專利名稱：傳染性脾腎壞死病毒的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳染性脾腎壞死病毒的檢測方法，尤其是涉及傳染性脾腎壞死病毒的 超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測方法。
背景技術(shù)：
i^MiWW^^i'MM (Infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV) 屬虹彩病毒科細(xì)胞腫大病毒屬成員，是細(xì)胞質(zhì)型DNA病毒，為養(yǎng)殖魚類重要的病毒性病原 之一，能引起全身性、系統(tǒng)性地感染，對(duì)感病魚的脾臟、腎臟等造血器官和組織的破壞造成 嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致病魚貧血、多器官衰竭而死亡，其寄主范圍包括石斑魚、花鱸、真鯛、大菱鲆、 鱖魚、牙鲆、條石鯛、大黃魚等重要的養(yǎng)殖魚類及藍(lán)眼燈和麗麗魚等重要的觀賞魚類。分子 生物學(xué)研究表明，世界各地鑒定的魚類，特別是海水養(yǎng)殖魚類虹彩病毒，基本上都是ISKNV， 近年來，由ISKNV引起的魚類疾病已呈明顯上升趨勢，患病魚的死亡率從30% (成魚階段) 到100% (幼苗階段)不等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了魚類養(yǎng)殖業(yè)的 健康發(fā)展，在國內(nèi)外受到愈來愈大的關(guān)注。因此，快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測ISKNV的新技術(shù)， 對(duì)控制早期病毒感染、切斷病毒傳播，保障我國魚類水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展有重要意 義。目前ISKNV的檢測方法主要采用PCR檢測體系，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)ISKNV的 簡便、快速、敏感、特異性檢測。如授權(quán)公告號(hào)為CN11864359C，公告日為2005年1月26日， 發(fā)明名稱為鱖魚傳染性脾腎壞死病毒基因診斷試劑盒及檢測方法，就公開了設(shè)計(jì)有兩對(duì)引 物的PCR反應(yīng)液對(duì)樣品模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測。但是這些檢測往往需要特定的設(shè)備、實(shí) 驗(yàn)室及分子生物學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作，這只能在實(shí)驗(yàn)室條件下才可以檢測，限制了 PCR檢 測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用。上世紀(jì)90年代中期，F(xiàn)ire和Xu在實(shí)驗(yàn)室的人工體系中，成功模擬了存在于自然界 中許多質(zhì)粒與病毒以環(huán)狀DNA為模板進(jìn)行的滾環(huán)擴(kuò)增(Rolling cycle amplificatiRCA)。 滾環(huán)擴(kuò)增是一種在恒溫條件下，利用DNA聚合酶和單鏈環(huán)狀DNA模板，將與環(huán)狀模板雜 交的引物以線性方式連續(xù)不斷延伸的DNA擴(kuò)增方式。1998年，Lizardi等人在滾環(huán)擴(kuò)增 法的基礎(chǔ)上增加了一個(gè)引物，發(fā)明了超分支滾環(huán)擴(kuò)增法(hyperbranchedrolling circle amplification, HRCA)，也有文獻(xiàn)中稱之為級(jí)聯(lián)滾環(huán)擴(kuò)增(cascade rolIingcircle amplification,CRCA)或分支擴(kuò)增(ramification amplification，RAM)。超分支滾環(huán)擴(kuò)增 法有兩種引物存在，其中一種引物與環(huán)狀模板上一段序列互補(bǔ)，第二種引物與環(huán)狀模板的 另一段序列相同時(shí)，可引起自發(fā)、連續(xù)的雙向多重分支狀鏈取代反應(yīng)，該技術(shù)能在短時(shí)間內(nèi) (Ih)進(jìn)行大量擴(kuò)增，擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到IO7 (Thomas et al. 1999)，靈敏度極高，能夠檢測到單分 子水平(Zhang et al. 2001)。HRCA技術(shù)安全、快捷、高效、高靈敏度且無設(shè)備及技術(shù)限制， 具有其他技術(shù)所無法替代的優(yōu)勢，另外，只要保證探針兩端的特異性序列與靶序列互補(bǔ)，探 針與靶序列的雜交結(jié)合時(shí)可以不考慮靶序列的性質(zhì)(RNA或者DNA)，因此檢測RNA鏈時(shí)不再 需要預(yù)先進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
3
