一種新型真核表達系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明的一種新型真核表達系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明設(shè)計不同長度的PolyA轉(zhuǎn)錄終止基因序列，并采用雙啟動子的表達方式構(gòu)建新型真核表達系統(tǒng)。用于目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)表達，可以提高目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)表達量。
【專利說明】
一種新型真核表達系統(tǒng)、其構(gòu)建方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一種新型真核表達系統(tǒng)、其構(gòu) 建方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] CH0表達系統(tǒng)是被目前被廣泛應(yīng)用于大分子蛋白藥物制備的真核表達系統(tǒng)。尤其 是抗體類藥物，大部分均為CH0表達系統(tǒng)表達。CH0細胞屬于哺乳動物細胞，其進化程度高， 有完善的蛋白翻譯及修飾系統(tǒng)(含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體)，因而其表達的蛋白從結(jié)構(gòu) 到功能均與人體內(nèi)蛋白相近，作為藥用蛋白，副作用的風(fēng)險較小。其次，通過成熟的CH0表 達平臺，創(chuàng)新性表達Fab片段，加上特異性載體構(gòu)建，可以高效率的制備復(fù)雜結(jié)構(gòu)的大分子 蛋白，包括抗體類藥物，其表達量一般都達到克每升的水平，遠高于原核表達系統(tǒng)。
[0003] 對于當(dāng)今生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)而言，如何更經(jīng)濟的進行重組蛋白的大規(guī)模表達、純化，已 成為日益重要的問題。一般而言，重組蛋白的表達主要通過將編碼目的蛋白的基因插入到 相應(yīng)的表達載體后，利用哺乳動物細胞工程株或大腸桿菌細胞工程株進行生產(chǎn)。產(chǎn)生的重 組蛋白質(zhì)要么直接分泌到細胞外的培養(yǎng)基中，要么就定留在細胞內(nèi)部。對于后者而言，目的 蛋白的純化過程就需要增加裂解細胞的步驟，比如超聲波法、滲透壓休克法、酶解法等。但 是這些裂解細胞的方法都會漿細胞中的其它蛋白釋放出來，繼而增加了后續(xù)純化的壓力。 同樣的，對于直接分泌到胞外的蛋白而言，由于培養(yǎng)過程中細胞的希望，也會釋放出細胞宿 主蛋白，進而影響下游純化。對于治療用的蛋白藥物(如抗體)，往往需要較高的純度來保證 避免雜質(zhì)帶來的毒性或免疫原性。
[0004] 至今為止，抗體及抗體片段的生產(chǎn)主要是依靠哺乳動物細胞，但也有大腸桿菌 E. coli及酵母(畢赤酵母)等系統(tǒng)被使用。選擇何種生產(chǎn)方式主要決定于抗體產(chǎn)品的種類、 生產(chǎn)規(guī)模、成本、關(guān)鍵風(fēng)險及生物安全性（Humphreys and Glover, 2001)。此外，也要考慮發(fā) 酵平臺的成本、操作時間、培養(yǎng)基添加物、資產(chǎn)折舊，以及"下游過程"。而然，對于抗體類的 蛋白藥物而言，目前幾乎都是使用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。雖然哺乳動物細胞表達系統(tǒng)有 生產(chǎn)成本高，周期長的缺點，但其優(yōu)勢也非常明顯：有完善的翻譯修飾系統(tǒng)，表達的重組蛋 白空間結(jié)構(gòu)正確率高，即哺乳動物細胞系統(tǒng)表達的蛋白藥物質(zhì)量要遠高于原核表達系統(tǒng)。
[0005] 生物制藥領(lǐng)域中宿主細胞的選擇需要關(guān)注以下幾個重要的方面：糖基化及其他翻 譯后修飾類型避免帶來免疫原性；宿主細胞適于生物反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)，并能在無動物 源性成分的化學(xué)成分限定性（chemically defined and animal component free，ACDF)培 養(yǎng)基中生長至高密度；病毒安全性；適于在ACDF中進行克隆及壓力篩選。
