一種汞-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種汞-纖維蛋白原螯合物及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 纖維蛋白原（fibrinogen，F(xiàn)G)其生理功能主要是作為凝血因子I而直接參與凝 血過程。在凝血共同途徑中，凝血酶先裂解纖維蛋白原兩條Aa鏈氨基端Argl6-Glyl7 釋放出一對纖維蛋白肽A，形成纖維蛋白單體I;在裂解纖維蛋白原兩條BP鏈氨基端 Argl4-Glyl5釋放出一對纖維蛋白肽B，形成纖維蛋白單體II，暴露纖維蛋白單體的聚合部 位，通過非共價結(jié)合，形成了不穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白單體。在活化的凝血因子XIII及Ca2+ 的作用下，纖維蛋白單體互相交聯(lián)，生成穩(wěn)定的可溶性纖維蛋白，并將血液的有形成分包繞 其中，形成牢固的血栓。
[0003] 除參與凝血外，纖維蛋白原還具有其他多種功能，如與血小板膜糖蛋白IIb/IIIa 結(jié)合而介導(dǎo)血小板聚集反應(yīng)，參與動脈粥樣硬化及腫瘤血行轉(zhuǎn)移等；纖維蛋白原水平還影 響血液粘度，尤其近年來人們發(fā)現(xiàn)血漿纖維蛋白原水平升高是心腦血管、血栓性疾病的重 要危險因素。血漿纖維蛋白原也是急性時相蛋白，在很多應(yīng)激狀況下，如感染、嚴(yán)重外傷等 也可短時間內(nèi)升高。
[0004] 萊（Hgckel，Hg)與人體的健康息息相關(guān)，首先其是人體維持健康所必需的微量元 素，其存在于多種氫化酶中，催化氫的氧化還原反應(yīng)，參與多種酶蛋白的合成和細(xì)胞激素及 色素的代謝，具有促進(jìn)鐵的吸收和紅細(xì)胞的增長、激活酶形成輔酶、增強(qiáng)胰島素、降血糖、保 護(hù)心血管等作用，因此如果人體缺乏汞，會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。但是，事實在生活中，由于環(huán)境 污染，人體內(nèi)很少缺乏汞，相反汞的含量常常過量，常常導(dǎo)致疾病的發(fā)生，甚至危及生命。
[0005] 汞作為一種常見的有毒金屬，廣泛應(yīng)用于生活、生產(chǎn)之中，包括生產(chǎn)硬幣、珠寶、汞 合金不銹鋼、制造Hg-Cd電池等，與人們的生活息息相關(guān)。隨著科技的進(jìn)步，人們將汞作為 催化劑用于生產(chǎn)碳納米顆粒的生產(chǎn)之中，又進(jìn)一步加深了汞對于人類的影響。對于普通人 群，汞主要是通過食入、飲入、接觸等方式攝入汞，當(dāng)然吸煙也是一重要途徑。研究發(fā)現(xiàn)，過 量的汞會導(dǎo)致機(jī)體多處組織及器官損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，包括呼吸系統(tǒng)疾?。ǚ窝?、 支氣管炎、肺纖維化、哮喘、肺水腫等）、心血管疾病、腎臟疾病、皮膚疾病等，甚至還會導(dǎo)致 腫瘤的發(fā)生。
[0006] 流行病學(xué)資料顯示，長期接觸汞的工人，其患呼吸系統(tǒng)腫瘤的幾率大大增加，并且 其因呼吸系統(tǒng)腫瘤致死的幾率也大大增加。動物模型、體外模型試驗也發(fā)現(xiàn)，汞可以誘導(dǎo)腫 瘤的發(fā)生。1990年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（InternationalAgencyforResearchonCancer， IARC)已將萊化合物作為第一類致癌物質(zhì)（GroupI)，將金屬萊作為2B類致癌物質(zhì)（Group 2B)。可見，汞嚴(yán)重威脅人體的健康。
[0007] 汞與多種蛋白質(zhì)之間關(guān)系密切，可以與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對汞毒性研究的深入，人們逐漸認(rèn)識到汞與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認(rèn)為是了解汞的毒性機(jī)理的關(guān)鍵所在，因此，對汞和蛋白質(zhì)相互作用的研究就 顯得愈發(fā)重要。而現(xiàn)在關(guān)于汞與蛋白質(zhì)作用的機(jī)理僅是冰山一角，還有很多蛋白質(zhì)與汞之 間的關(guān)系還不清楚，因而加強(qiáng)對于汞與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對汞污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種汞-纖維蛋白原螯合物及其 制備方法，并建立汞-纖維蛋白原螯合物的定性、定量檢測方法，以便定量檢測汞-纖維蛋 白原螯合物在評價一個地區(qū)汞污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血清中汞-纖 維蛋白原螯合物可以間接反映這個地區(qū)人群受汞污染的情況，從而間接反映這個地區(qū)汞污 染程度。
