專利名稱：5’-鳥苷酸的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及5’ -鳥苷酸的生產(chǎn)方法以及在5’ -鳥苷酸的生產(chǎn)中使用的新微生物。 5’ -鳥苷酸作為調(diào)味料、醫(yī)藥以及調(diào)味料、醫(yī)藥的原料是有用的。
背景技術(shù)：
作為5’ -鳥苷酸(鳥苷-5’ - 一磷酸，以下也稱“GMP”)的工業(yè)制備方法，采用發(fā) 酵法生產(chǎn)鳥苷，再采用酶法將所得的鳥苷磷酸化，從而得到5’ -鳥苷酸的方法(專利文獻(xiàn) 1 4)。此外，還已知下述生產(chǎn)方法將增大了 GMP合成酶活性的屬于埃希氏菌屬的微生 物與下述產(chǎn)氨短桿菌在包含XMP和氨氣或谷氨酰胺的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，高效率地將XMP 轉(zhuǎn)化為GMP，并使培養(yǎng)液中生成并蓄積GMP，其中，所述產(chǎn)氨短桿菌的腺苷-三磷酸(ATP)生 物合成(以下也稱“ATP再生”)活性高，所述腺苷-三磷酸(ATP)是代謝葡萄糖來從5’-黃 苷酸(XMP)合成GMP的反應(yīng)所必需的(非專利文獻(xiàn)1)。另一方面，提出了利用發(fā)酵法來生產(chǎn)GMP的方法。例如，專利文獻(xiàn)5中公開了一種 GMP的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法中培養(yǎng)具有腺嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺陷性、顯示德夸菌素(decoyinine) 或甲硫氨酸亞砜抗性、且具有GMP生產(chǎn)能力的芽孢桿菌屬的突變株，并收集培養(yǎng)基中生成 蓄積的GMP。此外，專利文獻(xiàn)6公開了一種GMP的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法中培養(yǎng)使具有肌苷 酸(肌苷酸-5’-一磷酸，以下也稱“IMP”)生產(chǎn)能力的埃希氏菌屬細(xì)菌的2種5’-核苷酸 酶基因缺失、以及IMP脫氫酶和GMP合成酶基因增強(qiáng)而得到的菌株，并收集培養(yǎng)基中生成并 蓄積的GMP。但是，一般而言，GMP的直接發(fā)酵收率不充分，與前述酶法相比較未必實(shí)用。如前述，針對(duì)5'-鳥苷酸的生產(chǎn)進(jìn)行了各種研究，并已有數(shù)個(gè)成功的實(shí)例。但是， 對(duì)于核苷酸分解酶還有許多不明之處，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)種核苷酸分解酶，已知通過使它們?nèi)?失能夠提高收率(專利文獻(xiàn)6、7)，但完全抑制其分解是困難的，這是一個(gè)大問題?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1特開平07-231793號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2特開平10-201481號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3國(guó)際公開第96/37603號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)4特開2001-245676號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5特公昭56-12438號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6特開2002-355087號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7國(guó)際公開第2006/078132號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1 Tatsuro Fujio 等，Biosci. Biotech. Biochem.，1997 年，第 61 卷，5 號(hào)，840-845 頁

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的課題是創(chuàng)造新微生物，所述新微生物能夠在使用微生物從XMP生產(chǎn)GMP 的方法中使用、且能夠高效率地將XMP轉(zhuǎn)化為GMP。解決問題的方法本發(fā)明人等為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過利用經(jīng)過修飾從而 使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且經(jīng)過修飾從而增大了 GMP合成酶活性的埃希氏菌屬微 生物，能夠高效率地將XMP轉(zhuǎn)化為GMP，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的一類實(shí)施方式提供5’ -鳥苷酸的生產(chǎn)方法，該方法中使黃苷酸作用于經(jīng) 過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且還經(jīng)過修飾從而增大了 5’ -鳥苷酸合成 酶的活性的、具有將黃苷酸轉(zhuǎn)化為5’ -鳥苷酸的能力的微生物，來生成5’ -鳥苷酸，并收集 5’ -鳥苷酸。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述方法，其中，所述微生物經(jīng)過修飾從而使得nagD 基因無法正常發(fā)揮功能、而且還經(jīng)過修飾而增加了 guaA基因的表達(dá)，從而增大了 5’ -鳥苷 酸合成酶的活性。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述方法，其中，所述guaA基因編碼下述㈧或⑶ 的蛋白質(zhì)。(A)具有SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。(B)下述蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)具有在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列中包含1個(gè) 或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有5’ -鳥苷酸合成 酶活性。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述方法，其中，所述微生物還經(jīng)過修飾從而使得 ushA基因和aphA基因中的1種或1種以上的基因無法正常發(fā)揮功能。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述方法，其中，所述微生物是屬于腸桿菌科的細(xì)菌、 芽孢桿菌屬細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述方法，其中，所述微生物是埃希氏菌屬細(xì)菌。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述方法，其中，所述微生物是大腸桿菌。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、而 且還經(jīng)過修飾而增加了 guaA基因的表達(dá)從而增大了 5’-鳥苷酸合成酶的活性的、具有將黃 苷酸轉(zhuǎn)化為5’-鳥苷酸的能力的微生物(但是，不包括除了經(jīng)過了上述修飾以外，還經(jīng)過修 飾從而通過增加guaB基因的表達(dá)增大了肌苷酸脫氫酶活性的微生物)。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述微生物，該微生物還經(jīng)過修飾從而使得選自u(píng)shA 基因和aphA基因中的1種或1種以上的基因無法正常發(fā)揮功能。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是屬于腸桿菌科的細(xì) 菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是埃希氏菌屬細(xì)菌。本發(fā)明的其它實(shí)施方式提供前述微生物，其中，所述微生物是大腸桿菌。


