專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
豬瘟(ClassicalSwine Fever, CSF)是由豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus， CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國(guó)家和地區(qū)均有發(fā) 生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通 報(bào)性疫病，我國(guó)將其劃為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。
目前世界上主要有3種效果較好的豬瘟活疫苗，即日本的GPE株、法國(guó)的 Thiverval株和中國(guó)的兔化弱毒株(C株)，其中兔化弱毒株應(yīng)用最為廣范并為世界上許多 國(guó)家豬瘟的控制和消滅做出了重要貢獻(xiàn)。目前，我國(guó)也實(shí)行強(qiáng)制免疫豬瘟弱毒活疫苗作 為控制豬瘟的主要手段。
雖然三種疫苗均能有效用于豬瘟防制，但也都存在著一定不足。其中GPE株、 Thiverval株是用豬源傳代細(xì)胞系生產(chǎn)的，其存在已知或未知外源病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)較大， 一旦控制不好，很容易導(dǎo)致某種已有的或新發(fā)現(xiàn)的傳染病大面積流行。其中兔化弱毒活 疫苗目前有兩種生產(chǎn)工藝，第一種工藝是用兔體生產(chǎn)，取接種家兔的組織或淋巴結(jié)或脾 臟制苗，該工藝可以有效避免外源病毒污染，同時(shí)保證了病毒的遺傳穩(wěn)定性，病毒毒力 不返強(qiáng)，但需要使用大量家兔，質(zhì)量控制難度較高且生產(chǎn)成本較高；第二種工藝是應(yīng)用 牛、羊原代細(xì)胞或豬傳代細(xì)胞生產(chǎn)，該工藝避免大量使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但存在外源病毒污 染的風(fēng)險(xiǎn)(因?yàn)榕?、羊原代?xì)胞或豬傳代細(xì)胞對(duì)很多已知或未知的外源病毒易感)并且病 毒遺傳穩(wěn)定性稍差，病毒有獨(dú)立返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。另外，豬瘟兔化弱毒是經(jīng)過(guò)兔體連續(xù)傳代 馴化而成的，種毒并未經(jīng)過(guò)克隆純化，因次不同批次的種毒對(duì)同一批家兔或同一批次的 種毒對(duì)不同批次的家兔感染性和免疫原性往往存在一定差異。由此可見(jiàn)，亟需一種新的 豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝來(lái)克服已有的幾種疫苗存在的不足。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服豬瘟活疫苗現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的不足之處，提供一種用克隆化 豬瘟兔化弱毒種毒接種兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液生產(chǎn)豬瘟活疫苗 的方法。該方法具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易于質(zhì)量控制、外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)小、生產(chǎn)成本低 等特點(diǎn)。利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗遺傳穩(wěn)定性好、純凈性高、病毒效價(jià)高、免疫原 性強(qiáng)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是用豬瘟兔化弱毒株病毒經(jīng)過(guò)病毒終點(diǎn)稀釋技術(shù)獲得的一 株獲得高度適應(yīng)兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞、基因型單一并且能穩(wěn)定遺傳的純系豬瘟兔化弱毒 克隆株CSFVCC-1，該病毒株已于2010年7月沈日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.4058，將CSFV CC_1通過(guò)兔源細(xì)胞和/或常用 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液；將收獲的病毒液加入常用的凍干保護(hù)劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍真空干燥而制成凍干活疫苗，每頭份含毒量不低于6000TCID5(i或400RID。
本發(fā)明的詳細(xì)描述
1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定
1.1豬瘟兔化弱毒的克隆
用終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行。
(1)在M孔細(xì)胞板中置入細(xì)胞培養(yǎng)載波片，并接種適量的兔源細(xì)胞或常用細(xì) 胞，在CO2培養(yǎng)箱37°C將細(xì)胞培養(yǎng)至單層；
(2)將豬瘟病毒兔化弱毒株種毒(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保藏和供應(yīng)，CVCC AV1412)稀釋至0.1TCID50/0.1ml,以0.1ml/孔劑量接種(1)細(xì)胞板；
(3)置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)3d，取出各孔培養(yǎng)液及細(xì)胞載波片；
(4)將細(xì)胞載波片固定，進(jìn)行豬瘟熒光抗體染色；
(5)將熒光染色陽(yáng)性孔的培養(yǎng)液再進(jìn)行稀釋接種置入細(xì)胞培養(yǎng)載波片的M孔 板，進(jìn)行再次克??；
(6)反復(fù)進(jìn)行3 5次，即獲得克隆化豬瘟兔化弱毒種毒，命名為CSFV CC-I (本毒株已于2010年7月沈日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，保減號(hào)為CGMCCNo.4058)；
1.2克隆株的鑒定
經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-I具有以下特性
(1)對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-I接種兔源細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣 測(cè)定毒價(jià)，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)最高毒價(jià)M06°TCID5(l/0.1ml，經(jīng)微載體或懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià) >1068TCID50/0.1ml ；將CSFV CC-1接種常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測(cè)定毒價(jià)，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶 培養(yǎng)最高毒價(jià)M05°TCID5(l/0.1ml，經(jīng)微載體或懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)M06°TCID5(l/0.1ml ；
