專利名稱：從紅光熊蜂蜂毒中分離的作為纖維蛋白原和纖維蛋白溶解酶的絲氨酸蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從一種熊蜂，紅光熊蜂中分離得到的絲氨酸蛋白酶，所述絲氨酸蛋白 酶能夠激活凝血酶原并能夠直接降解纖維蛋白原和纖維蛋白。
背景技術(shù)：
蜂能夠使用它們體內(nèi)攜帶的蜂毒作為有力的防御手段來保護(hù)其領(lǐng)地免受入 侵者，如其他昆蟲和動物的的侵犯。蜂毒包括多種不同的蜂毒蛋白或肽，例如，蜂毒肽 [Gauldie et al.，Eur. J. Biochem.，61 :369-376 (1976)]、磷脂酶 A2 (PLA2) Six & Dennis, Biochim.Biophys. Acta 1488 :1-19 (2000) ] > _ 明月太[Banks et al. , Nature 282 415-417 (1979)]、透明質(zhì)酸酶[Krei 1, Protein Sci.，4 1666-1669 (1995)]、絲氨酸蛋白酶 [ffinningham KM et al. J Allergy ClinImmunol 2004 ；114 :928-33]等。在東方國家，已經(jīng)對蜂毒的多種成分進(jìn)行了研究以尋找它們在醫(yī)藥領(lǐng)域的用途 [Mirshafiey A. Neuropharmacology 2007;53:353-61]。特別是被用于養(yǎng)蜂業(yè)和授粉昆 蟲的蜜蜂和熊蜂與人類的關(guān)系更為密切[Velthuis HHW et al. JApidologie2006 ；37 421-51]。相比較，蜜蜂能釋放出至少五倍于熊蜂的毒液，然而熊蜂能夠多次釋放毒液而不 失去它的刺[Hoffman DR et al. Ann Allergy 1984;52:276-8]。存在于熊蜂毒液中的絲 氨酸蛋白酶與磷脂酶A2 (PLA2)和bombolitin —樣，是毒液的主要成分之一 [Hoffman DR et al.J Allergy Clin Immunol 2001；108 :855-60]。絲氨酸蛋白酶能在多種活生物體中發(fā)現(xiàn)，其具有的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征在于包括 His、Asp和Ser在內(nèi)的氨基酸殘基是保守的。絲氨酸蛋白酶具有多種功能，在消化、免疫響 應(yīng)、補(bǔ)體、細(xì)胞分化和止血中都有重要作用[NeurathH. et al. Science 1984 ；224 :350-7 ； Krem MM. et al. Trends Biochem Sci 2002;27:67-74]。特別是，在被視為主要毒素之一 的蛇毒中存在的絲氨酸蛋白酶已知在哺乳動物的止血和血栓形成中發(fā)揮作用[Braud S et al. (2000)Biochimie82 :851-859 ；Matsui T et al. (2000)Biochim Biophys Acta 1477 146-156 ；Kini RM(2005)Pathophysiol Haemost Thrornbo 34 :200-204 ；Swenson S et al. (2005)Toxicon 45:1021-1039]。然而，絲氨酸蛋白酶的基因和其在止血和血栓形成中 的作用尚不清楚。

發(fā)明內(nèi)容
通過發(fā)現(xiàn)了在一種熊蜂，紅光熊蜂的蜂毒中的絲氨酸蛋白酶能夠激活凝血酶原并 能夠直接降解纖維蛋白原和纖維蛋白，進(jìn)而能夠影響血液凝固過程，由此完成了本發(fā)明。因此，一個方面，本發(fā)明提供了如SEQ. ID. NO. 1所示的，從紅光熊蜂中獲取的絲氨 酸蛋白酶，所述絲氨酸蛋白酶能夠降解血栓中的主要成分之一，纖維蛋白原和纖維蛋白。另一個方面，本發(fā)明提供了一種治療血栓的藥物組合物，所述藥物組合物包含分離自紅光熊蜂蜂毒的絲氨酸蛋白酶。


本發(fā)明的上述和其他特征將在典型的實(shí)施例中詳細(xì)描述，因此下面給出的附圖僅 是作為展示之用，而非對本發(fā)明進(jìn)行限制，其中圖1顯示了一種熊蜂，紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的cDNA核酸序列。框 中的密碼子‘ATG’和‘TAA’分別表示起始密碼子和終止密碼子。圖2顯示了由Bi-VSP的cDNA推出的氨基酸序列。(*空心三角(▽>分隔作為信號 序列的自由肽和包括切割域的前肽(切割域有六個嚴(yán)格保守的半胱氨酸殘基，形成三對二 硫鍵)，而實(shí)心三角(▼)分隔包括切割域的前肽和絲氨酸蛋白酶域)圖3a、3b顯示了 Bi-VSP的基因組DNA核酸序列。圖4顯示了提取自紅光熊蜂工蜂的脂肪體、中腸、肌肉和毒腺的RNA，使用Bi-VSP 的cDNA作為探針，進(jìn)行RNA印跡分析結(jié)果。