圖1 (A)顯示使JM109/pSTV29-Ptac_guaA株與XMP反應(yīng)時(shí)的XMP和GMP的濃度 變化的圖表；(B)顯示使JM109 Δ nagD/pSTV29-Ptac-guaA株與XMP反應(yīng)時(shí)的XMP和GMP的 濃度變化的圖表。圖 2 (A)顯示使 JM 109 Δ ushA/pSTV29_Ptac-guaA 株與 XMP 反應(yīng)時(shí)的 XMP 和 GMP 的濃度變化的圖表；(B)顯示JM109 Δ ushA Δ nagD/pSTV29_Ptac-guaA株與XMP反應(yīng)時(shí)的 XMP和GMP的濃度變化的圖表。圖 3 (A)顯示使 JM 109 Δ ushA Δ aphA/pSTV29_Ptac-guaA 株與 XMP 反應(yīng)時(shí)的 XMP 和 GMP 的濃度變化的圖表；(B)顯示使 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD/pSTV29_Ptac-guaA 株與 XMP反應(yīng)時(shí)的XMP和GMP的濃度變化的圖表。發(fā)明的
具體實(shí)施例方式以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。<1>本發(fā)明的方法中使用的微生物本發(fā)明的方法中使用的微生物是經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能 且還經(jīng)過修飾從而增大了 GMP合成酶活性的、具有將XMP轉(zhuǎn)化為GMP的能力的微生物。作為微生物，可以列舉出屬于腸桿菌科的細(xì)菌、棒狀桿菌型細(xì)菌(Coryneform bacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌等。作為屬于腸桿菌科的細(xì)菌，可以列舉出埃希氏菌屬(Escherichia)細(xì)菌、泛菌屬 (Pantoea)細(xì)菌、腸桿菌屬(Enterobacter)細(xì)菌、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)細(xì)菌、沙雷氏 菌屬(Serratia)細(xì)菌、歐文氏菌屬(Erwinia)細(xì)菌、沙門氏菌屬(Salmonella)細(xì)菌、摩根 氏菌屬(Morganella)細(xì)菌等。對(duì)于埃希氏菌屬細(xì)菌沒有特殊限制，只要是大腸桿菌等屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌即 可，具體地可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt，F(xiàn)R. C. et al. ,Escherichia coli and Salmonella Typhimurium,American Society for Microbiology,Washington D. C. ,1208, 表1)中列舉的埃希氏菌屬細(xì)菌。此外，作為腸桿菌屬細(xì)菌，可以列舉出成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)、 產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)等；作為泛菌屬細(xì)菌，可以列舉出Pantoea ananatis 等。作為棒狀桿菌型細(xì)菌，可以列舉出按照微生物領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分 類方法分類為棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)菌；傳統(tǒng)上被分類為短桿菌屬，而現(xiàn)在被重新分類為棒 桿菌屬的細(xì)菌(Int. J. Syst. Bacteriol.，41，255 (1991))；以及屬于與棒桿菌屬親緣關(guān)系 非常近的短桿菌屬的細(xì)菌等。這樣的棒狀桿菌型細(xì)菌的例子可以列舉如下。嗜乙酰乙酸棒桿菌醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)@醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)美棒禾干胃(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒桿菌百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)
嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes)力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)二歧短桿菌(Brevibacterium divaricatum)黃色短桿菌Brevibacterium immariophilum乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)角軍糖短桿菌(Brevibacterium saccharoIyticum)^MM^ffM (Brevibacterium thiogenitalis)產(chǎn)氛棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)白色棒桿菌(Brevibacterium album)錯(cuò)狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)作為芽孢桿菌屬細(xì)菌，可以使用按照微生物領(lǐng)域的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分類方 法分類在芽孢桿菌屬的細(xì)菌，具體地，可以列舉出枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等，但不 限于此。對(duì)在諸如上述的微生物中增大GMP合成酶的活性的方法進(jìn)行說明。在本發(fā)明中，“經(jīng)過修飾從而增大了 GMP合成酶的活性”是指與埃希氏菌屬細(xì)菌 等微生物的非修飾株例如野生株相比，GMP合成酶的活性高。GMP合成酶是指催化下述反應(yīng)的酶(EC 6. 3. 4. 1)，"GMP合成酶的酶活性”是指催 化從XMP生成GMP的反應(yīng)的活性。 ATP+XMP+NH3 — AMP+ 焦磷酸 +GMPGMP 合成酶活性可以例如采用 Spector 的方法(Spector，T.，Methods Enzymo 1.， 1978，51，p219)，通過考察NADH的減少速度來測(cè)定。為了增大GMP合成酶的活性，優(yōu)選提高編碼該酶的guaA基因的表達(dá)量。作為提高表 達(dá)量的方法，可以列舉出提高編碼GMP合成酶的DNA在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)的方法。為了提 高細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)，只要將編碼GMP合成酶的DNA片段與能夠在埃希氏菌屬細(xì)菌等微生物中 發(fā)揮功能的載體連接來制作重組DNA、并將其導(dǎo)入宿主中來進(jìn)行轉(zhuǎn)化即可。轉(zhuǎn)化株細(xì)胞內(nèi)的 編碼GMP合成酶的基因(guaA基因)的拷貝數(shù)提高的結(jié)果是GMP合成酶的活性增大。