(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-I經(jīng)兔源細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定，第 30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99.9%，氨基酸同源性為100%;將CSFV CC-I 經(jīng)常用細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定，第30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為 99.5%,氨基酸同源性為99.9% ；
(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-I進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑 制該種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-I以15TCID5(I(或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家 兔，結(jié)果95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；
(4)免疫原性將CSFV CC-I以150 RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康 豬，抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時(shí)間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門(mén) 血毒(IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫《41 %且持續(xù)不超過(guò)3d ；
(5)安全性將 CSFV CC-I (>105'°TCID50/0.1ml) IOml 注射家兔、IOOml 注射 豬、5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；
2疫苗的制備
2.1種毒的繁殖
將CSFV CC-I種子批種毒接種生長(zhǎng)良好的兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞的種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后收毒，作為生產(chǎn)用種毒；
種毒檢驗(yàn)按《中華人民共和國(guó)獸藥典》(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二〇〇五年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明以下簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)獸藥典》)規(guī) 定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；
2.2生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)
種子批細(xì)胞經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，形成單層或生長(zhǎng)至合適密度時(shí)， 用于繼續(xù)傳代或接種病毒；
細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì)胞 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；
2.3生產(chǎn)用病毒液的繁殖
將生產(chǎn)種毒接種生長(zhǎng)良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，3 4天后收獲病毒 液，-15°C以下保存；
生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無(wú)菌檢驗(yàn) 和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量不少于60000 (或4000RID)；
2.4配苗、分裝和凍干
將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含 毒量不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；
成品檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病 毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，應(yīng)不引起明顯癥狀；每頭份含毒量不少于 6000TCID50 (或 400RID)。
本發(fā)明涉及的一些專(zhuān)用詞的界定
1.兔源細(xì)胞是指兔原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞；
2.常用細(xì)胞是指牛睪丸原代細(xì)胞、羊睪丸原代細(xì)胞、羊腎原代細(xì)胞、牛BT細(xì) 胞系、豬SK-6細(xì)胞系、豬ST細(xì)胞系、豬PK-15細(xì)胞系、豬IBRS-2細(xì)胞系；
3.細(xì)胞培養(yǎng)是指細(xì)胞在適宜的溫度和密度下，經(jīng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)或細(xì)胞微載體培養(yǎng) 或細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。
本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明通過(guò)將豬瘟兔化弱毒克隆，獲得高度適應(yīng)細(xì)胞并且能穩(wěn)定遺傳的純系種 毒，再接種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，生產(chǎn)病毒液，最后配苗、分裝、凍干。與現(xiàn)有技術(shù)相 比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
(1)相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，保證了種毒的遺傳和生物表現(xiàn) 型的單一性，提高了疫苗的遺傳穩(wěn)定性和生物安全性；
(2)相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，生產(chǎn)的病毒液毒價(jià)更高，單位 體積內(nèi)的疫苗有效成分含量更高；