[0009] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種汞-纖維蛋白原螯合物， 汞離子與纖維蛋白原通過巰基或/和半胱氨酸殘基螯合而成。
[0010] 本發(fā)明還提供一種上述的汞-纖維蛋白原螯合物的制備方法，包括以下步驟：
[0011] A)汞與纖維蛋白原的螯合反應(yīng)：在提純源于人體的纖維蛋白原或按照生物學(xué)方 法重組的纖維蛋白原中加入汞離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，得到反應(yīng)溶液；
[0012] B)純化汞-纖維蛋白原螯合物的提?。翰捎妹庖哂H和層析法，去除反應(yīng)溶液中未 反應(yīng)的纖維蛋白原以及多余的汞離子，即得汞-纖維蛋白原螯合物。
[0013] 其中，體外合成法中所述步驟B)具體如下：
[0014] (1)溶解樣品：向經(jīng)過步驟A)得到的反應(yīng)溶液中加入生理鹽水使汞-纖維蛋白原 螯合物復(fù)溶；
[0015] (2)平衡層析柱：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱的管路，在層析柱中裝入能與纖維 蛋白原特異性結(jié)合的填料，裝柱后，繼續(xù)使用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0016] (3)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟⑴中樣品，然后上柱，纖維蛋 白原與填料特異性結(jié)合；
[0017] (4)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 05-0.lmol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液I;
[0018] (5)收集：收集洗脫液I
[0019] (6)透析：將步驟（5)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三次 后，4°C透析過夜，收集樣本；
[0020] (7)平衡層析柱：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能 與汞特異性結(jié)合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡層析柱；
[0021] (8)上樣：待層析柱平衡后，用稀釋緩沖液稀釋步驟(6)中樣本，然后上柱；
[0022] (9)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗層析柱至基線平衡，然后使用0. 5-1.Omol/L的磷 酸鹽溶液進(jìn)行洗脫，得到洗脫液II;
[0023] (10)收集：收集洗脫液II
[0024] (11)透析：將步驟（10)中的收集的洗脫液，裝透析袋，用CldH2O透析除鹽，換水三 次后，4°C透析過夜，收集樣本，即得汞-纖維蛋白原螯合物。
[0025] 其中，上述汞-纖維蛋白原螯合物的制備方法，還包括步驟C):對汞-纖維蛋白原 螯合物的鑒定；
[0026] 其中，步驟C)中具體如下：
[0027] (1)制備膠床：以瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種作為介質(zhì)制備膠床；
[0028] (2)加樣：取步驟B)中提取純化得到的汞-纖維蛋白原螯合物，加入稀釋緩沖液， 并混勻，然后加樣于樣品槽中；
[0029] (3)電泳：連接電泳板，進(jìn)行電泳；
[0030] (4)檢測：在膠床上找出含汞的蛋白條帶，將該蛋白條帶取出并溶解，然后再采用 ELISA法或ICP-MS法或AAS法檢測是否含有汞以及檢測汞的含量。