細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)的提高可以通過使GMP合成酶基因在上述宿主的染色體DNA上以多 拷貝存在來實(shí)現(xiàn)。為了在屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的染色體DNA上以多拷貝導(dǎo)入GMP合成酶 基因，可以利用染色體上多拷貝存在的序列作為靶標(biāo)通過同源重組來進(jìn)行。作為染色體DNA 上多拷貝存在的序列，可以利用重復(fù)DNA或存在于轉(zhuǎn)移因子端部的反向重復(fù)序列等?；蛘撸?也可以如特開平2-109985號(hào)公報(bào)所公開的那樣，將目的基因搭載在轉(zhuǎn)座子上并使之轉(zhuǎn)移 來多拷貝導(dǎo)入到染色體DNA上。采用任何方法提高轉(zhuǎn)化株內(nèi)的GMP合成酶基因拷貝數(shù)的結(jié) 果均是GMP合成酶的活性增大。作為用于導(dǎo)入上述基因的載體，可以列舉出pSTV29、ρ麗218、pUC19等質(zhì)粒載體， λ 1059、XBF101、M13mp9等噬菌體載體。此外，作為轉(zhuǎn)座子，可以列舉出Mu、TnlO、Tn5。在編碼GMP合成酶的DNA方面，其堿基序列是公知的，因而可以基于該序列來合成引物，通過以埃希氏菌屬細(xì)菌等微生物的染色體DNA作為模板采用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增來獲取。 例如，作為大腸桿菌的guaA基因，可以列舉出具有SEQ ID NO :1的堿基序列的基因。該基 因也可以通過基于該堿基序列制備探針、從埃希氏菌屬細(xì)菌的染色體DNA文庫中通過雜交 選擇目的DNA片段來獲得?；蛘?，編碼GMP合成酶的DNA片段可以基于已知的堿基序列來 化學(xué)合成。而且，大腸桿菌的guaA基因可以使用SEQ ID NO 9和10的引物來進(jìn)行克隆。此外，從埃希氏菌屬細(xì)菌以外的微生物也可以基于上述堿基序列獲取編碼具有與 GMP合成酶等同的功能的蛋白質(zhì)的基因。作為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的GMP合成酶基因(guaA)，可以列舉出 具有SEQ ID NO :3的堿基序列的基因。該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO :4所 示。作為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的GMP合成酶基因(guaA)，可以列 舉出具有SEQ ID NO :5的堿基序列的基因。該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 6 所示。作為產(chǎn)氨棒桿菌(Corynebacterium ammoniagenes)的GMP合成酶基因(guaA),可 以列舉出具有SEQ ID NO :7的堿基序列的基因。該堿基序列編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。如上述，因微生物所屬的屬、種或菌株不同，guaA基因的堿基序列中有時(shí)會(huì)存在差 異，因此guaA基因可以是上述基因的變體。guaA基因編碼的蛋白質(zhì)只要具有GMP合成酶活性即可，可以是相對(duì)于SEQ ID NO :2、4、6或8的整個(gè)氨基酸序列具有80%以上、優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95%、特別優(yōu) 選98%以上的同一性的蛋白質(zhì)。氨基酸序列和堿基序列的同一性可以使用例如Karlin 和 Altschul 的算法 BLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA,90,5873 (1993))或 Pearson 的 FASTA (MethodsEnzymol.，183，63 (1990))來確定?；谠撍惴˙LAST，已經(jīng)開發(fā)出稱為 BLASTN 或 BLASTX 的程序(參照 http //www. ncbi. nlm. nih. gov)。此外，本發(fā)明中使用的guaA基因并非僅限于野生型基因，在不損害所編碼的蛋白 質(zhì)的功能即GMP合成酶活性的前提下，也可以是突變體或人工修飾體，所述突變體或人工 修飾體編碼具有在SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列中包含在1個(gè)或者多個(gè)位置上的1 個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列的蛋白質(zhì)。這里，所謂“數(shù)個(gè)”，雖然 因氨基酸殘基的種類或其在蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)中的位置而異，但具體地是指2 20個(gè)、更優(yōu) 選2 10個(gè)、更優(yōu)選2 5個(gè)。上述取代優(yōu)選為保守取代。作為保守突變，當(dāng)取代部位為 芳族氨基酸時(shí)，是指在Phe、Trp, Tyr之間相互取代的突變，當(dāng)取代部位為疏水性氨基酸時(shí)， 是指在Leu、lie、Val之間相互取代的突變，當(dāng)取代部位為極性氨基酸時(shí)，是指在Gin、Asn 之間相互取代的突變，當(dāng)取代部位為堿性氨基酸時(shí)，是指在Lys、Arg, His之間相互取代的 突變，當(dāng)取代部位為酸性氨基酸時(shí)，是指在Asp、Glu之間相互取代的突變，當(dāng)取代部位為帶 有羥基的氨基酸時(shí)，是指在Ser、Thr之間進(jìn)行相互取代的突變。作為保守取代，具體地可以 列舉出從Ala到Ser或Thr的取代，從Arg到Gln、His或Lys的取代，從Asn到Glu、Gln、 Lys、His或Asp的取代，從Asp到Asn、Glu或Gln的取代，從Cys到Ser或Ala的取代，從 Gln 到 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg 的取代，從 Glu 到 Gly、Asn、Gin、Lys 或 Asp 的取代， 從 Gly 到 Pro 的取代，從 His 到 Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 的取代，從 Ile 到 Leu、Met、Val 或 Phe 的取代，從 Leu 到 lie、Met、Val 或 Phe 的取代，從 Lys 到 Asn、Glu、Gin、His 或 Arg的取代，從Met到lie、Leu、Val或Phe的取代，從Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代， 從Ser到Thr或Ala的取代，從Thr到Ser或Ala的取代，從Trp到Phe或Tyr的取代，從 Tyr到His、Phe或Trp的取代，以及從Val到Met、Ile或Leu的取代。此外，如上所述的氨 基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等還包括因基于攜帶guaA基因的微生物的個(gè)體差異、 種間差異等情形而天然發(fā)生的突變(mutant或variant)而產(chǎn)生的那些取代、缺失、插入、添 加或倒位。此外，guaA基因也可以是下述DNA，所述DNA與SEQ ID NO :1、3、5或7的堿基序列 的互補(bǔ)堿基序列或能夠由該序列制備的探針在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有GMP合成酶活 性的蛋白質(zhì)。這里，“嚴(yán)格條件”是指形成所謂特異性雜交體而不形成非特異性雜交體的條 件。將該條件明確地?cái)?shù)值化是困難的，舉一實(shí)例，有這樣的條件在該條件下，具有高同一性 的DNA，例如具有80%以上，優(yōu)選90%以上，更優(yōu)選95%以上，特別優(yōu)選具有98%以上同一 性的DNA之間相互雜交，而同一性較之為低的DNA之間則不互相雜交；或者是這樣的條件 在與常規(guī) Southern 雜交的洗滌條件即 60°C，1 X SSC,0. 