專利名稱：一種表達(dá)載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 涉及一種含有小鼠Musashil基因啟動子和報告基因的表達(dá)載體的制備方法。
背景技術(shù)：
Musashi蛋白是一種高度保守的RNA結(jié)合蛋白，最早在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并被證明 是果蠅神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志之一，大量表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中。現(xiàn)已知Musashi是果蠅神經(jīng)干細(xì) 胞不對稱分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子，它促使干細(xì)胞分裂后，一個細(xì)胞保留自我更新能力，另一個細(xì) 胞具有進一步分化能力，因而被認(rèn)為在干細(xì)胞狀態(tài)的維持、干細(xì)胞分化和腫瘤形成中扮演 重要角色。Musashil基因是其在小鼠的同類基因，在胚胎階段Musashil選擇性在神經(jīng)前 體細(xì)胞高表達(dá)，在成體神經(jīng)干細(xì)胞中同樣可以檢測到Musashil基因表達(dá)。隨后研究表明 Musashil在神經(jīng)干細(xì)胞的干性保持和分化中有關(guān)鍵作用，因此Musashil被認(rèn)為是小鼠神 經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志之一。小腸黏膜是除中樞神經(jīng)系統(tǒng)外另一個高表達(dá)Musashil的組織，提示了 Musashil 基因和腸上皮細(xì)胞的關(guān)系密切。腸黏膜上皮由無數(shù)單層柱狀上皮組成，腸黏膜上皮細(xì)胞終 身不斷快速自我更新，更新周期平均4-6天。因為腸黏膜上皮的快速更新，很早就已經(jīng)有人 推測腸道上皮干細(xì)胞的存在。目前認(rèn)為小腸上皮干細(xì)胞位于小腸隱窩的基底部，距隱窩底 部2-7個細(xì)胞的位置，每個隱窩大約有4-6個；結(jié)腸上皮干細(xì)胞位于結(jié)腸腺體的基底部，每 個隱窩大約有1-4個。腸上皮干細(xì)胞持續(xù)增殖、分化，并向絨毛頂端遷移(潘氏細(xì)胞向下 遷移)，逐漸取代外層終末分化黏膜上皮細(xì)胞，遷移到絨毛頂端的外層細(xì)胞凋亡脫落落入腸 腔，而外層細(xì)胞的死亡脫落與干細(xì)胞的分裂之間又維持一定的平衡。雖然腸上皮干細(xì)胞的存在得到研究者的共識，但是腸上皮干細(xì)胞的標(biāo)志的研究卻 進展不大。2003年，Nishimura等發(fā)現(xiàn)正常的人結(jié)腸標(biāo)本的結(jié)腸隱窩Musashil陽性表達(dá)區(qū) 域位于隱窩的基底部，與腸上皮干細(xì)胞的位置一致。在成年小鼠小腸隱窩，Musashil表達(dá) 于潘氏細(xì)胞之上并緊連于潘氏細(xì)胞的幾個細(xì)胞，Musashil陽性細(xì)胞在腸上皮隱窩的普遍表 達(dá)以及合適的數(shù)目都暗示Musashil陽性細(xì)胞是小腸黏膜上皮干細(xì)胞或者祖細(xì)胞。腸上皮 干細(xì)胞在Musashil基因作用下，一個細(xì)胞維持干細(xì)胞性質(zhì)，停留于腸上皮干細(xì)胞的位置， 分裂產(chǎn)生的另一個細(xì)胞作為腸上皮的前體細(xì)胞-短暫擴增細(xì)胞，這些短暫擴增細(xì)胞繼續(xù)增 殖并逐漸分化，產(chǎn)生潘氏細(xì)胞、吸收上皮細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞。通過對信號通 路的研究，研究者發(fā)現(xiàn)作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，Musashil調(diào)節(jié)Notch信號，最終調(diào)節(jié)Hairy and enhancer of split 1 (Hesl)基因的表達(dá)，這種調(diào)節(jié)最終影響到杯狀細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì) 胞、潘氏細(xì)胞的形成，暗示Musashil和Hesl的共表達(dá)細(xì)胞可能就是腸上皮干細(xì)胞。