(3)相對(duì)于已有技術(shù)，本發(fā)明克隆、純化了種毒，疫苗免疫原性更穩(wěn)定、可靠；
(4)相對(duì)于已有的兔體制苗技術(shù)，本發(fā)明生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，避免了飼養(yǎng)動(dòng)物、觀測(cè) 動(dòng)物等長(zhǎng)時(shí)間、高強(qiáng)度勞動(dòng)，降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)降低了細(xì)菌、霉菌和支原體污染的 風(fēng)險(xiǎn)。具體實(shí)施例
本發(fā)明的實(shí)施例為進(jìn)一步描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定
1.1豬瘟兔化弱毒的克隆
用終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行。
(1)在M孔細(xì)胞板中置入細(xì)胞培養(yǎng)載波片，按0.4ml/孔接種RK-13細(xì)胞系，在 CO2培養(yǎng)箱37°C將細(xì)胞培養(yǎng)至單層；
(2)將豬瘟病毒兔化弱毒株種毒(CVCC AV1412)稀釋至0.1TCID5Q/0.1ml，以 0.1ml/孔劑量接種(1)細(xì)胞板；
(3)置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)3d，取出各孔培養(yǎng)液及細(xì)胞載波片；
(4)將細(xì)胞載波片固定，進(jìn)行豬瘟熒光抗體染色；
(5)將熒光染色陽(yáng)性孔的培養(yǎng)液再進(jìn)行稀釋接種置入細(xì)胞培養(yǎng)載波片的M孔 板，進(jìn)行再次克隆；
(6)反復(fù)進(jìn)行5次，即獲得克隆化豬瘟兔化弱毒種毒，命名為CSFV CC-I ；
1.2克隆株的鑒定
經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-I具有以下特性
(1)對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-I接種RK-13細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測(cè)定毒價(jià)，經(jīng)懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)MO68TCID5tlAumI ；
(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-I經(jīng)RK-13細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定， 第30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99.9%，氨基酸同源性為100% ；
(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-I進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑 制該種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-I以15TCID5(I(或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家 兔，結(jié)果95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；
(4)免疫原性將CSFV CC-I以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康 豬，抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時(shí)間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門(mén) 血毒(IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫《41 %且持續(xù)不超過(guò)3d ；
(5)安全性將 CSFV CC-I (>105'°TCID50/0.1ml) IOml 注射家兔、IOOml 注射 豬、5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；
2疫苗的制備
2.1種毒的繁殖
將CSFV CC-I種子批種毒接種生長(zhǎng)良好的RK-13種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后 收毒，作為生產(chǎn)用種毒；
種毒檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源 病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；
2.2生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)
種子批細(xì)胞RK-13經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生長(zhǎng)至合適密度時(shí)， 用于繼續(xù)傳代或接種病毒；
細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì) 胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；
2.3生產(chǎn)用病毒液的繁殖6
將生產(chǎn)種毒接種生長(zhǎng)良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3 4天后收獲病 毒液，_15°C以下保存；
生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢 驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；
2.4配苗、分裝和凍干
將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含 毒量不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；
成品檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源 病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，結(jié)果不引起明顯癥狀；每頭份含毒量> 6000TCID50 (或 400RID)。
實(shí)施例1
1豬瘟兔化弱毒的克隆與鑒定
1.1豬瘟兔化弱毒的克隆
用終點(diǎn)稀釋法進(jìn)行。
(1)在M孔細(xì)胞板中置入細(xì)胞培養(yǎng)載波片，按0.4ml/孔接種SK-6細(xì)胞系，在 CO2培養(yǎng)箱37°C將細(xì)胞培養(yǎng)至單層；
(2)將豬瘟病毒兔化弱毒株種毒(CVCC AV1412)稀釋至0.1TCID5Q/0.1ml，以 0.1ml/孔劑量接種(1)細(xì)胞板；