圖5顯示了純化的重組Bi-proVSP的結(jié)果。從感染桿狀病毒的昆蟲細(xì)胞中純化的 重組Bi-proVSP的SDS-PAGE (左)和蛋白印跡(右)?？笲i-proVSP抗體在注射了重組的 Bi-proVSP的鼠中生產(chǎn)。圖6顯示了獲取自紅光熊蜂工蜂的毒腺、毒囊和分泌的毒液的蛋白使用 SDS-PAGE(左)和蛋白印跡(右)進(jìn)行分析的結(jié)果。顯示了 Bi-proVSP和Bi-VSP。左邊的 箭頭顯示了 Bi-proVSP的位置(*Bi-proVSP表示未成熟的(即，未激活的)蜂毒絲氨酸蛋 白酶，而Bi-VSP表示成熟的(即，激活的)紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶)。圖7顯示了 SDS-PAGE上，從毒液中純化的Bi-VSP的糖蛋白染色結(jié)果。(*辣根過 氧化物酶是一種糖基化蛋白，用作陽性對照。大豆胰蛋白酶抑制劑是一種未糖基化的蛋白， 用作陰性對照)。圖8顯示了 Bi-VSP與已知的蛇毒絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列比對。(*SP區(qū)域保 守的催化三聯(lián)體殘基[His (H)、Asp (D)和Ser (S)]使用星號標(biāo)識)。圖9顯示了 Bi-VSP激活人凝血酶原的SDS-PAGE分析結(jié)果。數(shù)字顯示了依照實(shí)施 例4描述的時間推移，凝血酶源與Bi-VSP —起溫育的時間(min)。圖10顯示了 Bi-VSP水解纖維蛋白原的SDS-PAGE分析結(jié)果。數(shù)字顯示了依照實(shí) 施例5描述的時間推移，纖維蛋白原與Bi-VSP —起溫育的時間(min)。圖11顯示了在纖維蛋白平板上檢測Bi-VSP酶活力的圖像。按照實(shí)施例6的描述， 向纖維蛋白平板上滴加不同濃度的Bi-VSP并溫育不同的時間。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及存在于一種熊蜂，紅光熊蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶，該酶能夠激活凝 血酶原并能夠降解纖維蛋白原和纖維蛋白。本發(fā)明的發(fā)明人首先分離了存在于紅光熊蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶的基因，其特 征尚未被詳細(xì)描繪。本發(fā)明的發(fā)明人于2009年2月17日在韓國提交了一件專利申請，其 涉及編碼包括絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蜂毒絲氨酸蛋白酶的基因的核酸序列，分配的韓國專 利申請?zhí)枮?0-2009-0013131。存在于紅光熊蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域是一種成熟的(即激活的)蛋白，由SEQ. ID. NO. 1所示的247個氨基酸組成。這種蛋白在氨基酸的數(shù) 目和序列上與蛇毒中的同類蛋白有很大不同。紅光熊蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶可以通過提取儲存在毒囊中的毒液，而后經(jīng)由快 速蛋白液相層析通過凝膠過濾色譜制得。紅光熊蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶能夠激活一種血 液凝固因子，凝血酶原，使其成為凝血酶，而且能夠降解纖維蛋白原成為纖維蛋白，并隨后 進(jìn)一步降解為纖維蛋白降解產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶可以被用于治療深靜脈血 栓、外周動脈疾病，并可以減少心血管手術(shù)后可能發(fā)生的各種醫(yī)療事故和血栓復(fù)發(fā)。下文中通過實(shí)施例更詳細(xì)描述本發(fā)明，但實(shí)施例并非是對本發(fā)明設(shè)置的限制。實(shí)施例實(shí)施例1.克隆紅光熊蜂蜂毒中存在的絲氨酸蛋白酶的基因從 Dept. of Agricultural Biology in National Academy of Agricultural Science of Rural Development Administration (農(nóng)業(yè)發(fā)展管理局農(nóng)業(yè)科學(xué)師范研究 院農(nóng)業(yè)生物部)提供的紅光熊蜂工蜂的毒腺中提取總RNA，提取使用SV總RNA分離系統(tǒng) 試劑盒(SV total RNA Isolation System kit) (Promega, USA)。