[0006] 已經(jīng)獲得FDA、EMA批準的多數(shù)治療性單克隆抗體選用CH0細胞作為宿主細胞，另 外還有少量選用小鼠骨髓瘤細胞系，如NS0和SP2/0-Agl4。另外還有BHK21、HEK293、HKB11 等細胞用于蛋白穩(wěn)定表達的報道。另外還有人視網(wǎng)膜母細胞瘤Per. C6用于抗體穩(wěn)定表達。 其他用于蛋白穩(wěn)定表達的細胞還有鳥類胚胎干細胞EB66、人神經(jīng)元細胞以及轉(zhuǎn)化的人原代 細胞等。
[0007] CH0細胞可以在生物反應(yīng)器中高密度生長，易于進行基因操作，N-糖基化類型與 人類相似，較低的病毒傳播風(fēng)險，因此廣泛用于生物制藥領(lǐng)域。工業(yè)生產(chǎn)中最常使用的克隆 為 CH0-K1，CH0-DXB11 和 CH0-DG44。CH0-K1 與原代 CH0 近似，而 DXB11 和 DG44 為經(jīng)過隨機 突變?nèi)笔HFR基因，從而可以通過代謝缺陷標記進行基因擴增。CH0-K1使用GS篩選系統(tǒng)， 但GS在CH0-K1中有內(nèi)源性表達，因而降低了篩選的效率。
[0008] 高效的表達系統(tǒng)，除了表達細胞外，表達載體的構(gòu)建也十分關(guān)鍵。表達載體中，啟 動子、增強子、信號肽以及poly A尾對于轉(zhuǎn)錄及翻譯非常關(guān)鍵。其中poly A尾對于目的 mRNA的合成至關(guān)重要，因為它通過影響轉(zhuǎn)錄的終止效率直接決定了 mRNA的數(shù)量，而mRNA 的量會進而影響翻譯，即目的蛋白的產(chǎn)量。通過比較不同來源的poly A尾，發(fā)現(xiàn)了它們之 間有一定的同源性，可以判斷有共同的功能特點。在連續(xù)的A之后，有能夠形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的 stem序列及l(fā)oop序列，最后有連續(xù)T的序列。
[0009] 目前最為常用的poly A序列是：SV40p〇lyA，然而有研究發(fā)現(xiàn)，選擇合適的poly A 可以有效增高目的蛋白的表達量。
[0010] 然而，目前還未有一種通用的polyA序列可以用于所有的表達系統(tǒng)。因此，有必要 設(shè)計一種P〇ly A序列，可以持續(xù)地，直接有效地增加表達產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了尋找最佳的P〇ly A序列，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計了 16種不同的poly A序列。 為了評估這16種序列的效果，它們被用于表達一種抗體Fab片段，Ranitizumab。
[0012] Ranibizumab是FDA批準的首個用于治療年齡相關(guān)性黃斑退行性病變的VEGF拮抗 劑(抗體Fab段)。但是目前上市的Ranibizumab是由大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的，存在產(chǎn)量 低及存在非正確折疊的缺陷，造成該藥品的價格較高及有潛在的副作用的風(fēng)險。
[0013] 本發(fā)明用Ranibizumab來驗證該新型真核表達系統(tǒng)，主要的考察參數(shù)包括mRNA的 量及蛋白產(chǎn)量。mRNA的檢測通過半定量PCR進行分析，而蛋白產(chǎn)量直接檢測。
[0014] 本發(fā)明公開了 ： 1、一種新型真核表達系統(tǒng)，其特征在于，所述真核表達載體含有不同長度的PolyA轉(zhuǎn) 錄終止序列。
[0015] 2、上述的一種新型真核表達系統(tǒng)，其中所述真核表達載體含有的PolyA轉(zhuǎn)錄終止 序列具有 5 ' GACGAATTCCAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCAAATCGGGGGGCCTTT TTTATTTTTTTCTT 3'的序列。
[0016] 3、上述的一種新型真核表達載體，其中所述載體含有雙啟動子連接目標蛋白質(zhì)的 基因序列。
[0017] 4、上述的一種新型真核表達載體，其中所述蛋白質(zhì)選自完整抗體、抗體片段、細胞 因子和其他類似物。
[0018] 5、上述的一種新型真核表達載體，其中所述蛋白質(zhì)為抗體。