1 % SDS,優(yōu)選 0. 1 X SSC,0. 1 % SDS, 更優(yōu)選68°C，0. 1 X SSC、0. 1 % SDS相當(dāng)?shù)柠}濃度和溫度下，洗滌一次，更優(yōu)選兩次至三次的 條件。上述的關(guān)于基因的變體的描述對(duì)于后述的nagD基因、ushA基因、aphA基因以及其 它基因也同樣適用。將DNA 導(dǎo)入微生物可以通過 C. T. chung 的方法(C. T. chung et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，2172—2175 (1989))、D. Μ· Morrison 的方法(Methods in Enzymology, 68,326(1979))、或者用氯化鈣處理受體菌細(xì)胞來增加DNA的透過性的方法(Mandel，M. and Higa, Α.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))等來進(jìn)行。提高GMP合成酶基因的表達(dá)量，除了利用上述的基因擴(kuò)增以外，還可以通過將染 色體DNA上或質(zhì)粒上的GMP合成酶基因的啟動(dòng)子等表達(dá)調(diào)節(jié)序列更換成強(qiáng)力的啟動(dòng)子等表 達(dá)調(diào)節(jié)序列來實(shí)現(xiàn)。例如，Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等是已知的強(qiáng) 力啟動(dòng)子。此外，如國(guó)際公開W000/18935所披露的，也可以在基因的啟動(dòng)子區(qū)域?qū)霐?shù)個(gè) 堿基的堿基取代，將其修飾得更為強(qiáng)力。通過所述啟動(dòng)子取代或修飾，GMP合成酶基因的表 達(dá)得到強(qiáng)化，蛋白質(zhì)的活性增大。guaA基因的表達(dá)量的增大可以采用Northern法、RT-PCR法等來檢測(cè)。對(duì)在諸如上述的微生物中進(jìn)行修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能的方法進(jìn) 行說明。在本發(fā)明中，“進(jìn)行修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能”是指nagD基因所編 碼的蛋白質(zhì)的活性降低或消失，或者所述基因的轉(zhuǎn)錄降低或消失，或者所述基因的翻譯效 率降低。已知大腸桿菌(E.coli)的nagD基因存在于參與N-乙酰葡糖胺的同化的 nagBA⑶操縱子內(nèi)，且該nagBA⑶操縱子基因的表達(dá)可以通過在培養(yǎng)基中添加N-乙酰葡 糖胺(一種構(gòu)成細(xì)菌細(xì)胞壁的主成分的糖)來誘導(dǎo)(Plumbridge JA.，Mol. Micobiol. (1989)3. 505-515)。E. coli的nagD所編碼的NagD蛋白質(zhì)從保守結(jié)構(gòu)上的特征來看可知 其屬于鹵酸脫鹵酶(HAD)家族，有報(bào)告稱其在試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有針對(duì)GMP和5’ -尿苷酸 (尿苷-5，-一磷酸，以下也稱“UMP”)的核苷酸酶活性(Tremblay Lff.，Biochemistry,(2006)45. 1183-1193)。但是，E. coli的基因組上存在23種HAD家族蛋白質(zhì)，它們的底物 特異性范圍非常廣泛(Kuznetsova et al.，J. Biol. Chem.，(2006)281.，36149-36161)，因 此并不清楚NagD蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的生理作用。進(jìn)行修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能，可以采用諸如以下的方法來實(shí) 現(xiàn)。例如，可以通過采用利用基因重組法的同源重組法(Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory press (1972) ；Matsuyama,S. and Mizushima, S.，J. Bacteriol. ,162,1196(1985))將染色體上的nagD基因替換成無法正常發(fā)揮功能的 nagD基因(以下也稱為“破壞型nagD基因”)來進(jìn)行。在同源重組方面，如果將攜帶與染 色體上的序列具有同源性的序列的質(zhì)粒等導(dǎo)入菌體內(nèi)，則以某種頻率在具有同源性的序列 的位置上引發(fā)重組，導(dǎo)入的質(zhì)粒整體整合到染色體上。然后，如果再于染色體上的具有同源 性的序列的位置引發(fā)重組，則質(zhì)粒會(huì)再次脫落，此時(shí)有些情況下，通過引發(fā)重組的位置，被 破壞的基因在染色體上固定下來，而原來的正常基因與質(zhì)粒一起從染色體上脫落。通過選 擇這樣的菌株，可以獲得染色體上的正常nagD基因被破壞型nagD基因取代的菌株。這樣的利用同源重組的基因取代包括組合使用稱為“Red驅(qū)動(dòng)整合(Red-driven integration) ” 的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000，vol. 97，No. 12，p6640_6645)與 λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)(J. Bacteriol. 2002 Sep ； 184(18) =5200-3.)的方法(參照 W02005/010175號(hào))等使用線性DNA的方法，或者使用含溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97，No. 12，p6640_6645，美國(guó)專利第 6303383 號(hào)， 或特開平05-007491號(hào)公報(bào))。此外，基于諸如上述的利用了同源重組的基因取代的定點(diǎn)突變導(dǎo)入，也可以使用 在宿主中不具有復(fù)制能力的質(zhì)粒來進(jìn)行。此外，通過使用下述質(zhì)粒也可以進(jìn)行nagD基因的 破壞，所述質(zhì)粒包含內(nèi)部插入有藥物抗性等標(biāo)記基因的nagD基因，且不能在目的微生物內(nèi) 復(fù)制。即，用所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后獲得了藥物抗性的轉(zhuǎn)化體在染色體DNA中導(dǎo)入了標(biāo)記基因。該 標(biāo)記基因有很高的可能性是通過其兩端的nagD基因序列與染色體上的所述基因之間的同 源重組而導(dǎo)入的，因此能夠有效地選擇基因破壞株。用于基因破壞的破壞型nagD基因具體地可以這樣獲取利用限制酶消化和再連 接使nagD基因的一定區(qū)域缺失，或者在所述基因中插入其它DNA片段(標(biāo)記基因等)，或 者利用定點(diǎn)突變法(Kramer, W. and Frits,H. J. ,Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) 或利用次氯酸鈉、羥胺等化學(xué)藥物進(jìn)行處理(ShortIe，D. and Nathans, D.，Proc. , Natl., Acad.，Sci.，U. S. Α.，75，270 (1978))，來在nagD基因的編碼區(qū)域或啟動(dòng)子區(qū)域等的堿基序 列中引發(fā)1個(gè)或多個(gè)堿基取代、缺失、插入、添加或倒位，從而使所編碼的NagD蛋白質(zhì)的活 性降低或消失，或者使nagD基因的轉(zhuǎn)錄降低或消失。nagD基因的序列本身是公知的，基于這些序列，能夠容易地通過PCR法或雜交法 等獲得nagD基因。例如，作為大腸桿菌的nagD基因，可以列舉出編碼SEQ ID N0:12的氨 基酸序列的基因。