專利名稱：：纖維蛋白溶酶原的親和吸附劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及化合物和它們用作親和配體的用途。
背景技術(shù)：
：纖維蛋白溶酶原(可替代性地稱為微纖溶酶、PLG或制管張素)是單鏈91kDa糖蛋白酶原，并且是纖維蛋白溶酶纖溶酶的前體。纖維蛋白溶酶原的天然形式由791個(gè)氨基酸組成，其中谷氨酸位于N-末端部分(Glu-纖維蛋白溶酶原)。纖維蛋白溶酶原具有五個(gè)被稱為kringle的同源區(qū)域。這些區(qū)域?qū)τ谖挥趖PA、uPA和凝血酶原的互補(bǔ)kringle是特異性的。這些kringle具有一個(gè)高親和性和四個(gè)低親和性賴氨酸結(jié)合位點(diǎn)，介導(dǎo)纖維蛋白溶酶原與纖維蛋白和a-2-抗纖維蛋白酶的相互作用。纖維蛋白溶酶原通過導(dǎo)致纖維蛋白溶酶原的Arg560-Va1561肽鍵水解的一系列的各種反應(yīng)轉(zhuǎn)化為纖溶酶，導(dǎo)致兩個(gè)鏈通過二硫鍵保持共價(jià)鍵結(jié)合。胰蛋白酶樣蛋白酶纖溶酶的主要作用是凝塊的分解。由編碼DNA的同類或雜合突變產(chǎn)生的纖維蛋白溶酶原的不足表現(xiàn)在許多病理學(xué)中，包括木質(zhì)化結(jié)膜炎和血栓形成。纖維蛋白溶酶原以~100ng/mL的濃度存在于人血漿中。在4艮好地表征的親和色鐠法過程中，可以使用固定在固體載體上的賴氨酸從血漿中純化纖維蛋白溶酶原。固定化賴氨酸色鐠法也用于從收獲的細(xì)胞培養(yǎng)物中初級(jí)捕獲蛋白，比如組織纖溶酶原激活物(tPA)，一般用作凝塊分解藥。纖維蛋白溶酶原的可商業(yè)得到的樹脂的結(jié)合能力通常為0.6~1.0mg蛋白/mL吸附劑。由這些材料洗脫的纖維蛋白溶酶原的純度非常好，初級(jí)捕獲的純度通常>95%。這對(duì)于使材料保持極好洗脫純度的這些特征而顯示出超過其目前可達(dá)到的結(jié)合能力來說將是有用的。WO97/10887公開了用作親和吸附劑的式I的基于三喚的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中&是H、烷基、羥烷基、環(huán)己基、NH2、苯基、萘基、1-苯基吡唑、丐j唑、苯并噻唑、苯并。惡唑或苯并咪唑，任意的這些芳基可以被烷基、烷氧基、酰氧基、酰氨基、氨基、NH2、OH、C02H、磺?；?、氨基甲?；?、氨基磺?；?、烷基磺?；拓账刂械囊粋€(gè)或多個(gè)取代；一個(gè)X是N，另一個(gè)是N、C國(guó)C1或C-CN;Y是O、S或NR"Z是O、S或NR"R2和R3各自是H、烷基、幾烷基、苯曱基或p-苯乙基；Q是苯、萘、苯并噻唑、苯并D惡唑、l-苯基吡唑、吲唑或苯并咪唑；R4、Rs和R6各自是H、OH、烷基、烷氧基、氨基、NH2、酰氧基、酰氨基、C02H、磺酸、氨基曱?；?、氨基磺?；?、烷基磺酰基或鹵素；11是0~6jp是0-20;和A是載體基體，任選地通過間隔基連接到三嗪環(huán)。式i的化合物公開為對(duì)于蛋白比如免疫球蛋白、胰島素、因子vn或人生長(zhǎng)激素具有親和性。相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物>^開在WO00/67900和WO03/097112中。它們對(duì)于內(nèi)毒素具有親和性。