新近的一些研究雖然使研究者對Musashil基因作為腸上皮干細(xì)胞的標(biāo)志提出疑 問，并報道了 leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (Lgr5)、 Acheate-scute like 2 (ASCL-2) > Doublecortin and CaM kinase-like-1 (DCAMK-I) 選腸上皮干細(xì)胞的標(biāo)志基因，但是無論是Lgr5還是ASCL-2，都不是僅局限表達(dá)于腸黏膜上皮，在其它組織中均有發(fā)現(xiàn)，這些新的候選基因也沒有得到基因敲除實驗的支持。作為較早 作為候選腸上皮干細(xì)胞的標(biāo)志基因，Musashil仍然是腸上皮干細(xì)胞或者祖細(xì)胞的候選基因 之一。Musashil陽性細(xì)胞新出現(xiàn)的部位是位于潘氏細(xì)胞間，且多呈長柱狀，這些細(xì)胞本身就 是另一些新出現(xiàn)的候選腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志基因(例如Lgr5)的陽性部位，并且也有研究者 認(rèn)為腸上皮干細(xì)胞是位于潘氏細(xì)胞之間的長柱狀細(xì)胞。因此，Musashil基因仍可以作為腸 上皮干細(xì)胞或者至少是祖細(xì)胞的候選標(biāo)志基因。 腸上皮干細(xì)胞處在一個微環(huán)境“niche”中?！皀iche”由腸上皮干細(xì)胞周圍間質(zhì)細(xì) 胞和基質(zhì)組成，提供維持腸上皮干細(xì)胞增殖和自我更新所需信號。腸上皮干細(xì)胞具有增生、 自我穩(wěn)定特性(即數(shù)量保持相對穩(wěn)定)，又可產(chǎn)生大量腸黏膜功能細(xì)胞，在腸壁損傷后能再 生修復(fù)腸黏膜，因此，從理論上講腸上皮干細(xì)胞是腸道疾病基因治療的首選靶細(xì)胞。已有研 究證實體外存活生長的腸上皮干細(xì)胞可以被外來基因所轉(zhuǎn)染，因此腸道上皮干細(xì)胞可以成 為基因技術(shù)治療腸道疾病的理想基因載體細(xì)胞。而對于腸上皮干細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p失，干細(xì)胞 移植可能是唯一能夠用于治療的方法。要實現(xiàn)腸上皮干細(xì)胞的移植治療首選是要獲取足夠 的腸上皮干細(xì)胞，而目前無法從腸黏膜大量獲得腸上皮干細(xì)胞。對于骨髓干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞兩類常見的干細(xì)胞在腸道功能修復(fù)中的利用的研 究也不斷深入。其中，骨髓干細(xì)胞易于獲取，但因為存在免疫排斥、感染、GVHD等并發(fā)癥，大 大限制了造血干細(xì)胞(Allo-HSCT)在腸道功能修復(fù)中的利用隨著自體外周血造血干細(xì)胞 移植(Auto-PBSCT)的普及。而且由于Allo-HSCT在腸道功能修復(fù)過程中有效成分、病情恢 復(fù)的機制和治療的有效性等方面均不能完全確定。因此，骨髓干細(xì)胞目前還不能作為腸上 皮干細(xì)胞損傷移植治療和腸上皮干細(xì)胞研究的理想來源細(xì)胞。對于胚胎干細(xì)胞，其作為一 種全能性干細(xì)胞，在個體發(fā)育過程中可分化各種組織器官的細(xì)胞系，為移植醫(yī)學(xué)奠定了理 論基礎(chǔ)。胚胎干細(xì)胞的分離成功及體外誘導(dǎo)分化研究成果顯示了其在干細(xì)胞移植具有較好 的應(yīng)用前景。研究表明體外培養(yǎng)的腸上皮干細(xì)胞移植到小腸后，仍可以繼續(xù)存活、增生和分 化，為腸上皮干細(xì)胞移植提供了實驗依據(jù)。但是如果要從胚胎干細(xì)胞衍生的細(xì)胞中分離出 腸上皮干細(xì)胞，重要的一環(huán)是找到腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志。目前候選的腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志有 Musashil、Lgr5、ASCL-2等。而其中研究歷史最久，最深入的候選腸上皮干細(xì)胞標(biāo)志基因是 Musashi 1，獲取足夠的Musashil陽性細(xì)胞能夠促進腸上皮干細(xì)胞的研究，為腸道難治性疾 病的干細(xì)胞移植治療或者基因治療提供重要研究基礎(chǔ)和細(xì)胞來源。同時因為Musashil和 多種腫瘤的增殖有關(guān)，獲取Musashil陽性細(xì)胞有利于對Musashil基因的研究，從而更好地 理解腫瘤的生物學(xué)特性。但是Musashil蛋白存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞膜表面不表 達(dá)，無法根據(jù)Musashil蛋白表達(dá)情況采用流式細(xì)胞儀(FACS)或磁珠細(xì)胞分選(MACS)的方 法進行Musashil蛋白陽性細(xì)胞的分選。