專利名稱：木糖氧化無色桿菌及其在降解鄰氨基苯甲酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株木糖氧化無色桿菌菌株及其在降解鄰氨基苯甲酸中的應用。
背景技術：
牛仔布印染廢水含大量靛藍，致使色度較高，且靛藍的可生化性差，很難用微生物 直接處理含靛藍的印染廢水。應用漆酶脫色靛藍處理印染廢水，與目前采用物理的光氧化 法或投化學試劑沉降靛藍的方法處理相比，具有無二次污染、可重復使用、成本低的優(yōu)點， 且目前牛仔布印染廠廢水中不僅僅含有靛藍一種染料，還有大量的硫化黑染料，如果采用 漆酶脫色靛藍，硫化黑就很容易沉淀回收，否則，僅用化學試劑沉淀印染廢水就把兩種染料 沉淀在一起，還需進一步處理此廢棄物。應用漆酶脫色含靛藍的印染廢水，脫色后BOD顯著升高，COD基本不變，仍然較高， 不能達標排放。脫色產物中含有鄰氨基苯甲酸，目前應用漆酶脫色靛藍仍處于研究階段，沒 有治理脫色后產物鄰氨基苯甲酸的方法報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一株木糖氧化無色桿菌菌株及其在降解鄰氨基苯甲酸中的 應用。本發(fā)明提供的菌株為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4，其保 藏登記號為CGMCC Na . 3632。木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 已于 2010 年 02 月 08 日保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū) 北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No . 3632。本發(fā)明提供的應用為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Na . 3632在降解鄰氨基苯甲酸中的應用。所述降解鄰氨基苯甲酸的方法，是將木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632接種到含鄰氨基苯甲酸的體系中培養(yǎng)。所述培養(yǎng)的溫度為10°C -40°C，優(yōu)選為25°C -35°C。所述含鄰氨基苯甲酸的體系中鄰氨基苯甲酸的濃度為500mg/L以下。所述木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 先經 過28°C液體培養(yǎng)24-48h，將培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液以體積百分比為5%接種量接種到含鄰氨基 苯甲酸的體系中。所述液體培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為由牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L和 水組成的培養(yǎng)基。實驗證明，木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGGMCC No . 3632能夠快速高效地降解鄰氨基苯甲酸，可用于生物法處理靛藍經漆酶脫色后的印 染廢水。應用本發(fā)明所用的木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Na . 3632降解鄰氨基苯甲酸，具有降解效率高、成本低廉等優(yōu)點?？蛇m用于含高濃度鄰氨基苯甲酸的體系環(huán)境。


圖1為28 °C,180rpm搖床條件下木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Na . 3632菌株對50-150mg/L鄰氨基苯甲酸的降解曲線。圖2為28 °C,180rpm搖床條件下木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Na . 3632菌株對200_500mG/L鄰氨基苯甲酸的降解曲線。
具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材 料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實施例1、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 的分離、純化及鑒定。2009年5月，應用無菌水將牛仔布印染廢水處理池的活性污泥(采自浙江省海 寧市某牛仔布印染廠)進行稀釋，涂固體培養(yǎng)基(1L固體培養(yǎng)基含牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaCl 5g，瓊脂15g，其余為水)平板，分離到18株菌，采用平板劃線的方法純化菌株。將 分離純化后的18株菌分別用接種環(huán)接入液體培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基含牛肉膏3g，蛋白胨10g， NaCl 5g，其余為水)進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，180rpm培養(yǎng)24h后，以5% (體積百 分比)接種量加入到鄰氨基苯甲酸水溶液中，液相色譜測定結果顯示N4菌株能夠快速高效 地降解鄰氨基苯甲酸，可用于生物法處理靛藍印染廢水。N4菌株生理生化實驗結果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所 示。根據(jù)細胞顯微形態(tài)、生理生化數(shù)據(jù)和16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)，將菌株N4鑒定為木糖氧 化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)，并于2010年02月08日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC No . 3632。表1、理化實驗結果
試驗項目結試驗項目結試驗項目結試驗項目結果果果果細胞形態(tài)桿革蘭氏染色陰氧化酶+接觸酶+狀性對照—D-蜜二糖-P-苯乙醇酸+L-組氨酸-a_環(huán)糊精-甲基葡糖苷-衣康酸+羥基脯氨酸— 實施例2、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Na . 3632 對鄰氨基苯甲酸降解的效果驗證試驗木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632 的培養(yǎng) 基固體培養(yǎng)基(IL)牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15g，其余為水。液體培養(yǎng)基(IL)牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，其余為水。一、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns · 3632 對 100mg/L鄰氨基苯甲酸溶液的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4CGMCC Ns . 3632 接種到液體培養(yǎng)基中，28°C，ISOrpm條件下培養(yǎng)24_48h，至培養(yǎng)液的0D_為0. 