[0019] 6、上述的一種新型真核表達載體，其中所述蛋白質(zhì)為Ranitizumab。
[0020] 7、一種載體，含有權(quán)利要求1、2、3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性 相連的表達調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZE0 ( + )，pDHFR之 〇
[0021] 8、上述一種新型真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述宿主細胞為真核哺 乳動物細胞CH0。
[0022] 9、一種新型真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： a) 設(shè)計合成新型轉(zhuǎn)錄終止序列； b) 設(shè)計合成雙啟動子連接的目標抗體輕鏈、重鏈基因序列； c) 將a)、b)所得基因序列連接，構(gòu)建新型重組質(zhì)粒； d) 利用步驟c)所得核苷酸片斷構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選高表達克隆； e) 通過檢測目標蛋白質(zhì)mRNA表達水平及目標蛋白質(zhì)的表達量來篩選最佳表達系統(tǒng) 10、一種新型真核表達體統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，提高目標蛋白質(zhì)的表達量。
[0023] 11、上述一種新型真核表達系統(tǒng)用于表達完整抗體或抗體片段或細胞因子或其他 類似物。
[0024] 本發(fā)明設(shè)計了 16種不同長度的PolyA轉(zhuǎn)錄終止序列，并采用雙啟動子的形式構(gòu)建 新型真核表達系統(tǒng)，通過檢測目標蛋白質(zhì)的mRNA的含量及檢測目標蛋白質(zhì)的表達量來篩 選該新型真核表達系統(tǒng)。通過驗證，其中優(yōu)選實施例為具有PA9序列的PolyA轉(zhuǎn)錄終止序 列。
[0025] 該新型真核表達系統(tǒng)可用于完全抗體及抗體片段及細胞因子及其他蛋白質(zhì)的表 達，使用該新型真核表達系統(tǒng)，其目標蛋白質(zhì)的表達量較一般的表達系統(tǒng)的表達量高，可以 降低目標蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本，可以減少或者及社會的經(jīng)濟負擔(dān)。
【附圖說明】
[0026] 圖1、在輕鏈末尾的polyA序列的5'端加上Hind III酶切位點，3'加上Kpn I酶 切位點載體構(gòu)建示意圖 圖2、在重鏈末尾的polyA序列的5'端加上Not I酶切位點，3'加上Xho I酶切位點 載體構(gòu)建示意圖 圖3、P-HL-2P載體構(gòu)建示意圖 圖4、不同長度PolyA細胞株的目標蛋白質(zhì)的mRNA定量比較 圖5、不同長度PolyA細胞株的目標蛋白質(zhì)的表達量比較 圖6、表達的Ranibizumab的LC/MS質(zhì)譜分析圖。
【具體實施方式】
[0027] 以下實施例、實驗例進一步詳細地描述本發(fā)明。然而應(yīng)當(dāng)理解，列舉這些實施例、 實驗例只是為了起說明作用，而并不是用來限制本發(fā)明。
[0028] 實施例1、載體構(gòu)建 設(shè)計不同長度的PolyA的核酸序列(轉(zhuǎn)錄終止序列)，其序列見表1。
[0029] 表1、不同長度PolyA的核酸序列
設(shè)計合成所需表達的抗體或抗體片段的核酸序列，在3'端加上新型專利終止序列，連 接如真核細胞高效表達載體中，獲得新型真核高效表達載體。
[0030] 實施例2、目標蛋白基因合成 以Ranibizumab為例，作為目標蛋白進行構(gòu)建新型表達載體，并對該新型表達載體進 行驗證。
[0031] 根據(jù)專利W01998045331A中所公開的Ranibizumab的基因序列，合成所表達目的 蛋白的核酸序列。
[0032] 實施例3、新型表達載體的構(gòu)建 雙啟動子載體構(gòu)建示意圖如圖1、圖2、圖3所示： 在輕鏈末尾的polyA序列的5'端加上Hind III酶切位點，3'加上Kpn I酶切位點，如 圖1所示。
[0033] 在重鏈末尾的polyA序列的5'端加上Not I酶切位點，3'加上Xho I酶切位點， 如圖2所示。