而現(xiàn)有的方法需要對細(xì)胞進行化學(xué)固定或細(xì)胞膜 打孔，才能使用Musashil抗體結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的Musashil蛋白，進而實現(xiàn)Musashil細(xì)胞的標(biāo) 記或分選，但經(jīng)過固定或打孔的細(xì)胞均已死亡，失去了細(xì)胞的活性，難以進行后續(xù)細(xì)胞功能 的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備表達(dá)載體的方法，采用該方法制備得到的表達(dá)載體 含有小鼠Musashil基因啟動子和報告基因，該報告基因由小鼠Musashil基因啟動子調(diào)控表達(dá)，根據(jù)報告基因的表達(dá)信號，便于在保證細(xì)胞活性的情況下分選出Musashil陽性表達(dá) 細(xì)胞。為實現(xiàn)上述本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了一種表達(dá)載體的制備方法，其包括基因 重組的步驟，該基因重組步驟將含有小鼠Musashi 1基因啟動子的目的DNA片段插入到基礎(chǔ) 載體中含有或者插入的報告基因的上游，該報告基因由小鼠Musashil基因啟動子調(diào)控表 達(dá)。優(yōu)選地，含有小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片段包含小鼠Musashil基因 翻譯起始點(ATG)。作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片段為包含小 鼠Musashil基因翻譯起始點(ATG)上游5'非翻譯區(qū)的823bp序列，以及翻譯起始點(ATG) 下游的316bp基因片段。
作為本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，含有小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片段具有 SEQ ID NO 1 的序歹Ij。優(yōu)選地，報告基因為綠色熒光蛋白(GTP)報告基因。優(yōu)選地，基因重組步驟之前包括含有小鼠Musashi 1基因啟動子的目的DNA片段的 獲取，該獲取步驟包括(1)分析小鼠Musashil基因啟動子序列的位置和長度；(2)設(shè)計所 要克隆的小鼠Musashil基因啟動子片段的引物對；(3)PCR擴增，純化擴增產(chǎn)物，即獲得小 鼠Musashil基因啟動子目的片段。優(yōu)選地，引物對為SEQ ID NO :2_3所示的寡核苷酸SEQ ID NO 2 5' _cttcttcgagagtgctctgctgactta_3‘；SEQ ID NO 3 5 ‘ -gcactctcgaggaaggagatgactacatga-3‘；或者SEQ ID NO :2 3所示的寡核苷酸的互補鏈。優(yōu)選地，基礎(chǔ)載體為pAcGFPl-Ι質(zhì)粒載體；含有小鼠Musashil基因啟動子的目的 DNA片段和小鼠Musashil基因啟動子在該質(zhì)粒載體的插入?yún)^(qū)域均含有多克隆酶切位點。優(yōu)選地，基因重組步驟包括以下步驟(1)將含有Musashil基因啟動子的目的DNA片段和pAcGFPl_l質(zhì)粒載體的雙酶 切；(2)酶切后將含有Musashil基因啟動子的目的DNA片段和pAcGFPl-Ι質(zhì)粒載體的 酶連；(3)篩選酶連后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞進行大量擴增。優(yōu)選地，多克隆酶切位點為Ecl 136II和BamHI雙酶切位點。本發(fā)明的表達(dá)載體的制備方法，在基因重組步驟將含有小鼠Musashil基因啟動 子的目的DNA片段插入到基礎(chǔ)載體中含有或者插入的報告基因的上游，得到的表達(dá)載體含 有小鼠Musashil基因啟動子和報告基因，該報告基因在小鼠Musashil基因啟動子調(diào)控表 達(dá)，由于載體中Musashil啟動子序列和內(nèi)源性Musashil啟動子的結(jié)構(gòu)一致，使結(jié)合蛋白 啟動內(nèi)源性Musashil啟動子的同時也啟動轉(zhuǎn)染入細(xì)胞的外源性Musashil啟動子，在小鼠 Musashil基因啟動子調(diào)控下報告基因得到表達(dá)，根據(jù)報告基因的表達(dá)信號，便于在不影響 細(xì)胞活性的情況下分選出Musashil陽性表達(dá)細(xì)胞。