6，然后在非無菌環(huán) 境中，將培養(yǎng)液按照體積百分比為5%的量接種到100mg/L鄰氨基苯甲酸的水溶液中，對照 組加入按照體積百分比為5%的蒸餾水，28°C ISOrpm震蕩或者靜置，于不同時間取樣離心， 上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(鄰氨基苯甲酸采用美國Agilent公 司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6X 150mm)，流動相V(甲 醇)V (水)=60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見檢測器，檢測波長為254nm，進 樣量為10 μ L)檢測鄰氨基苯甲酸的含量。液相色譜結果表明，在Ν4菌株的作用下，鄰氨基苯甲酸峰值逐漸變小，而對照組 在實驗前后鄰氨基苯甲酸未有顯著改變。Ν4菌株在100mg/L鄰氨基苯甲酸水溶液中ISOrpm震蕩或靜置培養(yǎng)12h，對鄰氨基 苯甲酸的降解率分別為31. 99%和16. 04%,24h降解率分別為96. 27%和72. 26%，靜置培 養(yǎng)36h，降解率達到96. 53%。同樣實驗條件下的對照組鄰氨基苯甲酸濃度在實驗前后基本 保持不變。二、木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns. 3632在不同 溫度條件下對鄰氨基苯甲酸的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種 到液體培養(yǎng)基中，在28°C，ISOrpm培養(yǎng)24_48h，至培養(yǎng)液的OD6tltl為0. 6，然后在非無菌環(huán) 境中，將培養(yǎng)液按照體積百分比為5%的量接種到100mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液中，分 別在室溫情況下(10°C _20°0、251、301、351或401條件下，180印111震蕩，于不同時間 取樣離心，上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(鄰氨基苯甲酸采用美國 Agilent公司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱(4. 6X 150mm)，流 動相V(甲醇)V(水)=60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見檢測器，檢測波長 為254nm，進樣量為10 μ L)檢測鄰氨基苯甲酸的濃度。結果表明，木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns. 3632 在10°C -40°C均能降解鄰氨基苯甲酸，最適宜溫度范圍為25°C -35°c，24h降解率均在85% 以上；溫度波動幅度較大的室溫情況下(10°C -20°C )，24h降解率為28. 43%,72h降解率為 89. 18% ；40°C條件下24h降解率為22. 61%,48h降解率為92. 26%。三、木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)N4 CGMCC Ns. 3632對不同 濃度鄰氨基苯甲酸的降解將木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 接種 在液體培養(yǎng)基中，在28 °C，ISOrpm培養(yǎng)24_48h，至培養(yǎng)液的OD6tltl為0. 6，然后在非無菌環(huán) 境中，將培養(yǎng)液按照體積百分比為5 %的量分別接種到50mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/ L、200mg/L、300mg/L、400mg/L 或 500mg/L 的鄰氨基苯甲酸水溶液中，28 °C，180rpm 震蕩， 于不同時間取樣離心，上清液用0. 22um微孔濾膜過濾，應用高效液相色譜儀(鄰氨基苯 甲酸采用美國Agilent公司Agilent 1200高效液相色譜儀進行分析，色譜柱為C18柱 (4. 6 X 150mm)，流動相V (甲醇)V(水)=60 40，流速lmL/min，檢測器為UV-可見 檢測器，檢測波長為254nm，進樣量為IOyL)檢測鄰氨基苯甲酸的濃度。結果如圖1和圖2所示，對50mg/L、75mg/L、100mg/L禾口 150mg/L的鄰氨基苯甲 酸水溶液16h的降解率分別為61. 19%,49. 73%,46. 49%和8. 09%,24h的降解率分別為
694. 05%,95. 06%,96. 27%和18. 69%，對150mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液32h的降解率為 93% ；對200mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液Id的降解率為4. 64%,2d的降解率為97. 92% ； 對300mg/L、400mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液前3d未見降解，在第4d —天內完全降解；對 500mg/L的鄰氨基苯甲酸水溶液，則前4d未見降解，而在第5d—天內完全降解。
權利要求
木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC №.3632在降解鄰氨基苯甲酸中的應用。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于所述降解鄰氨基苯甲酸的方法，是將木糖 氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC Ns . 3632接種到含鄰氨基苯甲酸 的體系中培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為10°C-40°C。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為25°C_35°C。
5.根據(jù)權利要求2-4中的任意一項所述的應用，其特征在于所述含鄰氨基苯甲酸的 體系中鄰氨基苯甲酸的濃度為500mg/L以下。
6.根據(jù)權利要求2-5中任意一項所述的應用，其特征在于所述木糖氧化無色桿菌 (Achromobacter xylosoxidans) N4 CGMCC Ns · 3632 先經過 28°C液體培養(yǎng) 24-48 小時，再接 種到含鄰氨基苯甲酸的體系中。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于所述液體培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為由牛肉膏3g/ L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L和水組成的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株木糖氧化無色桿菌在降解鄰氨基苯甲酸中的應用。該菌株為木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4，其保藏登記號為CGMCC No.3632。木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)N4 CGMCC No.3632能夠快速高效地降解鄰氨基苯甲酸，可用于生物法處理靛藍印染廢水。
文檔編號C12R1/025GK101914466SQ20101022456
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月2日 優(yōu)先權日2010年7月2日
發(fā)明者常勝和, 李宗偉, 李月艷, 王雁萍, 秦廣雍, 董湘熔, 談重芳 申請人:鄭州大學