發(fā)明內(nèi)容意外地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些化合物可用于纖維蛋白溶酶原基于親和性的分離，這些化合物中有許多是新的。這些化合物具有式II<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中，A、X和Z如上式I中所定義；B是含有1~10個(gè)碳原子的任選地取代的烴鍵；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季銨、咪唑、胍基或脒基；或B-D是國(guó)CHCOOH-(CH2)34-NH2;和q是2-6。另外，本發(fā)明的化合物包括相應(yīng)的配體，其中A被官能團(tuán)代替，直接地或間接地連接到三溱環(huán)，其可以反應(yīng)使得所述化合物固定在載體基體上。下文中，術(shù)語(yǔ)，，配體"和"吸附劑"可互換地使用。具體實(shí)施例方式WO97/10887、WO00/67卯0和WO03/0971127>開了如何可以在固體栽體上建立配體的組合庫(kù)。它們的公開內(nèi)容，包括實(shí)施方案的實(shí)施例和與本發(fā)明相同的步驟，通過引用并入本發(fā)明中。在用作為原料的人血漿池篩選這些組合庫(kù)組期間，許多配體確定為能夠選擇性地結(jié)合和洗脫人纖維蛋白溶酶原。可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備用于本發(fā)明的式II的化合物。這種方法記載于上述3個(gè)PCT公開中；它們可以容易地適用于新化合物的制備。在本發(fā)明的化合物中，q優(yōu)選4。應(yīng)知道分子的"臂"源自于賴氨酸。B優(yōu)選包括芳環(huán)，例如苯環(huán)。WO97/10887給出了A的實(shí)例，包括間隔基或連接基L，通過其三溱環(huán)可連接到固體載體M。如WO97/10887所述，這種載體包括瓊脂糖，二氧化硅，纖維素，右旋糖酐，淀粉，藻酸鹽，角叉菜聚糖，合成聚合物，玻璃和金屬氧化物。在反應(yīng)以形成本發(fā)明的吸附劑以前可以活化這種材料。L例如可以為-T-(-V、V2)^,其中T是O、S或-NR7國(guó)；m是0或V1是任選地取代的220個(gè)C原子的烴基；和V2是O、S、-COO曙、-CONH國(guó)、-NHCO-、-P03H-、-NH-亞芳基-S02-CH2-CH24-NR8-;和R7和R8各自獨(dú)立地為H或烷基。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過結(jié)構(gòu)III表示結(jié)合纖維蛋白溶酶原的吸附劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過結(jié)構(gòu)IV表示結(jié)合纖維蛋白溶酶原的吸附劑。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過結(jié)構(gòu)V表示結(jié)合纖維蛋白溶酶原的吸附劑。本發(fā)明中記載的結(jié)合纖維蛋白溶酶原的配體和吸附劑可用于從各種流體和復(fù)雜混合物中親和性分離和純化纖維蛋白溶酶原，所述各種流體和復(fù)雜混合物包括但不限于人血漿、消除了一種或多種其它蛋白的人血漿和重組發(fā)酵上清液。這些應(yīng)用在下實(shí)施例4中說明，其使用人血漿池通過色語(yǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"纖維蛋白溶酶原"在本發(fā)明中是指纖維蛋白溶酶原本身以及具有纖維蛋白溶酶原功能特點(diǎn)的類似物，例如，就對(duì)于本發(fā)明中記載的給定化合物的親和性而言。因此，所述分析物可以是作為纖維蛋白溶酶原功能片段的蛋白，或具有所有相同結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)、多個(gè)的結(jié)構(gòu)類似物，或融合蛋白。以下實(shí)施例說明本發(fā)明。實(shí)施例1吸附劑III的合成用RO水(670mL)、10M氳氧化鈉(NaOH)(90mL)和表氯醇(127mL)將6%的交聯(lián)Purabead瓊脂糖凝膠(1000g沉降在反滲透(RO)水中)制成漿。