在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式中，以 pAcGFPl-Ι質(zhì)粒為基礎(chǔ)，將包含小鼠Musashil基因翻譯起始點(ATG)的目的DNA片段插入至綠色熒光(GTP)報告基因編碼序列的上游，調(diào)控GFP報告基因的表達(dá)，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMsil-GFP，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，表達(dá)產(chǎn)生的GFP發(fā)出綠色熒光，根據(jù)這個信號表達(dá)特點，應(yīng)用流式 細(xì)胞儀可以直接分選出Musashil陽性表達(dá)細(xì)胞，不影響細(xì)胞的活性。另外，由于分離后的 Musashil陽性細(xì)胞仍具有活性，能發(fā)揮其多向分化的能力，可以繼續(xù)增殖、分化；另外，在 該優(yōu)選實施方式中，報告基因是GFP基因，表達(dá)不受生物類型、基因型和細(xì)胞組織類型的限 制，適用范圍廣，且能通過熒光強度的變化反映目的基因表達(dá)水平，便于Musashil陽性表 達(dá)細(xì)胞分選和細(xì)胞特性的研究。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體附圖和具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。 應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。


圖1是質(zhì)粒pMsi I-GFP結(jié)構(gòu)㈧空載體pAcGFPl_l的結(jié)構(gòu)圖；⑶所插入的 Musashil啟動子片段示意圖。圖2(A)是mESCs不同時期分化細(xì)胞轉(zhuǎn)染pMsil-GFP和pPAcGFPl-Ι的熒光表達(dá)示 意圖。分別轉(zhuǎn)染mESCs、第7天分化細(xì)胞、第10天分化細(xì)胞。以Hochest染細(xì)胞核，轉(zhuǎn)染24小 時后在熒光顯微鏡下觀察。Bars = 25 μ m。(B, C)是將pMsil-GFP (上組)和pAcGFPl_l (下 組)轉(zhuǎn)染mESCs、第7天分化細(xì)胞、第10天分化細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24小時后以流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn) 染后GFP陽性細(xì)胞率。圖3是pMsiI-GFP轉(zhuǎn)染入mESCs第10天分化細(xì)胞24小時后流式細(xì)胞儀分選出的 GFP陽性細(xì)胞。圖4是pMsiI-GFP轉(zhuǎn)染入mESCs第10天分化細(xì)胞24小時后流式細(xì)胞儀分選圖。圖5是pMsiI-GFP轉(zhuǎn)染入mESCs第10天分化細(xì)胞，24小時后流式細(xì)胞儀分選出的 GFP陽性細(xì)胞、陰性細(xì)胞組中Musashil蛋白的western blot檢測。
具體實施例方式下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等 分子克隆實施手冊中所述的條件。在本發(fā)明的說明書和權(quán)利要求書中，術(shù)語“基礎(chǔ)載體”是指在未經(jīng)過本發(fā)明中的基 因重組步驟的分子生物學(xué)載體，在基礎(chǔ)載體載體中可以包含報告基因，也可以通過常用的 基因工程方法將報告基因預(yù)先插入到基礎(chǔ)載體中。如在本發(fā)明的一種具體實施方式
中，優(yōu) 選pAcGFPl-Ι質(zhì)粒載體作為基礎(chǔ)載體，在進行本發(fā)明中的基因重組步驟步驟前，pAcGFPl-1 質(zhì)粒載體就已經(jīng)含有GFP基因片段。本發(fā)明的以下實施方式中，以含綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的pAcGFPl-Ι質(zhì)粒 為基礎(chǔ)載體，在GFP編碼序列的上游插入小鼠Musashil基因啟動子，構(gòu)建由小鼠Musashil 基因特異啟動子調(diào)控表達(dá)的GFP報告基因重組質(zhì)粒pMsil-GFP。在該實施方式中，采用PCR的方法，以小鼠基因組DNA為模版，在成功克隆出含有 Musashil啟動子目的DNA片段后，經(jīng)純化、測序鑒定，而后以報告基因載體質(zhì)粒pAcGFPl_l 為基本質(zhì)粒骨架，運用酶切、連接等基因重組手段，在GFP編碼序列的上游插入小鼠 Musashil基因啟動子，構(gòu)建由小鼠Musashil基因特異啟動子調(diào)控表達(dá)的GFP報告基因重組質(zhì)粒pMsi I-GFP (重組質(zhì)粒pMsi I-GFP結(jié)構(gòu)如圖1所示)。然后將pMsi I-GFP轉(zhuǎn)化進大腸桿 菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞擴增，制備出含有Musashil基因啟動子和GFP報告基因的重組質(zhì)粒。