然后使用 PolyATtract mRNA ^mM Mt K ^lJ ^ (PoIyA Ttract mRNA Isolation System kit) (Promega, USA) 從所述總RNA中提取poly (A) +mRNA。最后，使用poly (A) +mRNA以及Uni-ZAP XP載 體和 Gigapack III 金填充提取試劑盒(Gigapack III Gold Packing Extract kit) (Stratagene, USA)構(gòu)建cDNA文庫，并分析表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)。使用Wizard微制 備試劑盒(Wizard mini-pr印arationkit) (Promega, USA)提取 DNA，使用自動 DNA 序 列分析儀(Applied Biosystems, USA)讀取其序列。核酸序列使用NCBI的BLAST程 序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對。結(jié)果是，克隆了紅光熊蜂蜂毒中的絲 氨酸蛋白酶(Bi-VSP)基因的cDNA，所述cDNA具有SEQ. ID. NO. 2的序列(圖1)。分析 由紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)cDNA推出的氨基酸序列SEQ. ID. NO. 3 (圖2)， 揭示了其與 Holotrichia diomphalia PPAF-I (GenBankNo. BAA34642), H. diomphalia PPAF-III(GenBank No. BAC15604)、Bombyxmori PPAF-3 (GenBank No. AAL31707)、 Drosophila melanogasterMPl(GenBank No. NP_649560)>D. melanogaster easter(GenBank No. NP_524362)和 Manduca sexta PAP-I (GenBank No. AAX18636)，這樣一組取自昆蟲的 PAP 酶有序列同源性，還揭示了半胱氨酸(C)殘基在分割域中保守，而組氨酸(H)、天冬氨酸(D) 和絲氨酸( 殘基在絲氨酸蛋白酶區(qū)域內(nèi)保守。進(jìn)一步的，上述分析也確認(rèn)了紅光熊蜂蜂 毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)包括一個由沈個氨基酸組成的作為信號序列的前肽區(qū)域，一個 包含由87個氨基酸組成的切割域的前肽區(qū)域，以及由247個氨基酸組成的作為成熟蛋白的 絲氨酸蛋白區(qū)域。此外，下面表1中所示的引物是基于紅光熊蜂蜂毒中存在的絲氨酸蛋白酶 (Bi-VSP)制備的，紅光熊蜂蜂毒中存在的絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的基因組DNA使用引物 通過PCR進(jìn)行合成。表1
引物核酸序列.位置正向引物1S'-ATCi M30 GGC TCC AAG ^TQ €T TTC-3' tSiQ.ID.N0.4)1-24, 反向引物1 ^5,-TAC AGG TGG CTT ACC ACC GAC CAC-3' (SEQ. ID.NO. 5)363-340正向引物2 *5,-GTG GTC GGT GGT AAG CCA GCT GTA-3' (SEQ. ID. NO. 6)340-363反向引物2 ‘5'-TTATTG CAT CGC TGG GAG AAT AAA-3' (SEQ. ID. NO. 7)1083-1060紅光熊蜂的基因組DNA使用Wizard基因組純化試劑盒(Wizard GenomicPurification kit) (Promega, USA)提取，然后使用上面的引物和 PCR premix 試 劑盒(PCR premix kit) (Bioneer Corp.，Korea)擴(kuò)增含有紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶 (Bi-VSP)基因的基因組DNA。PCR反應(yīng)進(jìn)行35個循環(huán)，其中每個循環(huán)在95°C變性5分鐘， 60°C退火1分鐘，而后72°C下聚合3分鐘。擴(kuò)增得到的DNA使用自動DNA序列分析儀進(jìn)行 分析。結(jié)果顯示紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的基因組DNA由6個外顯子和5個 內(nèi)含子組成，上述基因組DNA從起始密碼子到終止密碼子的總長為4505bp (圖3a、3b)。實(shí)施例2.