[0034] 使用Hindlll與Kpn I雙酶切，以及Not I和Xho I雙酶切在輕重鏈的末端引入 不同的polyA序列。構(gòu)建好的在天體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1進行擴增，并測序驗證。測序正確， 用BamHI和Xhol將重鏈表達相關(guān)片段切下，連入含輕鏈片段的載體中，組成新型表達載體 P-HL-2P連接pcDNA3. 1 ( + )用于后續(xù)轉(zhuǎn)染。
[0035] P-HL-2P，其結(jié)構(gòu)如圖3所示。 實施例4、轉(zhuǎn)染宿主細胞 對不同的表達載體，使用相同量的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑(脂質(zhì)體)，轉(zhuǎn)染相同數(shù)量的CH0細胞 (1 X 106/孔)，培養(yǎng)48h后將細胞轉(zhuǎn)接入搖瓶，培養(yǎng)7天后取上清檢測目的蛋白的表達量，同 時收集細胞檢測mRNA。
[0036] 實驗例l、mRNA比較研究 (1) 細胞總RNA的提?。?a) 6孔板細胞（CNE-2)匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次后， 每孔加TRIZ0L試劑（Gibco公司）1 ml，搖勻，無菌罩內(nèi)消化3-5分鐘(觀察：液體變粘稠， 細胞脫壁)。 b) 將各孔內(nèi)消化好的細胞裂解液吸到一 DEPC處理過的1.5 ml EP管中，加新開的氯仿 0. 2 ml，輕搖15秒。 c) 室溫靜置2-3分鐘后，12000 rpm，15 min，4°C，離心。然后取上清無色水相（約0.6 ml)到EP管（DEPC處理過)，加0. 5 ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。 d) 12000 rpm，10分鐘，4°C，離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清(小心別丟 了沉淀)，75%乙醇1.0 ml洗滌(用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4°C離心。5)、去 上清，點離，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘，DEPC處理水20-30 ul加入，中槍打 勻，55-60°C水浴10分鐘溶解總RNA，測0D值。 (2) 從總 RNA 中分離 mRNA (Oligotex mRNA Mini Kit, Cat. no. :70022, QIAGEN): a) 、取上述提取的總RNA若干(少于0.25 mg)到一個新的無RNase的EP管中，用無 RNase的水定容到250 ul。 b) 、加入 Buffer 0BB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用 Tip 打勻或用手彈 勻。3)、70°C水浴，3分鐘(裂解RNA的二級結(jié)構(gòu)）。 c) 、20-30°C條件下，靜置10分鐘(讓Oligotex與mRNA結(jié)合)。 d) 、高速離心2分鐘，小心吸走上清(該上清要保留），留下約50 yl的上清在原管里。
[0037] e)、用Buffer 0W2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀，然后將這些加到 套有1. 5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1分鐘。 f) 、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer 0W2 400 ill到柱子，高速離心1分 鐘，丟掉濾過液。 g) 、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100 ul熱的（70°C)Buffer 0EB到柱子 上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鐘。 h) 、為保證最大的mRNA產(chǎn)量，可再次重復(fù)第g步。
[0038] 分離提取mRNA后，使用RT-PCR進行半定量分析。對比不同細胞株的目的mRNA含 量，發(fā)現(xiàn)改造后的polyA可以增加目的蛋白mRNA的水平。