[0031] 本發(fā)明還提供一種如上述的汞-纖維蛋白原螯合物在制備檢測人體內(nèi)汞-纖維蛋 白原螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0032] 本發(fā)明還提供一種至少包括如上述的汞-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品的試劑 盒。
[0033] 優(yōu)選地，該試劑盒中還包括包被液，該包被液含有捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)或捕獲 汞的物質(zhì)。
[0034] 本發(fā)明還提供一種定量檢測汞-纖維蛋白原螯合物的方法，以已知含量的上述的 汞-纖維蛋白原螯合物作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用以下方法之一對樣品進(jìn)行檢測：酶聯(lián)免疫法、酶聯(lián) 免疫與原子吸收光譜結(jié)合法、酶聯(lián)免疫與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、提純汞-纖維蛋 白原螯合物與酶聯(lián)免疫結(jié)合法、提純汞-纖維蛋白原螯合物與原子吸收光譜結(jié)合法、提純 汞-纖維蛋白原螯合物與電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法、電泳與酶聯(lián)免疫或原子吸收光譜 或電感耦合等離子體質(zhì)譜結(jié)合法。
[0035] 實施本發(fā)明的汞-纖維蛋白原螯合物及其制備方法和應(yīng)用，具有以下有益效果：
[0036] 1.本發(fā)明首次體外合成汞-纖維蛋白原螯合物；
[0037] 2.本發(fā)明首次提出汞-纖維蛋白原螯合物可用于制備檢測血樣中汞-纖維蛋白原 螯合物的試劑或試劑盒中的應(yīng)用。
[0038] 3.本發(fā)明建立了汞-纖維蛋白原螯合物的定性定量檢測方法，以便定量檢測 汞-纖維蛋白原螯合物在評價一個地區(qū)汞污染程度的應(yīng)用。通過定量檢測一個地區(qū)人群血 清中汞_纖維蛋白原螯合物可以間接反映這個地區(qū)人群受汞污染的情況，從而間接反映這 個地區(qū)汞污染程度。本發(fā)明建立的汞-纖維蛋白原螯合物定量檢測方法其準(zhǔn)確度大大提 高，并且使檢測的重復(fù)性得到大大提高。
【附圖說明】
[0039] 圖1為本發(fā)明所述的汞-纖維蛋白原螯合物的非變性電泳條帶圖；
[0040] 圖2為本發(fā)明所述的汞-纖維蛋白原螯合物的電泳條帶的同步輻射X線熒光分析 圖。
【具體實施方式】
[0041] 下面，結(jié)合【具體實施方式】，對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0042] 本發(fā)明除特別說明外，涉及的實驗操作步驟均為本領(lǐng)域常規(guī)的步驟，所用試劑、材 料如下述所列舉，在本發(fā)明中沒有列舉出來的均為本領(lǐng)域常用的試劑或可以通過市購方式 獲得：
[0043] 磷酸鹽溶液為 0? 05-0.lmol/LNa2HP04 溶液或 0? 5-lmol/LNa2HP04 溶液；
[0044] 提取試劑為PEG溶液、硼酸鹽緩沖液等（采用PEG法）；
[0045] 膠床介質(zhì)為瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠中的一種；
[0046] 捕獲纖維蛋白原的物質(zhì)購買自Novus公司型號為A-0577的人纖維蛋白原抗體；其 中，本發(fā)明所述與纖維蛋白原特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗FG抗體、抗纖維蛋白原抗體均為捕獲 纖維蛋白原的物質(zhì)；
[0047] 捕獲汞的物質(zhì)購買自巴傲得生物科技有限公司的型號為AP7014的鼠抗HgmAb; 其中，本發(fā)明所述與汞特異性結(jié)合的物質(zhì)、抗Hg抗體、抗汞抗體、汞抗均為捕獲汞的物質(zhì)；
[0048] 酶標(biāo)抗體為含有辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等酶標(biāo)記的抗體中的一種；
[0049] 底物為甲基聯(lián)苯胺（TMB)溶液；
[0050] 洗滌液為含有KH2PO4O. 2mg/ml、Na2HPO4 ? 12H20 2. 90mg/ml、NaC18.Omg/ml、KCl 0? 2mg/ml、0. 5%Tween-20 的pH為 7. 4 的 0? 15MPBS溶液；
[0051] 封閉液為1% -5%牛血清白蛋白或脫脂奶粉；
[