專(zhuān)利名稱(chēng)：禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
泰樂(lè)菌素是美國(guó)于1959年從弗氏鏈霉菌(Sti^ptomyces fradiae)的培養(yǎng)液中獲得的一種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素。泰樂(lè)菌素為一種白色板狀結(jié)晶，微溶于水，呈堿性，產(chǎn)品有酒石酸鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽及乳酸鹽，易溶于水。泰樂(lè)菌素的水溶液在25°C、pH為 5. 5 7. 5時(shí)可保存3個(gè)月，但是若水溶液中含有鐵、銅等金屬離子時(shí)，會(huì)使本品失效。泰樂(lè)菌素具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，改善飼料效率，防治雞的慢性呼吸道疾病及預(yù)防豬赤痢和細(xì)菌性肺炎等作用，是一種禽畜專(zhuān)用的抗菌促生劑，成為畜禽飼料添加劑的主要品種之一。但泰樂(lè)菌素為堿性和脂溶性藥物，在體內(nèi)分布容積較高，易發(fā)生蓄積和慢性中毒， 引起肝損害和聽(tīng)覺(jué)障礙。美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定，泰樂(lè)菌素在可食組織和蛋白中的殘留允許濃度為0. 2ppm，在乳中為0. 05ppm。中國(guó)農(nóng)業(yè)部規(guī)定該藥物的最高殘留限量為100yg/kg。現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)泰樂(lè)菌素殘留量的方法多采用色譜法或檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)不便，成本高昂。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)不便，成本高昂的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明涉及的禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，包括如下步驟步驟一，將樣品均質(zhì)，加水混勻，靜置離心，取上清為樣液；步驟二，制備藤黃微球菌的菌懸液；步驟三，確定藤黃微球菌菌懸液的最佳用量，之后利用培養(yǎng)基制備檢定用平板；所述培養(yǎng)基具體為將蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、胰水解酪蛋白、瓊脂及蒸餾水混合，之后高壓滅菌即得；步驟四，確定標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，取樣液，涂布于檢定用平板上，培養(yǎng)，測(cè)定抑菌圈直徑，由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程換算得出泰樂(lè)菌素殘留量。優(yōu)選地，步驟三中，所述確定藤黃微球菌菌懸液的最佳用量具體為用0. lyg/ml 泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)加有不同量藤黃微球菌的菌懸液的平板進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)培養(yǎng)后，能在平板上產(chǎn)生直徑> IOmm清晰、完整的抑菌圈的菌懸液用量即為最佳用量。優(yōu)選地，步驟三中，所述制備檢定用平板包括如下步驟第一步，將熔化的培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中，靜置得凝固的培養(yǎng)基；第二步，將最佳用量的藤黃微球菌菌懸液加入到冷卻至45 50°C的熔化培養(yǎng)基中，混合，得混合液；第三步，將混合液加入到凝固的培養(yǎng)基中，靜置得檢定用平板。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基的制備方法為1L培養(yǎng)基的制備包括如下步驟，取6g蛋白胨、1. 5g牛肉浸膏、3g酵母浸膏、Ig葡萄糖、4g胰水解酪蛋白及15g瓊脂，混合，之后加蒸餾水至1000ml, 121°C高壓滅菌15min即得。優(yōu)選地，步驟四中，所述標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y = 9. 4757x-14. 049，其中r = 0. 9982， χ為抑菌圈直徑，y為10倍泰樂(lè)菌素溶液濃度的對(duì)數(shù)值。本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的檢測(cè)方法使用的均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，簡(jiǎn)單易行，同時(shí)成本低廉，便于大范圍推廣使用。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例本實(shí)施例中涉及的儀器如下牛津杯，不銹鋼小管，外徑(8士0. l)mm，內(nèi)徑(6士0. l)mm，高(10士0. l)mm0培養(yǎng)皿，直徑約90mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦蓋。均質(zhì)器，轉(zhuǎn)速不低于10，OOOrpm0離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于8，OOOrpm0藤黃微球菌購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)生物藥品檢定所，型號(hào)CMMCCQ8001)。1、制備樣液將試樣均質(zhì)1分鐘后，稱(chēng)取20g于離心管中，加入5ml水，充分?jǐn)噭?，放?0min后， 8000rpm離心20min，取上清液作為樣液。2、制備菌懸液用約3ml培養(yǎng)基II將培養(yǎng)基I試管斜面上的藤黃微球菌培養(yǎng)物洗下，并移種到克氏瓶中的IOOml培養(yǎng)基I的表面上，用滅菌玻璃珠使其均勻地鋪于整個(gè)表面，在36°C培養(yǎng) 24h后，用約15ml滅菌生理鹽水洗下瓊脂表面的培養(yǎng)物，制成藤黃微球菌菌懸液，置4°C冰箱中可保存2周。所述培養(yǎng)基I的配制方法如下取蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化鈉2. 5g，瓊脂 15g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)pH為6. 9 7. 1，分裝于試管或克氏瓶中，121°C高壓滅菌15min 即得。所述培養(yǎng)基II的配制方法如下取蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，氯化鈉2. 5g，加蒸餾水至1000ml，調(diào)pH為8. 5左右，分裝于試管中，121 °C高壓滅菌15min即得。3、制備檢定用平板用0. 1 μ g/ml的泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液(當(dāng)天配置并使用)對(duì)加有不同量的藤黃微球菌菌懸液的平板進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)培養(yǎng)后能使0. 1 μ g/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液在平板上產(chǎn)生直徑 ^ IOmm清晰、完整的抑菌圈的藤黃微球菌菌懸液用量為最佳用量。