(3)置CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)3d，取出各孔培養(yǎng)液及細(xì)胞載波片；
(4)將細(xì)胞載波片固定，進(jìn)行豬瘟熒光抗體染色；
(5)將熒光染色陽(yáng)性孔的培養(yǎng)液再進(jìn)行稀釋接種置入細(xì)胞培養(yǎng)載波片的M孔 板，進(jìn)行再次克??；
(6)反復(fù)進(jìn)行5次，即獲得克隆化豬瘟兔化弱毒種毒，命名為CSFV CC-I ；
1.2克隆株的鑒定
經(jīng)鑒定，克隆株CSFV CC-I具有以下特性
(1)對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性將CSFV CC-I接種SK-6細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并取樣測(cè)定毒 價(jià)，經(jīng)懸浮培養(yǎng)最高毒價(jià)M06°TCID50/0.1ml ；
(2)遺傳穩(wěn)定性將CSFV CC-I經(jīng)SK-6細(xì)胞連續(xù)傳代并進(jìn)行基因序列測(cè)定，第 30代與第1代克隆化種毒核苷酸同源性為99.5%，氨基酸同源性為99.9% ；
(3)生物學(xué)特性將CSFV CC-I進(jìn)行豬瘟抗體抑制試驗(yàn)，豬瘟抗體能特異性抑 制該種毒的熒光產(chǎn)生；將CSFV CC-I以15TCID5(I(或1RID) /只的劑量靜脈接種健康家 兔，結(jié)果95%產(chǎn)生定型熱或輕型熱；
(4)免疫原性將CSFV CC-I以150RID/只的免疫劑量肌肉接種非免疫健康 豬，抗體平均最高滴度達(dá)到1 128，平均持續(xù)時(shí)間為400d;免疫后2周攻Iml豬瘟石門(mén) 血毒(IO5MLD/Iml)，100%保護(hù)，最高體溫《41 %且持續(xù)不超過(guò)3d ；
(5)安全性將 CSFV CC-I (>105'°TCID50/0.1ml) IOml 注射家兔、IOOml 注射 豬、5ml注射豚鼠、Iml注射小鼠均不引起死亡；
2疫苗的制備
2.1種毒的繁殖
將CSFV CC-I種子批種毒接種生長(zhǎng)良好的SK-6種子批細(xì)胞，培養(yǎng)3 4天后 收毒，作為生產(chǎn)用種毒；
種毒檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源 病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；
2.2生產(chǎn)用細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)
種子批細(xì)胞SK-6經(jīng)消化、分散后，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，生長(zhǎng)至合適密度時(shí)，用 于繼續(xù)傳代或接種病毒；
細(xì)胞檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合生產(chǎn)、檢驗(yàn)用細(xì) 胞標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；
2.3生產(chǎn)用病毒液的繁殖
將生產(chǎn)種毒接種生長(zhǎng)良好的生產(chǎn)用細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，3 4天后收獲病 毒液，-15°C以下保存；
生產(chǎn)用病毒液檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢 驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；并且每ml含毒量> 60000TCID5(1 (或4000RID)；
2.4配苗、分裝和凍干
將檢驗(yàn)合格的病毒液，加入適當(dāng)穩(wěn)定劑和抗菌素，混勻，定量分裝，每頭份含 毒量不低于6000TCID5(1 (或400RID)，冷凍真空干燥即成；
成品檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果符合無(wú)菌檢驗(yàn)和外源病毒 檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；用10頭份注射敏感子豬，結(jié)果不引起明顯癥狀；每頭份含毒量> 6000TCID50 (或 400RID)。
權(quán)利要求
1.一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是用豬瘟兔化弱毒株病毒經(jīng)過(guò)病毒終點(diǎn)稀釋 技術(shù)獲得的一株豬瘟兔化弱毒克隆株CSFV CC-1，該病毒株已于2010年7月26日保藏在 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.4058，將CSFV CC-I通過(guò)兔源細(xì)胞和/或常用細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲病毒液；將收獲的病毒液加入常 用的凍干保護(hù)劑，充分混合后分裝后經(jīng)冷凍真空干燥而制成凍干活疫苗，每頭份含毒量 不低于 6000TCID5(i 或 400RID。
2.按照權(quán)利要求1所述的一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征是生產(chǎn)豬瘟活疫苗所用 一株CGMCC No.4058豬瘟兔化弱毒克隆株病毒是通過(guò)應(yīng)用終點(diǎn)稀釋法將豬瘟兔化弱毒進(jìn) 行克隆，獲得高度適應(yīng)兔源細(xì)胞或常用細(xì)胞、基因型單一并且能穩(wěn)定遺傳的純系豬瘟兔 化弱毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬瘟活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明包括以下技術(shù)步驟(1)豬瘟兔化弱毒株的克隆與鑒定；(2)克隆株種毒的繁殖；(3)生產(chǎn)用細(xì)胞的繁殖；(4)生產(chǎn)用病毒液的繁殖；(5)配苗、分裝和凍干。本發(fā)明具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，病毒免疫原性和遺傳穩(wěn)定性好，外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)小，檢驗(yàn)方便，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。利用本發(fā)明生產(chǎn)的豬瘟活疫苗遺傳穩(wěn)定性好、純凈性高、免疫原性強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N7/04GK102018957SQ201010237909
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月28日
發(fā)明者關(guān)孚時(shí), 戴志紅, 李翠, 王在時(shí), 秦玉明, 蔣卉, 趙耘 申請(qǐng)人:中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所