進(jìn)行快速檢測。
[0013]
【具體實施方式】
[0014]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，所述的實施例是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0015]1、探針的設(shè)計和制備
a、CPV特異性基因的確立及探針設(shè)計
從Genbank基因文庫獲得CPV的全基因序列及編碼VP1蛋白、VP2蛋白、NS蛋白的基因，針對上述基因分別在經(jīng)NCBI上進(jìn)行Blast分析，分別確定細(xì)小病毒同源基因序列(種屬保守序列)及各細(xì)小病毒特異性基因區(qū)域。
[0016]在其各自的保守區(qū)域中；WCPV核苷酸序列作為CPV探針；探針序列再進(jìn)行Blast軟件分析，更進(jìn)一步確定所選探針區(qū)域均為其各自的保守區(qū)域，無基因變異產(chǎn)生。
[0017]b、探針的制備
針對上述細(xì)小病毒的特異性基因序列，設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定所得PCR產(chǎn)物與預(yù)期設(shè)計一致，純化的PCR產(chǎn)物作為探針。
[0018]從CPV病變細(xì)胞中提取DNA作為模板，nPCR擴(kuò)增CPV探針，以下述引物對擴(kuò)增: 前向引物:cccacataataatgatc ；
后向引物:atgaggttaactaatc ；
前向外弓丨物:atacgaacaaccatccctt ；
后向外引物:acgatggtatactcctagtc ；
PCR擴(kuò)增條件:變性1分鐘，退火1分鐘，延伸1分鐘，70個循環(huán)結(jié)束后延伸10分鐘，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)明亮而均一的條帶。PCR產(chǎn)物試劑盒純化后作為探針備用。
[0019]2、基因芯片的制備
1、溶解探針:探針溶于SSC溶液中；
2、加板:將溶解好的探針加入384孔板的相應(yīng)位置；
3、點(diǎn)樣:通過芯片點(diǎn)樣儀將探針點(diǎn)于芯片不同區(qū)域形成陣列排布；
4、干燥；
5、交聯(lián):將點(diǎn)完樣的醛基玻片放入紫外交聯(lián)儀中，以強(qiáng)度為160mJ的紫外光照射進(jìn)行交聯(lián)。
[0020]3、靶序列的制備
從CPV病變細(xì)胞中提取DNA，以此為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，
前向引物:cccacataataatgatc ； 后向引物:acacgtgcttgtatcctg ；
PCR擴(kuò)增條件:變性1分鐘，退火1分鐘，延伸1分鐘，70個循環(huán)結(jié)束后延伸10分鐘，在PCR循環(huán)過程中制備生物素標(biāo)記的DNA樣品目的片段。
[0021]4、基因芯片檢測 a、分子雜交
在陰性對照(腺病毒基因片段)、空白對照(點(diǎn)樣液)及陽性對照(經(jīng)測序鑒定的基因片段)存在下，生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA芯片進(jìn)行分子雜交。
[0022]b、雜交結(jié)果檢測:
信號檢測:在Ba1基因芯片識讀儀上檢測，檢測圖像經(jīng)數(shù)據(jù)分析，得出雜交檢測結(jié)果。
[0023]以經(jīng)測序鑒定的CPV基因片段作為對照，按照上述的基因芯片制片、分子雜交步驟進(jìn)行，生物素標(biāo)記的CPV擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA芯片進(jìn)行分子雜交；20例CPV檢測樣本及陽性對照均出現(xiàn)雜交信號，且實驗重復(fù)性較好，進(jìn)一步證實了本發(fā)明提供的芯片檢測結(jié)果的可靠性與特異性。
【主權(quán)項】
1.一種檢測犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus,CPV)的基因芯片,其特征在于包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，以及其靶序列的制備。
【專利摘要】本發(fā)明屬于在分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測犬細(xì)小病毒的基因芯片。其特征在于包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，以及其靶序列的制備。本發(fā)明首次提供了針對犬細(xì)小病毒的基因芯片，能夠檢測可能感染犬細(xì)小病毒，以便在犬細(xì)小病毒大規(guī)模流行時，進(jìn)行快速檢測。
【IPC分類】C40B40/06, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN105316768
【申請?zhí)枴緾N201410376281
【發(fā)明人】鄒曉文, 易雪蓮, 嚴(yán)冰冰, 熊玉宇
【申請人】晶能生物技術(shù)（上海）有限公司
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2014年8月3日