攪拌所述漿2小時(shí)。取出用于分析的樣品之后，過濾所述漿，然后用RO水(12xlL)洗。對(duì)于環(huán)氧基的分析表明每g沉降的凝膠衍生了17.3拜。1的環(huán)氧基。在加入RO7JC(800mL)和0.88比重的氨K溶液(200mL)以前，將凝膠中的水排出。攪拌該混合物并加熱到40。C,然后在該溫度攪拌16小時(shí)。取出用于分析的樣品之后，過濾所述漿，然后用RO水(12xl000mL)洗。對(duì)于胺基的TNBS分析表明每g沉降的凝膠衍生了25.6nmo1的胺基。將沉降的氨化的凝膠(1000g)懸浮在1MpH7.0的磷酸鉀(1L)中，然后排水。然后向該凝膠中加入1MpH7.0的砩酸鉀(250mL)和RO水(250mL)。劇烈攪拌漿同時(shí)加入丙酮(500mL)。在冰/鹽浴中冷卻30分鐘之后，一次性加入在冷丙酮(250mL)中的氰尿酰氯(25g)。在用50%含水丙酮(5xlL)、ROK(5xlL)、50。/。含水丙酮(5xlL)和RO水(10xlL)洗之前，在0。C攪拌該混合物1小時(shí)。在取出用于分析的樣品以前，使得凝膠在重力下沉降。對(duì)于氯化物釋放的分析表明每g沉降的凝膠衍生有16.8nmol取代的二氯三秦。在室溫下，用含有鹽酸賴氨酸(45g)的pH8.5的1M磷酸鉀緩沖液(1L)漿化上述階段的沉降的凝膠(1000g)16小時(shí)。過濾所述漿，然后用RO水(15xlL)洗。向在RO水(950mL)中漿化的950g(沉降的)凝膠中，加入乙醇胺(14.82g)。在60。C下攪拌該混合物過夜。取出用于分析的上清液樣品之后，過濾所述漿，然后用RO水(12xlL)洗。對(duì)于氯化物釋放的分析表明每g沉降的凝膠已經(jīng)衍生了22.7pmo1的乙醇胺。在40。C下在最終濃度0.5M的NaOH中培養(yǎng)凝膠過夜，然后用0.5MNaOH(5xlL)洗。最后的清洗之后4吏得在重力下排水，加入0.5MNaOH(1L)，并在40。C下培養(yǎng)所述混合物過夜。然后用0.5MNaOH(5xlL)洗所述凝膠，然后用RO7jC(10x1L)洗。所述凝膠用pH7.0的0.1MPBS(3xlL)洗后，再次用RO水(10xlL)洗，之后在冷室中在4。C下存儲(chǔ)在20%v/v含水乙醇中。實(shí)施例2吸附劑IV的合成根據(jù)實(shí)施例1中所描述的方法制備二氯三嚷活化的瓊脂糖。在60。C下使沉降的凝膠(41.5g,22fimo1DCT/g沉降的)與鹽酸賴氨酸(1.67g，10摩爾當(dāng)量)在水(40mL)中的水溶液反應(yīng)過夜，同時(shí)用10MNaOH保持pH為9.0。此時(shí)用50。/。含水二甲基甲酰胺(5x80mL)、RO水(5x80mL)、0.1MHCI(5x80mL)、30%異丙醇/0.2MNaOH(5x80mL)和RO水(5x80mL)洗所述凝膠，之后在冷室中在4。C下存儲(chǔ)在20%v/v含水乙醇中。實(shí)施例3吸附劑V的合成根據(jù)實(shí)施例1中所描述的方法制備二氯三嗪活化的瓊脂糖。在5。C下使沉降的凝膠(43g，21.1nmo1DCT/g沉降的)與2-(羥曱基)苯胺(0.56g，5摩爾當(dāng)量)在50%DMF/水(40mL)中的溶液反應(yīng)30分鐘。在此時(shí)，用50V。含水二甲基曱跣胺(5x80mL)和RO水(5x80mL)洗所述凝膠。在60。C下使所述凝膠與鹽酸賴氨酸(1.71g,10摩爾當(dāng)量)在水(40mL)中的水溶液反應(yīng)過夜，同時(shí)用10MNaOH保持pH在9.0。此時(shí)用50。/。含水二甲基甲酰胺(5x80mL)、RO水(5x80mL)、0.1MHCI(5x80mL)、30%異丙醇/0.2MNaOH(5x80mL)和RO水(5x80mL)洗所述凝膠，之后在冷室中在4'C下存儲(chǔ)在20%v/v含水乙醇中。