另外，為了說明本發(fā)明技術(shù)效果，在本發(fā)明的實施例中，將構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染入小鼠胚胎干細(xì)胞分化而來的細(xì)胞群(表達(dá)Musashi 1)，使其能在細(xì)胞中表達(dá)，然后用流 式細(xì)胞儀分選表達(dá)GFP報告基因的陽性細(xì)胞。得到的Musashil陽性細(xì)胞進一步檢測其細(xì) 胞增殖能力、Musashil蛋白和mRNA表達(dá)水平，從而評價利用上述方法所構(gòu)建的pMsil_GFP 能否用于Musashil陽性細(xì)胞的活性分離。本發(fā)明涉及的小鼠胚胎干細(xì)胞、大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞、含有GFP報告基因的 pAcGFPl-Ι質(zhì)粒載體及其他試劑盒和生化材料均可通過市購取得，而且在下列實施例中對 實驗中采用的實驗材料來源均有說明。實施例1、重組質(zhì)粒pMsiI-GFP的構(gòu)建及獲取
1、小鼠Musashil啟動子的擴增、純化利用 Takara 公司的 Universal Genomic DNA Extraction Kit 從小鼠胚胎干細(xì)胞 中提取DNA。根據(jù)小鼠Musashil基因結(jié)構(gòu)，分析出其可能的啟動子序列位置，設(shè)計兩端引物Primerl :5，-CTT CTT CGA GAG TGC TCT GCT GAC TTA-3，Primer2 :5，-GCA CTC TCG AGG AAG GAG ATG ACT ACA TGA-3，利用Takara公司的Premix PrimeSTAR HS試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)條 件:95°C,預(yù)變性 5min，94°C，40s ；60 °C, Imin ；72 °C，Imin ；在 PCR 儀上進行 30 個循環(huán)， 72°C延伸7min。取PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，利用Omega公司的Agarose Gel DNAPurification Kit 回收 PCR 產(chǎn)物。2、Musashil基因啟動子和pAcGFPl_l質(zhì)粒載體的雙酶切和酶連回收到的產(chǎn)物和pAcGFPl-Ι質(zhì)粒載體用Ecll36II和BamHI雙酶切后通過瓊脂糖 凝膠電泳回收，然后利用Takara公司的DNA Ligation Kit LONG將酶切回收的pAcGFPl_l 質(zhì)粒載體和Musashil基因啟動子序列進行酶連反應(yīng)。3、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞及擴增(1)大腸桿菌DH-5 α冷凍保存的菌種，挑取一環(huán)，劃線接種在LB固體培養(yǎng)基平板 上(活化菌種)，37°C培養(yǎng)過夜(約16小時)。(2)從長好的平板上挑取一個單菌落，轉(zhuǎn)接在含有3ml LB液體培養(yǎng)基的試管中， 37°C振蕩培養(yǎng)過夜(約16小時)。(3)取0. 3ml菌液接種于20ml LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C振蕩培養(yǎng) 2 3小時，待OD6tltl值達(dá)到0. 3 0. 4時，取下三角瓶，立即置冰浴10 15分鐘。(4)將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個滅菌的50ml離心管中，4°C 3000r/min離心10分鐘，棄去上 清液(盡可能將所有的上清液去凈)，收集菌體。(5)加入20ml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液，重新懸浮菌體，使菌體分散均勻， 置冰浴中30分鐘。(6) 40C 3000r/min離心10分鐘，棄去上清液(盡可能將所有的上清液去凈)。(7)再加入2ml用冰預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2溶液，小心重新懸浮菌體(操作要輕)。 在4°C冰箱中放置12 24小時，即可應(yīng)用于DNA轉(zhuǎn)化。