目前，HRCA技術(shù)已應(yīng)用于動(dòng)植物基因及其病原檢測等方面，但在水產(chǎn)動(dòng)物病原檢 測方面未見報(bào)道，本發(fā)明第一次將HRCA技術(shù)應(yīng)用于ISKNV的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種應(yīng)用超分支滾環(huán)擴(kuò)增法檢測傳染性脾腎 壞死病毒的方法，克服PCR檢測技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備及操作技術(shù)要求高等問題，以實(shí)現(xiàn)對(duì)傳染 性脾腎壞死病毒進(jìn)行快速、安全、特異、靈敏、簡便的現(xiàn)場檢測。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為包括以下三部分1、設(shè)計(jì)1條鎖式 探針和1對(duì)針對(duì)鎖式探針連接序列的通用引物；2、配制鎖式探針連接反應(yīng)體系，進(jìn)行連接 反應(yīng)；3、配制HRCA反應(yīng)體系，進(jìn)行HRCA擴(kuò)增反應(yīng)，最后對(duì)HRCA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。具體包括如下步驟(1)鎖式探針的合成從ISKNV-DP0L基因序列中分別選取20個(gè)堿基作為鎖式探 針5'端和3'端的特異識(shí)別區(qū)，5'末端堿基和3'末端堿基在ISKNV-DP0L基因序列上連 續(xù)，從質(zhì)粒載體pNAKl中選取3779-3692nt段的基因序列，將該基因序列中與5'末端堿基 和3'末端堿基互補(bǔ)的堿基替換后形成的核苷酸序列作為鎖式探針的連接段部分，然后進(jìn) 行鎖式探針的合成，再對(duì)合成的鎖式探針進(jìn)行5’端磷酸化，所述的鎖式探針的核苷酸序列 如下5' -GAGTCGAGCT TGTGATCCAT tggactgctg aatccgttag ccagcagccg cctcgacgaatttctgccat tcatcccctt attatcactt attcaggcgt agcaccag CCACATAGTCCAGGCTGTAC-3‘ ；128(2)根據(jù)鎖式探針的連接段序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物CFl :5’ -CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3，， 24CF2 :5， -GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3， ；21(3)配制連接反應(yīng)體系連接反應(yīng)體系的終濃度為鎖式探針I(yè)pM-I μ M， 10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1，樣品模板2 μ 1，加雙蒸水至反應(yīng)總體積10 μ L ；(4)鎖式探針的連接反應(yīng)將上述連接反應(yīng)體系在94-100°C下變性3-5min后，冰 浴 3-5min，再加 IU/μ 1 Τ4 DNA Ligase，在 37°C條件下，反應(yīng) 10_60min ；(5)配制HRCA反應(yīng)體系反應(yīng)體系各組分終濃度分別為dNTPs 0. 4mM、CFl 0· 4 μ Μ、CF2 0· 4 μ Μ、ρΗ 8. 8 的 Tris-HCl2OmM, KCl IOmM, MgSO4 6. 5mM、(NH4)2SO4 10mM、 0. 1% Triton χ-100和8U Bst DNA聚合酶大片段，連接產(chǎn)物2 μ 1，加雙蒸水至反應(yīng)體系總 體積為25 μ 1 ；(6)HRCA反應(yīng)體系擴(kuò)增將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為 61-65°C，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為10-60min ；(7) HRCA反應(yīng)產(chǎn)物的檢測將HRCA擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增條 帶，呈階梯狀分布則表示該樣品的ISKNV的檢測結(jié)果為陽性，反之無擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶 為非階梯狀分布，則為陰性。步驟(1)中所述的5'端特異識(shí)別區(qū)和3'端特異識(shí)別區(qū)的解鏈溫度一致。步驟(6)中所述的最適反應(yīng)溫度為61°C，最適反應(yīng)時(shí)間為40min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于
4
1、靈敏度極高，能夠檢測到單分子水平，其檢測靈敏度比常規(guī)PCR高10倍以上。2、特異性強(qiáng)，所用的鎖式探針兩端的特異識(shí)別區(qū)根據(jù)ISKNV-DP0L基因中的保守 區(qū)域設(shè)計(jì)，與DPOL基因上的靶序列特異性互補(bǔ)，當(dāng)有錯(cuò)配存在時(shí)，探針的連接反應(yīng)就無法 完成，因此確保了檢測中的高特異性。3、檢測時(shí)間短，Ih左右擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)IO7以上，足以滿足觀察所需，比常規(guī)PCR檢 測節(jié)省2-4h。4、儀器設(shè)備要求低，不需PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只需一個(gè)水浴 鍋即可完成檢測，設(shè)備價(jià)格較低，節(jié)約了生產(chǎn)成本。5、操作簡單、便捷，整個(gè)檢測過程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，稍具分子生物學(xué)基礎(chǔ)的 人員即可完成操作。綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有技術(shù)的PCR檢測ISKNV的方法具有更高的特異、靈敏 度和便捷性，并且可以在于實(shí)際生產(chǎn)中現(xiàn)場應(yīng)用檢測，有利于控制魚類養(yǎng)殖中傳染性脾腎 壞死病毒的傳染和交叉。