實(shí)施例4使用人血漿用吸附劑III、IV和V進(jìn)行色鐠分析使用AktaExplorer色鐠系統(tǒng)，使用1.6厘米內(nèi)徑，10厘米床高度的柱色鐠法柱進(jìn)行色譜實(shí)驗(yàn)。用140mM氯化鈉/20mM檸檬酸鈉/20mMTrispH7.5，以100cm/小時(shí)平衡所述柱。然后以50cm/小時(shí)加入人血漿(調(diào)節(jié)到20mMTris/pH7.5，通過3、0.8、0.45和0.2,過濾器過濾，1.3L)。加入后用140mM氯化鈉/20mM檸檬酸鈉/20mMTrispH7.5，以50cm/小時(shí)洗到基線吸收度。然后用140mM氯化鈉/20mM檸檬酸鈉/20mMTris/500mM￡-氨基己酸，pH7.5,以100cm/小時(shí)洗脫所述柱，并用0.5M氫氧化鈉再生。通過濁度測(cè)定法分析加入的、未結(jié)合的和洗脫的級(jí)分，以確定結(jié)合能力。進(jìn)行SDSPAGE以確定純度。從所有吸附劑洗脫的級(jí)分的純度均>85%。動(dòng)態(tài)結(jié)合能力(在10%臨界點(diǎn))如表1戶斤示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1.親和吸附劑用于分開、除去、分離、純化、表征、鑒別或量化纖維蛋白溶酶原或作為纖維蛋白溶酶原類似物的蛋白的用途，其中所述親和吸附劑是式II的化合物其中一個(gè)X是N，另一個(gè)X是N、C-Cl或C-CN；A是載體基體，任選地通過間隔基連接到所述三嗪環(huán)；Z是O、S或N-R，R是H、C1-6烷基、C1-6羥烷基、苯甲基或β-苯乙基；B是含有1～10個(gè)碳原子的任選地取代的烴鍵；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季銨、咪唑、胍基或脒基；或B-D是-CHCOOH-(CH2)3-4-NH2；和q是2～6。2.權(quán)利要求1的用途，其中所述吸附劑具有式III。3.權(quán)利要求1的用途，其中所述吸附劑具有式IV。4.權(quán)利要求1的用途，其中所述吸附劑具有式V。5.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的用途，其中所述纖維蛋白溶酶原在血漿樣品中。6.—種新型化合物，其具有前述權(quán)利要求任一項(xiàng)中所定義的式II。7.—種化合物，其是根據(jù)權(quán)利要求6的化合物的前體，其中A被官能團(tuán)代替，直接地或間接地連接到所述三噪環(huán)，這允許所述前體固定在固體載體上。全文摘要為分開、除去、分離、純化、表征、鑒別或量化纖維蛋白溶酶原或作為纖維蛋白溶酶原類似物的蛋白，使用親和吸附劑，其是式(II)的化合物，其中一個(gè)X是N，另一個(gè)是N、C-Cl或C-CN；A是載體基體，任選地通過間隔基連接到三嗪環(huán)；Z是O、S或N-R，R是H、C_1-6烷基、C_1-6羥烷基、苯甲基或β-苯乙基；B是含有1～10個(gè)碳原子的任選地取代的烴鍵；D是H、OH或伯氨基、仲氨基、叔氨基、季銨、咪唑、胍基或脒基；或B-D是-CHCOOH-(CH₂)_3-4-NH₂；q是2～6。文檔編號(hào)B01J20/32GK101171078SQ200680016008公開日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年5月9日優(yōu)先權(quán)日2005年5月9日發(fā)明者克勞迪亞·希爾德加德·庫(kù)恩,巴爾德夫·辛格·貝納斯,詹姆士·克里斯托弗·皮爾森,詹森·理查德·貝特利申請(qǐng)人:普羅米蒂克生物科學(xué)有限公司