nagD基因例如可以從大腸桿菌的染色體DNA通過使用SEQ ID N0:13和 14所示的引物進(jìn)行PCR來獲得。其它微生物的nagD基因也可以基于公知序列或與上述大腸桿菌的nagD基因之間 的序列同源性來獲取，并用于微生物的修飾。nagD基因只要與進(jìn)行修飾的微生物的染色體上的nagD基因之間具有能夠引發(fā)同源重組程度的同一性即可，例如編碼與SEQ ID NO :12的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選 80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同一性的氨基酸序列即可。目的基因被破壞的事實(shí)可以通過采用Southern印跡、PCR法對(duì)染色體上的基因進(jìn) 行解析來確認(rèn)。此外，對(duì)微生物進(jìn)行紫外線照射或者使用N-甲基-N’ -亞硝基胍(NTG)或亞硝酸 等常規(guī)突變處理中使用的突變劑進(jìn)行處理，也可以獲得不產(chǎn)生有活性的NagD蛋白質(zhì)的突 變株。本發(fā)明的方法所使用的細(xì)菌中，優(yōu)選還經(jīng)過修飾而使得UShA基因和/或aphA基 因無法正常發(fā)揮功能。所述基因的突變株或基因重組株可以通過進(jìn)行修飾而使得所述基因 編碼的5’ -核苷酸酶的活性降低或消失，或者使得所述基因的轉(zhuǎn)錄降低或消失來進(jìn)行。這 樣的突變株或基因重組株可以采用與前述的nagD基因無法正常發(fā)揮功能的突變株或基因 重組株相同的方法來獲得。 UShA基因的序列自身是公知的，可以容易地基于這些序列采用PCR法或雜交法等 獲得ushA基因。例如，作為大腸桿菌的ushA基因，可以列舉出編碼SEQ ID N0:16的氨基 酸序列的基因。其它微生物的ushA基因也可以基于公知序列或與上述大腸桿菌的ushA基 因之間的序列同源性來獲取，并用于修飾。而且，ushA基因只要與進(jìn)行修飾的微生物的染色體上的ushA基因之間具有能夠 引發(fā)同源重組程度的同一性即可，例如編碼與SEQ ID NO :16的氨基酸序列具有70%以上、 優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同一性的氨基酸序列即可。aphA基因的序列自身是公知的，可以容易地基于這些序列采用PCR法或雜交法等 獲得aphA基因。例如，作為大腸桿菌的aphA基因，可以列舉出編碼SEQ ID N0:18的氨基 酸序列的基因。其它微生物的aphA基因也可以基于公知序列或與上述大腸桿菌的aphA基 因之間的序列同源性來獲取，并用于修飾。aphA基因只要與進(jìn)行修飾的微生物的染色體上的aphA基因之間具有能夠引發(fā)同 源重組程度的同一性即可，例如編碼與SEQ ID NO :18的氨基酸序列具有70%以上、優(yōu)選 80%以上、更優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上的同一性的氨基酸序列即可。本發(fā)明提供經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、而且還經(jīng)過修飾而 增加了 gimA基因的表達(dá)從而增大了鳥苷酸合成酶的活性的、具有將黃苷酸轉(zhuǎn)化為5’-鳥苷 酸的能力的微生物(但是，除了經(jīng)過了上述修飾以外，還經(jīng)過修飾從而通過增加guaB基因 的表達(dá)增大了肌苷酸脫氫酶活性的微生物除外)，作為新的微生物。在該微生物中，優(yōu)選還 經(jīng)過修飾從而使得選自u(píng)shA基因、aphA基因中的1種或1種以上的基因無法正常發(fā)揮功 能。<II>GMP的生產(chǎn)方法使XMP與上述的經(jīng)過修飾從而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且經(jīng)過修飾而增 大了 GMP合成酶活性的微生物反應(yīng)，將XMP轉(zhuǎn)化為GMP，從而能夠得到GMP。作為進(jìn)行該微生物的培養(yǎng)時(shí)的碳源，只要是上述微生物能夠同化的碳源即可，可 以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、廢糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物，乙醇、甘油、山梨糖醇 等醇類，丙酮酸、乳酸、醋酸等有機(jī)酸，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作為 氮源，可以使用氨氣、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、碳酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機(jī)以及有機(jī)銨鹽，尿素、各種氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉 或其消化物等。作為無機(jī)物，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈉、硫 酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、碳酸鈣等。當(dāng)所使用的微生物的生長(zhǎng)繁育需要氨基酸、核酸、維生 素等特定營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中適量添加所述物質(zhì)。培養(yǎng)可以在pH5. 0 8. 5、15°C 45°C的適宜范圍內(nèi)在需氧條件下進(jìn)行5小時(shí) 72小時(shí)左右。而且，pH調(diào)整可以使用無機(jī)或有機(jī)的酸性或者堿性物質(zhì)，還可以使用氨氣等。直接將該微生物的培養(yǎng)液接種于含XMP的反應(yīng)液中，或者離心后僅將菌體接種于 含XMP的反應(yīng)液中，或者將菌體懸浮于適當(dāng)?shù)娜芤褐性俳臃N于含XMP的反應(yīng)液中，可以進(jìn)行 從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化。作為基質(zhì)的XMP的濃度只要是能夠獲得充分量的GMP的濃度即可， 對(duì)其沒有特殊限制，但優(yōu)選1 200mM的范圍。而且，在本發(fā)明的GMP的生產(chǎn)方法中，還可以使用上述微生物的菌體處理物。作為 菌體的處理物，可以列舉出例如將菌體用丙烯酰胺、角叉藻聚糖等固定化而得到的固定化 菌體等。作為反應(yīng)液的碳源，只要是上述微生物能夠同化的碳源即可，可以使用葡萄糖、果 糖、蔗糖、糖蜜、廢糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物，乙醇、甘油、山梨糖醇等醇類，丙酮酸、乳 酸、醋酸等有機(jī)酸，甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作為氮源，可以使用氨 氣、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、碳酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機(jī)以及有機(jī)銨鹽，尿素、各種 氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、魚粉或其消化物等。 作為無機(jī)物，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸一氫鉀、硫酸鎂、磷酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸 錳、硫酸鋅、碳酸鈣等。當(dāng)所使用的微生物的生長(zhǎng)繁育需要氨基酸、核酸、維生素等特定營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)時(shí)，可以在培養(yǎng)基中適量添加所述物質(zhì)。