[0039] 實驗例2、不同長度PolyA細胞株的目的mRNA定量比較 使用Realtime PCR對目的基因進行半定量分析。選擇b-actin作為內(nèi)參基因，制定陽 性標準曲線。在使用合成的進行目的基因的PCR擴增，通過換算目的基因和內(nèi)參基因的模 板量之比，作為目的基因的mRNA在細胞中的表達水平的指標。
[0040] 結(jié)果顯示，PA9對于Fab的mRNA在細胞中的含量提高作用最為明顯。見圖4。
[0041] 實驗例3、Fab表達產(chǎn)量的比較研究 在搖瓶培養(yǎng)7天后，使用Capto-L純化柱純化Fab，純化后的Fab蛋白用通過SDS-PAGE 電泳和紫外分光光度計來分析純度和濃度。最后計算不同細胞的Fab產(chǎn)量用于比較不同 poly A尾對Fab表達的影響。
[0042] 結(jié)果顯示，PA9對于Fab的表達產(chǎn)量提高作用最為明顯。見圖5。
[0043] 實驗例4、抗體Fab的完整分子量分析 用pH :8. 0,濃度50mM NH4HC03溶解抗體樣品；檢測柱采用ACQUITY UPLC C-18柱， LC-MS質(zhì)譜進行分子量確認，結(jié)果圖如下，箭頭所指示區(qū)域為Fab蛋白，該蛋白分子量和理 論分子量一致：質(zhì)譜檢測結(jié)果見圖6。
[0044] 根據(jù)檢測結(jié)果顯示：本發(fā)明產(chǎn)品中未見糖基化修飾；本發(fā)明產(chǎn)品中未見脫氨基修 飾。
[0045] 實驗例5、親和力分析 本產(chǎn)品與Lucentis親和力相似
實驗例6、生物活性分析 (1) huvec細胞活性檢測 1)取對數(shù)生長期的huvec細胞，胰蛋白酶消化，計數(shù)，每次檢測（1塊96孔板）取約 2*106個細胞，離心棄上清，加入培養(yǎng)液B調(diào)整細胞密度至1. 5*10 5/ml，加入96孔培養(yǎng)板中， 0. lml/孔，培養(yǎng)過夜（18-24h)。注意不使用96孔板邊緣的孔，但在這些孔中加入無菌水(防 止多孔板的邊緣效應(yīng))。
[0046] 2)次日用12mL培養(yǎng)液C稀釋放線菌素D母液0. 48ml至終濃度為20 ii g/ml，取 2ml作為對照用（培養(yǎng)液D)，其余10ml加入2. 45 iilrh VEGF母液至濃度為4. 9ng/ml (培養(yǎng) 液E)。
[0047] 3)取Lucentis?，用培養(yǎng)液E逐步稀釋至1000ng/ml。
[0048] 4)將本發(fā)明產(chǎn)品（CMAB-818)用培養(yǎng)液E逐步稀釋至1000ng/ml。
[0049] 5)分別在10個1. 5ml無菌離心管中用培養(yǎng)液E連續(xù)倍比稀釋標準品或樣品的稀 釋液（即稀釋后所有管中含相同濃度的VEGF和放線菌素D，但VEGF單抗Fab的濃度不同）。 (計算時請注意：因為下一步加入含等體積培養(yǎng)液的孔中，所以實際的稀釋度是這時的稀 釋度的2倍）。
[0050] 6)將上步所有離心管內(nèi)的稀釋液徹底混勻，10, OOOrpm離心30秒將液體集中于管 底。
[0051] 7 )設(shè)定培養(yǎng)液D為陰性對照。
[0052] 8)接種了 huvec細胞的96孔板中，加入稀釋好的樣品或進口對照品0. lml/孔，或 者陰性對照用培養(yǎng)液。每個點設(shè)立2個復(fù)孔。置入5% C02,37°C孵箱培養(yǎng)。
[0053] 9) 96孔培養(yǎng)板在孵箱持續(xù)孵育14~16h，將新鮮配制的20:1混合的MTS/PMS溶液 加入孔內(nèi)（20 ill/孔)，再在孵箱中持續(xù)孵育1-4小時，用酶標儀測量其A490-A630值。
[0054] 10) Logistic回歸：橫坐標為標準品濃度，縱坐標為光吸收值的平均數(shù) (A490-A630)〇
[0055] 回歸方程：Y = (A-B)/[1 + (X/C)D] + B 根據(jù)該方程，C的數(shù)值即為半數(shù)有效濃度（ED50)。
[0056] 相對中和活性（%)=標準品 ED50 (ng/mL) / 待測品 ED50 (ng/mL) *100% (2) 競爭ELISA檢測 具體方法如下： 1) PBS將VEGF稀釋至0? 1 ii g/ml，加入酶標板，100 ill/孔。
[0057] 2)37°C，包被 2 小時。
[0058] 3)棄去孔中液體，并用PBST洗滌3次，每次在吸水紙上拍干。
[0059] 4) PBS將牛血清白蛋白稀釋至3%，加入酶標板，加滿孔。
[0060] 5)37°C，封閉 2 小時。