將IOml熔化的培養(yǎng)基III注入培養(yǎng)皿中，靜置得凝固的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基III的制備方法為1L培養(yǎng)基的制備包括如下步驟，取6g蛋白胨、 1.5g牛肉浸膏、3g酵母浸膏、Ig葡萄糖、4g胰水解酪蛋白及15g瓊脂，混合，之后加蒸餾水至1000ml, 121 °C高壓滅菌15min即得；將最佳用量的藤黃微球菌菌懸液加入到冷卻至45 50°C的熔化培養(yǎng)基中，混合，得混合液；取約細(xì)1混合液加入到凝固的培養(yǎng)基中，保持水平，使其凝固，靜置得檢定用平板。4、采用常規(guī)方法得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程用泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，以0. 2 μ g/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液為參考濃度，以0. 05 μ g/ml濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作陰性對(duì)照，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度取3個(gè)檢定用平板作為一組，每個(gè)平板上置4個(gè)牛津杯，使得牛津杯在半徑為2. 5cm的圓面呈90度的角間距， 對(duì)角兩個(gè)杯中加入0. 2 μ g/ml的參考濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，另兩個(gè)對(duì)角杯中加入另一種濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。4個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液共12個(gè)檢定平板，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中0.2yg/ml參考濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液將得到M個(gè)抑菌圈直徑的數(shù)值，而其他標(biāo)準(zhǔn)工作液分別得到6個(gè)抑菌圈直徑的數(shù)值。蓋好陶瓦蓋，置(36士 1)°C下培養(yǎng)18h。翻轉(zhuǎn)平板，取出牛津杯，精確地測(cè)量各個(gè)濃度產(chǎn)生的抑菌圈直徑，求得各自的平均值，再求出0. 2 μ g/ml參考濃度M個(gè)抑菌圈直徑的平均值。結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y = 9. 4757x-14. 049，其中r = 0. 9982，χ為抑菌圈直徑，y為10倍泰樂(lè)菌素溶液濃度的對(duì)數(shù)值。5、測(cè)定樣液中的泰樂(lè)菌素殘留量取步驟1中的樣液體，按步驟4的方法測(cè)定抑菌圈直徑，結(jié)果抑菌圈直徑平均為 17. 98mm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線換算得到樣液中泰樂(lè)菌素的殘留量為0. 4 μ g/ml。綜上可知，本發(fā)明的檢測(cè)方法使用的均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，非常簡(jiǎn)便易行，同時(shí)使用的試劑也均為常規(guī)試劑，檢測(cè)成本低廉，便于大范圍推廣使用。
權(quán)利要求
1.一種禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將樣品均質(zhì)，加水混勻，靜置離心，取上清為樣液；步驟二，制備藤黃微球菌的菌懸液；步驟三，確定藤黃微球菌菌懸液的最佳用量，之后利用培養(yǎng)基制備檢定用平板；所述培養(yǎng)基具體為將蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、胰水解酪蛋白、瓊脂及蒸餾水混合，之后高壓滅菌即得；步驟四，確定標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，取樣液，涂布于檢定用平板上，培養(yǎng)，測(cè)定抑菌圈直徑，由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程換算得出泰樂(lè)菌素殘留量。
2.如權(quán)利要求1所述的禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟三中，所述確定藤黃微球菌菌懸液的最佳用量具體為用0. 1 μ g/ml泰樂(lè)菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)加有不同量藤黃微球菌的菌懸液的平板進(jìn)行測(cè)試，經(jīng)培養(yǎng)后，能在平板上產(chǎn)生直徑> IOmm清晰、 完整的抑菌圈的菌懸液用量即為最佳用量。
3.如權(quán)利要求1或2所述的禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟三中，所述制備檢定用平板包括如下步驟第一步，將熔化的培養(yǎng)基注入培養(yǎng)皿中，靜置得凝固的培養(yǎng)基；第二步，將最佳用量的藤黃微球菌菌懸液加入到冷卻至45 50°C的熔化培養(yǎng)基中，混合，得混合液；第三步，將混合液加入到凝固的培養(yǎng)基中，靜置得檢定用平板。
4.如權(quán)利要求1所述的禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的制備方法為1L培養(yǎng)基的制備包括如下步驟，取6g蛋白胨、1. 5g牛肉浸膏、3g酵母浸膏、Ig葡萄糖、4g胰水解酪蛋白及15g瓊脂，混合，之后加蒸餾水至1000ml，121°C高壓滅菌 15min即得。
5.如權(quán)利要求1所述的禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟四中，所述標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為y = 9. 4757x-14. 049，其中r = 0. 9982，χ為抑菌圈直徑，y為10倍泰樂(lè)菌素溶液濃度的對(duì)數(shù)值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域的禽蛋中泰樂(lè)菌素殘留量的檢測(cè)方法，包括如下步驟步驟一，將樣品均質(zhì)，加水混勻，靜置離心，取上清為樣液；步驟二，制備藤黃微球菌的菌懸液；步驟三，確定藤黃微球菌菌懸液的最佳用量，之后利用培養(yǎng)基制備檢定用平板；步驟四，確定標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，取樣液，涂布于檢定用平板上，培養(yǎng)，測(cè)定抑菌圈直徑，由標(biāo)準(zhǔn)回歸方程換算得出泰樂(lè)菌素殘留量。本發(fā)明的檢測(cè)方法使用的均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)設(shè)備，簡(jiǎn)單易行，同時(shí)成本低廉，便于大范圍推廣使用。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102337322SQ20101023791
公開(kāi)日2012年2月1日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者丁國(guó)才, 沙飛翔, 郭景鵬 申請(qǐng)人:上海海帝園藝有限公司