而且，反應(yīng)液中優(yōu)選加入有機(jī)溶劑來激活核苷酸的細(xì)胞透過性。作為核苷酸的膜透過性激活劑的有機(jī)溶劑優(yōu)選利用二甲苯、甲苯、苯、脂肪酸醇、 乙酸乙酯等，并通常優(yōu)選以0. 1 30ml/L的濃度使用。反應(yīng)可以在pH5. 0 8. 5、15°C 45°C的適宜范圍以需氧條件或厭氧條件進(jìn)行1 小時(shí) 7天左右。而且，pH調(diào)整可以使用無機(jī)或有機(jī)的酸性或堿性物質(zhì)，還可以使用氨氣等。而且，原料XMP可以使用化學(xué)合成品、市售品和通過發(fā)酵法生產(chǎn)的XMP等。從反應(yīng)液收集GMP，通常通過組合離子交換樹脂法、沉淀法、其它公知方法來實(shí)施。[實(shí)施例]以下，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說明。實(shí)施例1<1-1>JM109株來源nagD基因破壞株的構(gòu)建以作為常規(guī)DNA克隆用宿主使用的大腸桿菌JM109株作為親本株，首先進(jìn)行了 NagD蛋白質(zhì)非產(chǎn)生株的構(gòu)建。NagD蛋白質(zhì)由nagD基因(GenBank登錄號(hào)X14135SEQ ID NO: 11)編碼。nagD基因的缺失通過Datsenko和Warmer最先開發(fā)的稱為“ Red驅(qū)動(dòng)整合 (Red-driven integration)，，白勺 Tj 法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, P6640-6645)以及 λ 噬菌體來源的切出系統(tǒng)(J. Bacteriol. 2002S?。?84(18) :5200_3· Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisivenucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI，GardnerJF.)來進(jìn)行。根據(jù)"Red 驅(qū)動(dòng)整合，， 方法，使用將目的基因的一部分設(shè)計(jì)在合成寡核苷酸的5'側(cè)、將抗生素抗性基因的一部分 設(shè)計(jì)在3'側(cè)而得到的合成寡核苷酸作為引物來獲得PCR產(chǎn)物，使用該P(yáng)CR產(chǎn)物能夠一步式 地構(gòu)建基因破壞株。而且，通過組合使用λ噬菌體來源的切出系統(tǒng)，能夠?qū)⒄先牖蚱?壞株的抗生素抗性基因除去。作為PCR 的模板，使用 了質(zhì)粒 pMWl 18-attL-Cm-attR。pMWl 18-attL-Cm-attR (W020 06078039)是在pMW118(寶生物公司制造)中插入作為λ噬菌體附著位點(diǎn)的attL和attR 基因、以及作為抗生素抗性基因的cat基因而得到的質(zhì)粒，其中按attL-cat-attR的順序插 入。使用SEQ ID NO :19和20所示的合成寡核苷酸引物進(jìn)行了 PCR，其中，引物的3' 末端具有與attL和attR的兩端對(duì)應(yīng)的序列，引物的5'末端具有與作為目的基因的nagD 基因的一部分對(duì)應(yīng)的序列。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠進(jìn)行純化，通過電穿孔將其導(dǎo)入包含具有溫 度敏感型的復(fù)制能力的質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌JM109株中。質(zhì)粒pKD46(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)包含 λ 噬菌體的總計(jì) 2154 個(gè)堿基的 DNA 片段 (GenBank/EMBL登錄號(hào)J02459、第31088位 33241位)，該DNA片段中包含受阿拉伯糖誘 導(dǎo)型ParaB啟動(dòng)子調(diào)控的編碼λ Red同源重組系統(tǒng)的Red重組酶的基因(Y、β、exo基因)。 質(zhì)粒pKD46對(duì)于將PCR產(chǎn)物整合到JM109株的染色體上是必要的。電穿孔用感受態(tài)細(xì)胞如下述地制備。即，將在含100mg/L氨芐西林的LB培養(yǎng)基 中30°C培養(yǎng)過夜的大腸桿菌JM109株用含氨芐西林(20mg/L)和L-阿拉伯糖(ImM)的5mL 的 SOB 培養(yǎng)基(Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版，Sambrook, J 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989年))稀釋100倍。使所得稀釋物于30°C通氣條 件下生長(zhǎng)繁育至0D600約0. 6后，濃縮100倍，再用10%甘油洗滌3次，從而使得其能夠在 電穿孔中使用。電穿孔使用70 μ L的感受態(tài)細(xì)胞和約IOOng的PCR產(chǎn)物來進(jìn)行。在電穿孔 后的杯子中加入 ImL 的 SOC 培養(yǎng)基(Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版， Sambrook, J.等，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 年))，37°C培養(yǎng) 2. 5 小時(shí) 后，于37°C在包含Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，選擇出Cm抗性 重組體。然后，為了除去PKD46質(zhì)粒，在含Cm的L-瓊脂培養(yǎng)基上于42°C傳代2次，測(cè)試所 得菌落的氨芐西林抗性，獲得了 PKD46脫落的氨芐西林敏感型株。采用PCR確認(rèn)了通過氯霉素抗性基因甄別出的突變體的nagD基因的缺失。將所 得nagD缺損株命名為JM109AnagD: :att_cat株。然后，為了除去導(dǎo)入nagD基因內(nèi)的att-cat基因，使用了輔助質(zhì)粒即上述的 pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts攜帶編碼λ噬菌體的整合酶(Int)的基因、編碼切除酶 (Xis)的基因，是具有溫度敏感型的復(fù)制能力的質(zhì)粒。通過導(dǎo)入pMW-intxis-ts，識(shí)別染色 體上的attL或attR并引發(fā)重組，從而將attL與attR之間的基因切出，染色體上形成僅殘 留attL或attR序列的結(jié)構(gòu)。按照常規(guī)方法制作了上述所得的JM109AnagD::att-Cat株的感受態(tài)細(xì)胞，用輔 助質(zhì)粒pMW-intxis-ts進(jìn)行轉(zhuǎn)化，于30°C在含50mg/L氨芐西林的L-瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行平 板培養(yǎng)，選擇出氨芐西林抗性株。