(8)取大腸桿菌DH_5a新鮮感受態(tài)細(xì)胞100 μ 1于1. 5ml Eppendorf管中，加入 50 IOOng質(zhì)粒pMsill-GFP DNA，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰浴中放置30分鐘。(9)42°C熱休克120秒，不要搖動Eppendorf管。(10)加入LB液體培養(yǎng)基900 μ 1，37°C保溫60分鐘。(Il)LB固體培養(yǎng)基劃菌在無菌操作臺中，用接種環(huán)將100μ 1轉(zhuǎn)化液劃菌于 1.5%含卡那霉素(50yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，37°C恒溫倒置，至單菌落出現(xiàn)(約14-16 小時)；
(12)在無菌操作臺中，挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的單菌落，接種于3. OmlLB(含 50μ g/ml的卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜，至OD 600nm為0. 4-0. 5
時停止培養(yǎng)。(13)在無菌操作臺中，取100ml LB培養(yǎng)基(含50 μ g/ml的卡那青霉素)移入 500ml無菌錐形瓶中，再往LB培養(yǎng)基中加入0. 2ml菌液(1 %接種量)，37°C，250rpm振蕩培 養(yǎng)過夜，至OD 600nm為0. 4-0. 5時停止培養(yǎng)(約12-16小時)；(14)搖菌結(jié)束后，將100ml LB培養(yǎng)基分次放入50ml無菌離心管中，加入室溫 IOOOOrpm離心，5min,棄上清，將離心管倒置，使液體盡可能流盡。4、pMsill-GFP重組質(zhì)粒的提取步驟簡述如下(1)柱平衡步驟向吸附柱CP5中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2. 5ml的平 衡液BL，10，OOOrpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；(2)取IOOml過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，室溫10，OOOrpm離心3分鐘收集細(xì)菌，
盡量吸除上清；(3)盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水 滴；(4)向留有菌體沉淀的離心管中加入7ml溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底 懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀；(5)向離心管中加入7ml溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次，室溫放置5分鐘；(6)向離心管中加入7ml溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6_8次，充分混勻，此時會 出現(xiàn)白色絮狀沉淀。然后室溫放置10分鐘左右。10，OOOrpm離心5-10分鐘，將溶液全部倒 入過濾器CS中，慢慢推動推柄過濾，濾液收集在干凈的50ml的管中；(7)向濾液中加入0. 3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP5中 (吸附柱放入50ml收集管中)；(8)室溫10，OOOrpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管 中；(9)向吸附柱中加入IOml漂洗液PW，10，OOOrpm離心2分鐘，棄掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中；(10)重復(fù)操作步驟9。(11)向吸附柱中加入3ml無水乙醇，室溫10，OOOrpm離心2分鐘，倒掉廢液；(12)將吸附柱CP5重新放回收集管中，將吸附柱CP5開蓋，置于室溫放置5分鐘， 10，OOOrpm離心5分鐘；
(13)將吸附柱CP5置于一個干凈的50ml收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 1. 5ml洗脫緩沖液TB,室溫放置5分鐘，然后室溫10, OOOrpm離心2分鐘。將50ml離心管 中的洗脫液全部移入一個干凈的1. 5ml離心管，-20°C保存。5、質(zhì)粒濃度的檢測和質(zhì)粒DNA的初步鑒定通過以下測試(1)取質(zhì)粒測序；(2)取質(zhì)粒在分光光度儀上測OD 260nm及OD 280nm ；
(3)1%瓊脂糖凝膠電泳。鑒定質(zhì)粒的濃度，分子量大小和純度。