紅光熊蜂蜂毒中存在的絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的毒腺特異性表達(dá)、剪 切和0-糖基化使用總RNA 分離試劑盒(Total RNA Isolation kit) (Promega, USA)從紅光熊蜂 的脂肪體、中腸、肌肉和毒腺中提取RNA。每孔加入5 μ g提取到的RNA之后，在1 %的甲醛瓊 脂糖凝膠中電泳，將膠轉(zhuǎn)移到尼龍印跡膜上(Schleicher & khuell，Germany)，并在42°C 下與[a-32P]dCTP(AmerSham，USA)標(biāo)記的紅光熊蜂蜂毒中存在的絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP) 的cDNA探針雜交。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紅光熊蜂蜂毒中存在的絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的mRNA只特 異性的存在于毒腺中。為了制備抗紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)抗體，將紅光熊蜂蜂毒絲氨酸 蛋白酶(Bi-VSP)cDNA插入昆蟲苜蓿尺蠖(Autographa californica)核型多角體病毒轉(zhuǎn)染 載體 pBACl (Clontech，USA)的 BamH I-Xho I 區(qū)，隨后使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Clontech，USA)將 其與IOOng轉(zhuǎn)染載體以及500ng bAcGOZA病毒DNA共轉(zhuǎn)染到Sf9昆蟲細(xì)胞系(Spodoptera frugiperda 9)中[Je et al. , Biotechnol. Lett. , 23 :575-582 (2001) ] 5 天后，收集得 到的培養(yǎng)物，制得表達(dá)重組紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-proVSP)的重組苜蓿尺蠖核型 多角體病毒。重組苜蓿尺蠖核型多角體病毒在Sf9細(xì)胞系中生長，使用組氨酸親和層析 柱(HisTrap column) (Amersham Bioscience, USA)分離重組紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶 (Bi-proVSP)。將分離到的重組紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-proVSP)注射入Balb/c鼠 內(nèi)以制備多克隆抗體[Choo et al. Mol. Cell. Neurisci. 38 :224-235 (2008) ] 使用分離的 紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)和上述抗體進(jìn)行蛋白印跡[圖5]。從毒腺、毒囊和排出的毒液中提取蜂毒蛋白樣品，在15% SDS-PAGE凝膠中電 泳，并使用上述抗體進(jìn)行蛋白印跡。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶未激活的形式 (Bi-proVSP)和激活的形式(Bi-VSP)均存在于毒腺中，然而，在毒囊和排出的毒液中只觀察到了紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶激活的形式(Bi-VSP)[圖6]。因此，可以確認(rèn)紅光熊蜂 蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)在毒腺中表達(dá)、剪切成激活的形式，儲存在毒囊中，然后排出。為研究在紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶的激活形式中(Bi-VSP)紅光熊蜂蜂毒絲氨 酸蛋白酶(Bi-proVSP)被剪切掉的區(qū)域，34kDa的紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)被 轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯，PVDF膜上(Applied Biosystems, USA)隨后通過Edman降解法分析 N-末端區(qū)域。結(jié)果，可以確認(rèn)如圖2所示，紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-proVSP)在113th 氨基酸Arg和114th氨基酸Val之間被剪切，從而轉(zhuǎn)變成由247個氨基酸組成的激活形式 的蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)。