然后，為了除去pMW-intxis-ts質(zhì)粒，在L-瓊脂培養(yǎng)基上于42°C傳代2次，測(cè)試所 得菌落的氨芐西林抗性以及氯霉素抗性，獲得了 att-cat和pMW-intxis-ts脫落的nagD破 壞株即氯霉素、氨芐西林敏感型株。將該株命名為JM109AnagD。 <1-2>GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29-PtaC-guaA的構(gòu)建以及將該質(zhì)粒導(dǎo)入 JM109 株和 JM109 Δ nagD 株如下地進(jìn)行了 GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29-Ptac_guaA的構(gòu)建。對(duì)于guaA 基因，使用SEQ ID NO :9和SEQ ID NO 10所示的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增了大腸桿菌的guaA 基因。純化擴(kuò)增片段后，將兩端形成的限制酶位點(diǎn)用EcoRI和PstI切割。將切割片段與 同樣用EcoRI和PstI切割的ρΚΚ223-3 (GenBank登錄號(hào)M77749)相連接，選擇出在緊隨 tac啟動(dòng)子之后的位置引入guaA基因而得到的質(zhì)粒pKK223-guaA。將所得質(zhì)粒用BamHI 和HindIII切割，使得切割片段包含tac啟動(dòng)子。將切割片段與同樣用BamHI和HindIII 切割的PSTV29相連接，選擇出在緊隨tac啟動(dòng)子之后的位置引入guaA基因而得到的質(zhì) 粒pSTV29-Ptac-guaA。將其導(dǎo)入JM109株和所述JM109AnagD株，分別得到了 JM109/ pSTV29-Ptac-guaA 株和 JM 109 Δ nagD/pSTV29_Ptac-guaA 株。<1-3> 利用 JM109/pSTV29-Ptac_guaA 株和 JM109 Δ nagD/pSTV29_Ptac-guaA 株菌 體進(jìn)行從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)對(duì)于上述菌株，實(shí)施了從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)評(píng)價(jià)。用于進(jìn)行從XMP到GMP的 轉(zhuǎn)化反應(yīng)評(píng)價(jià)的菌體制備方法、反應(yīng)方法、反應(yīng)溶液組成、分析方法如下所示。[菌體的制備方法]在LB 培養(yǎng)基平板上均勻涂布 JM109/pSTV29-Ptac_guaA 株和 JM109 Δ nagD/ pSTV29-PtaC-gUaA株，37°C培養(yǎng)過夜。第二天，將1/32平板量的菌體接菌在裝有LB培養(yǎng)基 120ml的500ml容量坂口燒瓶中，37°C培養(yǎng)過夜。將LB 600ml量的培養(yǎng)液經(jīng)離心后而得的 菌體用于60ml的反應(yīng)溶液。[反應(yīng)方法]用藥匙刮取前述的LB 600ml量的培養(yǎng)后菌體，將其接種于后述的反應(yīng)液60ml中， 開始反應(yīng)。反應(yīng)于42°C在添加氨水維持pH為7. 2的條件下實(shí)施。[反應(yīng)溶液組成]25mM XMP50g/L 葡萄糖9. 2g/L六偏磷酸鈉5g/L MgSO4 · 7H2010g/L KH2PO43ml/L 二甲苯[分析方法]隨時(shí)間取樣反應(yīng)液500μ 1，用KOH稀釋來終止反應(yīng)。將反應(yīng)終止液用濾器過濾，將 其中的10 μ 1用于HPLC分析。分析條件如下。柱AsahipakGS-220HQ (直徑 7. 6mm, 30cm)洗脫液0.2M NaH2PO4 (pH 3. 98)溫度55°C
流速0.6ml/分檢測(cè)紫外線(254nm)吸收結(jié)果如圖1所示。應(yīng)該認(rèn)為使用JM109/pSTV29-Ptac_guaA株會(huì)生成GMP，但實(shí)際 上分解活性高，完全沒有GMP蓄積(GMP < 0. 06g/L)。另一方面，顯示使用JM109 AnagD/ pSTV29-Ptac-guaA株進(jìn)行2小時(shí)反應(yīng)，反應(yīng)液中蓄積了最大約1. 7g/L的GMP。實(shí)施例2<2-l>JM109株和JM109 AnagD株來源的ushA基因破壞株的構(gòu)建以JM109株和實(shí)施例1<1_1>中所得的JM109 Δ nagD株作為親本株，進(jìn)行了 UshA 非產(chǎn)生株的構(gòu)建。UshA由ushA基因(GenBank登錄號(hào)X03895SEQ ID NO 14)編碼。按照前 述的nagD基因破壞方法，使用SEQ ID NO -.21,22的引物作為ushA破壞用引物進(jìn)行了 ushA 基因破壞。由此，得到了 JM109AushA 禾口 JM109AushAAnagD。<2-2>將GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29_Ptac_guaA導(dǎo)入JM109 Δ ushA株和JM 109 ΔushAΔnagD 株將實(shí)施例1所述的GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29-PtaC-guaA導(dǎo)入所述 JM109 Δ ushA 株和 JM109 Δ ushA Δ nagD 株，分別得到了 JM109 Δ ushA/pSTV29_Ptac-guaA 株 和 JM109 ΔushAΔnagD/pSTV29_Ptac-guaA 株。<2-3> 禾Ij 用 JM109 Δ ushA/pSTV29-Ptac-guaA 株禾口 JM109 Δ ushA Δ nagD/ pSTV29-Ptac-guaA株菌體進(jìn)行從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)對(duì)于上述菌株，實(shí)施了從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)按與實(shí)施例1<1_3>相 同的方式進(jìn)行。結(jié)果如圖2所示。顯示使用JM109AushA/pSTV29-Ptac_guaA株在反應(yīng)的第2小 時(shí)反應(yīng)液中蓄積了最大約 9. 7g/L 的 GMP ；使用 JM109 AushAAnagD/pSTV29-Ptac-guaA 株 在反應(yīng)的第2小時(shí)反應(yīng)液中蓄積了了最大約10. 3g/L的GMP。實(shí)施例3<3-l>JM109 Δ ushA株和JM109 Δ ushA Δ nagD株來源的aphA基因破壞株的構(gòu)建以JM109 Δ ushA株和實(shí)施例2<2_1>中所得的JM109 Δ ushA Δ nagD株作為親本株， 進(jìn)行了 AphA非產(chǎn)生株的構(gòu)建。AphA由aphA基因(GenBank登錄號(hào)X86971SEQ ID NO 17) 編碼。按照前述的nagD基因破壞方法，使用SEQ ID NO :23、24的引物作為aphA破壞用引 物，進(jìn)行了 aphA基因破壞。由此，得到了 JM109 Δ ushA Δ aphA和 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD。<3-2> 將 GMP 合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒 pSTV29_Ptac-guaA 導(dǎo)入 JM109 Δ ushA Δ aphA 株 禾口 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD 株將實(shí)施例1所述的GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29-PtaC-guaA導(dǎo)入所述 JM109 Δ ushA Δ aphA 株禾口 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD 株，分另Ij得至Ij 了 JM109 Δ ushA Δ aphA/ pSTV29-Ptac-guaA 株和 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD/pSTV29_Ptac-guaA 株。<3-3> 禾Ij 用 JM109 Δ ushA Δ aphA/pSTV29-Ptac_guaA 株禾口 JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD/pSTV29_Ptac-guaA 株菌體進(jìn)行從 XMP 到 GMP 的轉(zhuǎn)化反應(yīng)對(duì)于上述菌株，實(shí)施了從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)按與實(shí)施例1<1_3>相 同的方式進(jìn)行。