實施例2、重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的觀察1、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染在誘導(dǎo)第3天時接種細(xì)胞至6孔培養(yǎng)板中，每孔接種2 X 105個細(xì)胞。24小時后細(xì) 胞貼壁，進行脂質(zhì)體介導(dǎo)下的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，使用LipofectamineTiCOOO試劑按以下步驟 進行(1)棄去待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的舊液，用0. IM PBS洗一遍，棄去PBS ；(2)在6孔板的細(xì)胞中加入0. 5ml Opti-MEM I，同時用無菌1. 5ml離心管配制A 劑pMSI I-GFP 質(zhì)粒載體 DNA 2 μ g，用 Opti-MEM I 補充至體積為 250 μ 1 ；B 劑:LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑 8 μ 1 十 Opti-MEM I 242 μ 1 ；5分鐘后使A劑和B劑混合，再過20分鐘后一起加入6孔板細(xì)胞中，與既有的0. 5ml Opti-MEM I組成Iml的轉(zhuǎn)染體系。(3)在37°C，5% C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h ；(4)去除轉(zhuǎn)染試劑，0. IM PBS洗1遍，加入2ml培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。2、轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)的觀察(1)用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光的表達(dá)情況；以pMsi I-GFP和基礎(chǔ)質(zhì)粒pAcGFPl_l轉(zhuǎn)染mESCs不同時期的分化細(xì)胞。根據(jù)mESCs 分化細(xì)胞的Musashil mRNA表達(dá)規(guī)律，選擇mESCs、第7天分化細(xì)胞、第10天分化細(xì)胞進行 轉(zhuǎn)染。為了更好觀察綠色熒光，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時后，以Hochest染色細(xì)胞核，然后在熒光 顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞。如圖2、3所示，轉(zhuǎn)染24小時后，在第8天分化細(xì)胞中可以看到少量 的綠色熒光表達(dá)，而第11天分化細(xì)胞看到更多綠色熒光；而在空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，3種細(xì)胞均未 見熒光表達(dá)。將各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞進行流式細(xì)胞儀檢測GFP陽性細(xì)胞率，可見轉(zhuǎn)染pMsil-GFP 的第11天分化細(xì)胞GFP陽性細(xì)胞率最高。(2)采用流式細(xì)胞儀分選GFP陽性組分；將pMsiI-GFP轉(zhuǎn)染入mESCs第10天分化細(xì)胞，24小時后以流式細(xì)胞儀進行分選。 如圖4所示，分選后的GFP陽性細(xì)胞仍表達(dá)綠色熒光。如圖5所示，流式細(xì)胞儀分選后1小 時，細(xì)胞尚未貼壁，細(xì)胞呈小圓形，全部細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光。(3)使用實時定量PCR及western blots測定GFP陽性細(xì)胞中Musashil的表達(dá)情 況，并與GFP陰性細(xì)胞比較。mESCs第10天分化細(xì)胞轉(zhuǎn)染pMsil_GFP 24小時后，流式細(xì)胞儀分選出的GFP陽性 細(xì)胞、GFP陰性細(xì)胞和未分選的轉(zhuǎn)染后的mESCs第11天分化細(xì)胞中(簡稱未分選細(xì)胞)的Musashil mRNA相對表達(dá)量，和未分選細(xì)胞中的Musashil mRNA相對表達(dá)量比較，GFP陽性 細(xì)胞和GFP陰性細(xì)胞的MusashilmRNA相對表達(dá)量分別為15. 9士3. 40和0. 8士0. 20。分選 出的GFP陽性細(xì)胞中的Musashil mRNA相對表達(dá)量明顯高于未分選細(xì)胞組和GFP陰性細(xì)胞組。提取分選出的GFP陽性和GFP陰性細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)BCA定量后以westernblot 方法檢測Musashil蛋白在分選出的2組細(xì)胞中的表達(dá)差異。結(jié)果顯示，在GFP陽性細(xì)胞中 可以檢測到Musashil蛋白表達(dá)，而在GFP陰性細(xì)胞中未見Musashil蛋白表達(dá)(如圖6所 示)。進一步驗證了所構(gòu)建的PMsil-GFP表達(dá)能夠同步反映細(xì)胞內(nèi)源Musashil蛋白的表 達(dá)?？梢哉J(rèn)為分選出的GFP陽性細(xì)胞是Musashil陽性細(xì)胞。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護 范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù) 方案的實質(zhì)和 范圍。