[0061] 6)棄去孔中液體，并用PBST洗滌3次，每次在吸水紙上拍干。
[0062] 7)PBS 將 HRP 標記的 rc VEGF mAb 稀釋至 0? 34ii g/ml，用 PBS 將 Lucentis 稀釋至 10 U g/ml，再將二者等體積混勻。
[0063] 8) PBS 將 HRP 標記的 rc VEGF mAb 稀釋至 0? 34 u g/ml，用 PBS 將 rc VEGF mAb 稀 釋至lOy g/ml，再將二者等體積混勻。
[0064] 9)PBS將HRP標記的rc VEGF mAb稀釋至0. 17 ii g/ml，并用該溶液分別2倍比序 列稀釋上兩步中的Lucentis及rc VEGF mAb液體將序列稀釋的Lucentis及rc VEGF mAb 加入酶標板，100 P 1/孔。另外以〇. 17 y g/ml的HRP標記的rc VEGF mAb作為最強顯色反 應(yīng)對照，PBS作為最弱顯色反應(yīng)對照。
[0065] 10)37°C，溫育 1 小時。
[0066] 11)棄去孔中液體，并用PBST洗滌3次，每次在吸水紙上拍干。
[0067] 12)將TMB顯色底物A及B等體積混合，加入酶標板，100 ill/孔。
[0068] 13)室溫避光反應(yīng)10分鐘。
[0069] 14)每孔加入50 ii 1濃度為0. 5M的硫酸終止反應(yīng)。
[0070] 15)酶標儀檢測0D450nm，630nm為參比波長。
[0071] 本產(chǎn)品與Lucentis體外生物活性相似。
【主權(quán)項】
1. 一種新型真核表達系統(tǒng)，其特征在于，所述真核表達載體含有不同長度的PolyA轉(zhuǎn) 錄終止序列。2. 權(quán)利要求1所述的一種新型真核表達系統(tǒng)，其中所述真核表達載體含有的PolyA轉(zhuǎn) 錄終止序列具有 5 ' GACGAATTCCAGAAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCCTCCCAAATCGGGGG GCCTTTTTTATTTTTTTCTT 3' 的序列。3. 權(quán)利要求1所述的一種新型真核表達載體，其中所述載體含有雙啟動子連接目標蛋 白質(zhì)的基因序列。4. 權(quán)利要求3所述的一種新型真核表達載體，其中所述蛋白質(zhì)選自完整抗體、抗體片 段、細胞因子和其他類似物。5. 權(quán)利要求3所述的一種新型真核表達載體，其中所述蛋白質(zhì)為抗體。6. 權(quán)利要求3所述的一種新型真核表達載體，其中所述蛋白質(zhì)為Ranitizumab。7. -種載體，含有權(quán)利要求1、2、3所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相連 的表達調(diào)控序列，其中載體可以為pDRl，pcDNA3. 1 ( + )，pcDNA3. 1/ZE0 ( + )，pDHFR之一。8. 權(quán)利要求1所述一種新型真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述宿主細胞為 真核哺乳動物細胞CH0。9. 一種新型真核表達系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： a) 設(shè)計合成新型轉(zhuǎn)錄終止序列； b) 設(shè)計合成雙啟動子連接的目標抗體輕鏈、重鏈基因序列； c) 將a)、b)所得基因序列連接，構(gòu)建新型重組質(zhì)粒； d) 利用步驟c)所得核苷酸片斷構(gòu)建的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選高表達克隆； e) 通過檢測目標蛋白質(zhì)mRNA表達水平及目標蛋白質(zhì)的表達量來篩選最佳表達系統(tǒng)。10. -種新型真核表達體統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，提高目標蛋白質(zhì)的表達量。11. 權(quán)利要求10所述，一種新型真核表達系統(tǒng)用于表達完整抗體或抗體片段或細胞因 子或其他類似物。
【文檔編號】C12N15/66GK105821077SQ201510008491
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月8日
【發(fā)明人】錢衛(wèi)珠
【申請人】上海張江生物技術(shù)有限公司