即，如SEQ. ID. NO. 1所示的，由247個氨基酸組成的激活 形式的蜂毒絲氨酸蛋白酶。計算得到由247個氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶的估算分子量為 27kDa。然而，由于含有約20%的糖，其在SDS-PAGE膠中分子量為34kDa。紅光熊蜂蜂毒絲 氨酸蛋白酶沒有N-糖基化區(qū)域但有一個0-糖基化區(qū)域。為了證實(shí)這一點(diǎn)，使用凝膠/編 碼糖蛋白染色試劑盒(Gel/Codeglycoprotein staining kit) (Pierce，USA)對激活形式的 紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶進(jìn)行糖蛋白染色，結(jié)果，證實(shí)了激活形式的紅光熊蜂蜂毒絲氨 酸蛋白酶是一種0-糖基化的糖蛋白(圖7)。實(shí)施例3.比較紅光熊蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶和蛇毒中的絲氨酸蛋白酶的氨基 酸序列使用NCBI 的 BLAST 程序(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)比對紅光熊 蜂蜂毒中的絲氨酸蛋白酶和蛇毒中的絲氨酸蛋白酶的核酸序列。當(dāng)比對上述兩種絲氨 酸蛋白酶的氨基酸序列時，發(fā)現(xiàn)紅光熊蜂絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)與在血液凝固機(jī)制中 作為凝血酶原激活劑的Oscutarin C(GenBank No. AY940204)；具有與凝血酶相似活性 的 Batroxobin (GenBank No. AAA48553)；激活纖維蛋白溶解酶前體的 TSV-PA (GenBank No.Q91516) ；PA-BJ(GenBank No.P81824) ；Halytase(GenBank No.P81176)禾口 RVV-V(GenBank No. P18964)有一定程度的同源性，而且絲氨酸蛋白酶區(qū)域中組氨酸，天門 冬氨酸和絲氨酸殘基高度保守(圖8)。實(shí)施例4.紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶作為凝血酶原激活劑的作用為了檢驗(yàn)紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的功能，其是否激活在血液凝固 中起關(guān)鍵作用的凝血酶的前體，凝血酶原，從而進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。2 μ g人血液凝固因子凝血酶原(Sigma)和2ng從紅光熊蜂毒囊中純化的絲氨酸蛋 白酶溶解在含有IOOmM NaCl和5mM CaCl2的50mM Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中，在37°C反 應(yīng)，得到的混合物在14%的SDS-PAGE中電泳，觀察隨時間推移的結(jié)果[Speijer H et al. J Biol Chem 1986 ；261 :13258-67]。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)5分鐘后，凝血酶原開始向激活形式的凝 血酶轉(zhuǎn)變，反應(yīng)60分鐘后，完全轉(zhuǎn)變?yōu)槟?圖9)。這與血液凝固機(jī)制中的一種凝血因 子，Xa因子的過程相似。實(shí)施例5.紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶作為纖維蛋白原溶解酶的作用10 μ g 人纖維蛋白前體纖維蛋白原(MP Biomedicals, Solon, OH, USA)和 0· 25 μ g 從紅光熊蜂毒囊中純化的絲氨酸蛋白酶溶解在50mM的Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)中，在 37°C反應(yīng)，混合物在14%的SDS-PAGE中電泳，觀察隨時間推移的結(jié)果[Matsui T et al. Eur J Biochem 1998 ；252 :569-75]。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)沒有顯示 出任何纖維蛋白凝塊，而是將纖維蛋白原鏈Aa、Ββ、γ水解。Aa鏈在反應(yīng)后的5分鐘內(nèi)被完全水解，而Ββ鏈和γ鏈在60分鐘內(nèi)被完全水解。