但，反應(yīng)液中的XMP濃度為50mM。結(jié)果如圖3 所示。顯示使用 JM109AushAAaphA/pSTV29-Ptac-guaA 株在反應(yīng)的第5小時(shí)反應(yīng)液中蓄積了最大約23. 3g/L的GMP ；使用JM109 Δ ushA Δ aphA Δ nagD/ pSTV29-Ptac-guaA株在反應(yīng)的第4小時(shí)反應(yīng)液中蓄積了最大約26. 9g/L的GMP。實(shí)施例4<4-l>JM109株和JM109 AnagD株來源的aphA基因破壞株的構(gòu)建以JM109株和實(shí)施例1<1_1>所得的JM109AnagD株作為親本株，進(jìn)行了 AphA非 產(chǎn)生株的構(gòu)建。使用SEQ ID NO :23、24的引物作為aphA破壞用引物，像實(shí)施例3那樣地進(jìn) 行了 aphA 基因破壞。由此，得到了 JM109 Δ aphA 和 JM 109 Δ aphA Δ nagD。<4-2>將GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29_Ptac-guaA導(dǎo)入JM109 Δ aphA株和 JM109AaphAAnagD 株將實(shí)施例1所述的GMP合成酶表達(dá)強(qiáng)化質(zhì)粒pSTV29-PtaC-guaA導(dǎo)入所述 JM109 Δ aphA 株和 JM109 Δ aphA Δ nagD 株，分別得到了 JM109 Δ aphA/pSTV29_Ptac-guaA 株 和 JM 109 ΔaphAΔnagD/pSTV29-Ptac-guaA 株。通過像實(shí)施例1 3那樣，對(duì)這些菌株進(jìn)行從XMP到GMP的轉(zhuǎn)化反應(yīng)評(píng)價(jià)，能夠確 認(rèn)NagD非生產(chǎn)性株中GMP蓄積量的增加。工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，能夠高效率地生產(chǎn)作為調(diào)味料、醫(yī)藥及其原料而有用的GMP?！残蛄斜碚f明〕SEQ ID NO 1大腸桿菌GMP合成酶(GMPS)基因(guaA)堿基序列SEQ ID NO 2大腸桿菌GMPS氨基酸序列SEQ ID NO 3枯草芽孢桿菌GMPS基因(guaA)堿基序列SEQ ID NO 4枯草芽孢桿菌GMPS氨基酸序列SEQ ID NO 5谷氨酸棒桿菌GMPS基因(guaA)堿基序列SEQ ID NO 6谷氨酸棒桿菌GMPS氨基酸序列SEQ ID NO 7產(chǎn)氨棒桿菌GMPS基因(guaA)堿基序列SEQ ID NO 8產(chǎn)氨棒桿菌GMPS氨基酸序列SEQ ID NO 9大腸桿菌guaA基因克隆用引物序列SEQ ID NO 10大腸桿菌guaA基因克隆用引物序列SEQ ID NO 11大腸桿菌nagD基因堿基序列SEQ ID NO 12大腸桿菌NagD氨基酸序列SEQ ID NO :13大腸桿菌nagD基因克隆用引物序列SEQ ID NO :14大腸桿菌nagD基因克隆用引物序列SEQ ID NO 15大腸桿菌ushA基因堿基序列SEQ ID NO 16大腸桿菌UshA氨基酸序列SEQ ID NO 17大腸桿菌aphA基因堿基序列SEQ ID NO 18大腸桿菌AphA氨基酸序列SEQ ID NO 19 大腸桿菌nagD基因破壞用引物序列SEQ ID NO 20 大腸桿菌nagD基因破壞用引物序列SEQ ID NO 21 大腸桿菌ushA基因破壞用引物序列SEQ ID NO 22 大腸桿菌ushA基因破壞用引物序列
SEQ ID NO 23 大腸桿菌aphA基因破壞用引物序列SEQ ID NO 24 大腸桿菌aphA基因破壞用引物序列
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，該方法中使黃苷酸作用于下述微生物來生成5’-鳥苷 酸，并收集5’ -鳥苷酸，所述微生物具有將黃苷酸轉(zhuǎn)化為5’ -鳥苷酸的能力，且經(jīng)過修飾從 而使得nagD基因不能正常地發(fā)揮功能，而且還經(jīng)過修飾從而增大了 5’-鳥苷酸合成酶的活 性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，其中，所述微生物經(jīng)過修飾而增加 了 gimA基因的表達(dá)，從而增大了 5’ -鳥苷酸合成酶的活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，其中，所述guaA基因編碼下述㈧ 或(B)的蛋白質(zhì)(A)具有SEQID NO 2所述的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(B)具有在SEQID NO 2所述的氨基酸序列中包含1個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的取代、缺 失、插入、添加或倒位的氨基酸序列，且具有5’ -鳥苷酸合成酶活性的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，其中，所述微生物還經(jīng)過修飾從而使得選自u(píng)shA基因和aphA基因中的1種以上的基因不能 正常發(fā)揮功能。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，其中，所述微生物是屬于腸桿菌科的細(xì)菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌。
6.權(quán)利要求5所述的生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，其中，所述微生物是埃希氏菌屬細(xì)菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)5’-鳥苷酸的方法，其中，所述微生物是大腸桿菌。
8.—種微生物，所述微生物具有將黃苷酸轉(zhuǎn)化為5’ -鳥苷酸的能力，且經(jīng)過修飾而增 加了 guaA基因的表達(dá)，從而增大了 5’ -鳥苷酸合成酶的活性，而且還經(jīng)過修飾從而使得 nagD基因不能正常發(fā)揮功能；但上述微生物中不包括除了經(jīng)過上述修飾以外，還經(jīng)過修飾 而增加了 guaB基因的表達(dá)，從而增大了肌苷酸脫氫酶活性的微生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微生物，所述微生物還經(jīng)過修飾從而使得選自u(píng)shA基因和 aphA基因中的1種以上的基因不能正常發(fā)揮功能。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的微生物，其中，該微生物是屬于腸桿菌科的細(xì)菌、芽孢桿 菌屬細(xì)菌或棒狀桿菌型細(xì)菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的微生物，其中，該微生物是埃希氏菌屬細(xì)菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微生物，其中，該微生物是大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及5’-鳥苷酸的生產(chǎn)方法。使用微生物高效率地生產(chǎn)5’-鳥苷酸(GMP)。使XMP與經(jīng)過修飾而使得nagD基因無法正常發(fā)揮功能、且經(jīng)過修飾而增大了GMP合成酶的活性的細(xì)菌反應(yīng)來得到GMP。
文檔編號(hào)C12R1/01GK101993904SQ20101025054
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日
發(fā)明者橋口賢一, 淺原貴之, 深田寬朗 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社