權(quán)利要求
一種制備表達(dá)載體的方法，其包括基因重組的步驟，該基因重組的步驟將含有小鼠Musashi1基因啟動子的目的DNA片段插入到基礎(chǔ)載體中含有或者插入的報告基因的上游，所述報告基因由小鼠Musashi1基因啟動子調(diào)控表達(dá)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含有小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片 段包含小鼠Musashil基因翻譯起始點。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片段為 包含小鼠Musashil基因翻譯起始點上游5'非翻譯區(qū)的823bp序列，以及翻譯起始點下游 的316bp基因片段。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述含有小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片 段具有SEQ ID NO 1的序列。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述報告基因為綠色熒光蛋白報告基因。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述基因重組步驟之前包括含有小鼠Musashil基 因啟動子的目的DNA片段的獲取，該獲取步驟包括(1)分析小鼠Musashil基因啟動子序 列的位置和長度；(2)設(shè)計所要克隆的小鼠Musashil基因啟動子片段的引物對；(3)PCR擴 增，純化擴增產(chǎn)物，即獲得小鼠Musashil基因啟動子目的片段。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述引物對為SEQID N0:2-3所示的寡核苷酸SEQ ID NO :2 -cttcttcgagagtgctctgctgactta-3‘；SEQ ID NO 3 5' -gcactctcgaggaaggagatgactacatga-3‘；或者SEQ ID NO :2 3所示的寡核苷酸的互補鏈。
8.如權(quán)利要求1 6所述的方法，其中，所述基礎(chǔ)載體為pAcGFPl-Ι質(zhì)粒載體，所述含 有小鼠Musashil基因啟動子的目的DNA片段和小鼠Musashil基因啟動子在該質(zhì)粒載體的 插入?yún)^(qū)域均含有多克隆酶切位點。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述基因重組步驟包括以下步驟(1)將含有Musashil基因啟動子的目的DNA片段和pAcGFPl_l質(zhì)粒載體的雙酶切；(2)酶切后將含有Musashil基因啟動子的目的DNA片段和pAcGFPl_l質(zhì)粒載體的酶連；(3)篩選酶連后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞進行大量擴增。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述多克隆酶切位點為Ecll36II和BamHI雙酶切 位點。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備表達(dá)載體的方法，其包括基因重組的步驟，該基因重組的步驟將含有小鼠Musashi1基因啟動子的目的DNA片段插入到基礎(chǔ)載體中含有或者插入的報告基因的上游，該報告基因由小鼠Musashi1基因啟動子調(diào)控表達(dá)。采用本發(fā)明的表達(dá)載體的制備方法，得到的表達(dá)載體含有小鼠Musashi1基因啟動子和報告基因，根據(jù)報告基因的表達(dá)信號，便于在保證細(xì)胞活性的情況下分選出Musashi1陽性表達(dá)細(xì)胞。
文檔編號C12N15/66GK101985629SQ201010244610
公開日2011年3月16日 申請日期2010年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月4日
發(fā)明者于濤, 陳其奎 申請人:于濤;陳其奎