這表明紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶 (Bi-VSP)有類似凝血酶的活性，能夠水解纖維蛋白原。進(jìn)一步的，發(fā)現(xiàn)在60分鐘到720分 鐘之間，所有的轉(zhuǎn)化自纖維蛋白原的纖維蛋白都被完全轉(zhuǎn)變成了纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)。 這進(jìn)一步證實(shí)了紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)具有類似纖維蛋白溶酶(能夠降解 纖維蛋白)的活性(圖10)。實(shí)施例6.檢驗(yàn)紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶作為纖維蛋白溶解酶的作用如實(shí)施例5所示，通過纖維蛋白原與紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)的反 應(yīng)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶(Bi-VSP)不僅能特異性裂解纖維蛋白原成為 纖維蛋白，而且在SDS-PAGE膠上能將纖維蛋白轉(zhuǎn)化為纖維蛋白降解產(chǎn)物。此外，進(jìn)行了纖 維蛋白平板實(shí)驗(yàn)以得到紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶的纖維蛋白溶解活性的更具體更有說 服力的結(jié)果。將纖維蛋白原(0.6%/10mL)加入到硼酸緩沖液中(pH 7. 8)，在30°C溶解1 小時。然后，將IOmL得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到平板上以備將纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，40單位 的凝血酶加入其中并稀釋，并在室溫下反應(yīng)使平板凝固[Astrup T. et al. Arch. Biochem. Biophys. (1991). 40,346-351]。分別往纖維蛋白平板上加入不同濃度的純化的紅光熊蜂蜂 毒絲氨酸蛋白酶(0、1、2、3和5 μ g)，并在37。C反應(yīng)3、5、7、9小時，觀察纖維蛋白溶解活性。 結(jié)果，發(fā)現(xiàn)依據(jù)每種不同的濃度形成了不同的纖維蛋白溶解的白色區(qū)域(圖11)，因此證實(shí) 了紅光熊蜂蜂毒絲氨酸蛋白酶能夠有效的溶解纖維蛋白。有益效果本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶能夠激活凝血酶原并能夠直接降解纖維蛋白原和纖維蛋 白，因此，可以被用于發(fā)展治療血栓的治療劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明確本發(fā)明可以以其他形式、結(jié)構(gòu)、排列、規(guī)模來實(shí)施，并可 能使用其他的要素、材料、成分。因此，本發(fā)明公開的實(shí)施例的目地完全是為了展示而非限 制，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受前面描述的限制，由附帶的權(quán)利要求指明。
權(quán)利要求
1.如SEQ.ID. NO. 1所示的從紅光熊蜂蜂毒中分離得到的能夠激活凝血酶原的絲氨酸 蛋白酶。
2.如SEQ.ID. NO. 1所示的從紅光熊蜂蜂毒中分離得到的能夠降解纖維蛋白原至纖維 蛋白的絲氨酸蛋白酶。
3.如SEQ.ID. NO. 1所示的從紅光熊蜂蜂毒中分離得到的能夠降解纖維蛋白的絲氨酸 蛋白酶。
4.治療血栓的藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-3中任一項所述的從紅光熊蜂蜂毒中分 離得到的絲氨酸蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了從一種熊蜂，紅光熊蜂中分離得到的絲氨酸蛋白酶，所述絲氨酸蛋白酶能夠激活凝血酶原并能夠降解纖維蛋白原和纖維蛋白。由于本發(fā)明中的絲氨酸蛋白酶能夠激活凝血酶原并能夠直接降解纖維蛋白原和纖維蛋白，因此可以被用于開發(fā)治療血栓的治療劑。
文檔編號C12N9/64GK102146364SQ20101024171
公開日2011年8月10日 申請日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月8日
發(fā)明者孫興大, 尹馨珠, 李光植, 秋英武, 諸連鎬, 陳炳來 申請人:東亞大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)