圖1為ISKNV-DP0L基因的HRCA鎖式探針和通用引物設(shè)計(jì)示意圖；通用引物中CFl 與鎖式探針的一段序列互補(bǔ)，CF2則與鎖式探針的一段序列相同用框架表示；圖2為鎖式探針的連接反應(yīng)和HRCA反應(yīng)的原理圖；圖3為不同濃度的鎖式探針對(duì)HRCA反應(yīng)的影響圖；M :100bp DNA Ladder ；鎖式探 針濃度為 1 :10μΜ ；2 =IOOnM ；3 =InM ；4 =IOpM ；5 =OpM ；樣品模板濃度均為 IO9Copies/μ 1 ； HRCA反應(yīng)時(shí)間為Ih ；圖4為鎖式探針的連接時(shí)間對(duì)HRCA反應(yīng)的影響圖；M =IOObp DNA Ladder ；連接 反應(yīng)時(shí)間分別為1 IOmin ；2 :20min ；3 :30min ；4 :40min ；5 :60min ；樣品模板濃度均為 IO9Copies/μ 1 ；HRCA 反應(yīng)時(shí)間為 Ih ；圖5為HRCA反應(yīng)時(shí)間對(duì)擴(kuò)增的影響圖；M :100bp DNA Ladder ；HRCA反應(yīng)時(shí)間分別 為1 :10min ；2 :20min ；3 :30min ；4 :40min ；5 :50min ；6 :60min ；連接反應(yīng)中樣品模板濃度 為IO9Copies/μ 1，鎖式探針為1 μ Μ，連接反應(yīng)時(shí)間為30min ；圖6為HRCA法檢測ISKNV靈敏度的電泳圖；M IOObp DNA Ladder ；樣品模板濃度 (copies/μ 1)分別為1 105 ；2 104 ；3 103 ；4 102 ；5 =IO1 ；6 10° ；7 0 ；圖7為HRCA法的特異性試驗(yàn)電泳圖；M :100bp DNA Ladder ；樣品模板分別為1 傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney virus, ISKNV) ；2 對(duì)下白班綜合癥 病毒(white spot syndrome virus, WSSV) ；3 淋巴囊月中病病毒(Lymphocyst i sdisease virus, LCDV) ；4(spring viremia of carp virus, SVCV) ；5 -.^cM 水作為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于 此。實(shí)施例1
5
1、制備ISKNV基因組的DNA樣品模板及ISKNV-DP0L基因測序驗(yàn)證1. 1材料與方法L1.1 材料患病將死大黃魚、花鱸采自浙江省象山港海灣水產(chǎn)苗種繁育中心，大腸桿菌菌株 TGl 由本室保存，pMD19-T Vector、rTaq DNA 聚合酶、T4 DNA Ligase 購自 TaKaRa 公司， QIAquick Gel Extraction 試劑盒購自 QIAGEN 公司，plasmid Mini kit 購自 OMEGA 公司， BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit 購自 BIPoFlux 公司。1· 1· 2 方法1. 1. 2. 1制備ISKNV基因組的DNA樣品模板取待檢魚的脾臟組織0. 5g，采用 BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit (BIPoFlux公司)進(jìn)行組織DNA的提取純化，制備成用于HRCA反應(yīng)的DNA樣品模板。1. 1. 2. 2 ISKNV-DP0L 基因的測序驗(yàn)證根據(jù)GenBank中傳染性脾腎壞死病毒基因組序列(登錄號(hào)AF371960)設(shè)計(jì)DPOL 基因全長的PCR特異擴(kuò)增引物I SKNV-DP0L(+) 5，-ATGGATAGTGTGTACATCTATC-3，，I SKNV-DP0L(-) :5， -TCATACGGCAGGCGTCGT G-3，，上述PCR擴(kuò)增引物由上海生工生物工程有限公司合成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)為25μ 1 體系，包含 IOmM Tris-HCL (ρΗ 8. 3), 50mM KCL, 1. 5mM MgCL2,0. 8mM dNTPs，0. 2 μ M 引物 ISKNV-DP0L (+)，0. 2 μ M 引物 ISKNV-DP0L (-)，ISKNV 基因組的 DNA 樣品模板 l.OyL, 5U/ μ L r Taq DNA聚合酶；反應(yīng)經(jīng)94°C預(yù)變性2min后，循環(huán)擴(kuò)增30次94°C變性30s，58°C復(fù)性 30s，72°C反應(yīng)1. 5min，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸反應(yīng)IOmin ；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)(w/v)瓊脂糖凝膠 電泳分離后，預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶用QIAquick GelExtraction純化，然后克隆至pMD19_T 載體；DPOL基因序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。ISKNV-DP0L基因序列的測定 結(jié)果符合登錄號(hào)為FN4299812、超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)檢測ISKNV的方法的建立2. 1材料與方法2. 1.1 材料Bst DNA聚合酶大片段(含10X緩沖液)購自New England Biolabs公司，dNTPs、 T4DNA Ligase (含 10 X 緩沖液)購自 TaKaRa 公司，IOObp DNA Ladder 購自 Fermentas 公 司。2. 1. 2 方法2. 1. 2. 1鎖式探針和通用引物的設(shè)計(jì)從ISKNV-DP0L基因序列(登錄號(hào)為FN429981)中分別選取20個(gè)堿基作為鎖式 探針5'端和3'端的特異識(shí)別區(qū)，5'末端堿基和3'末端堿基在ISKNV-DP0L基因序列上 連續(xù)，再從質(zhì)粒載體pNAKl中選取3779-3692nt段的基因序列，將該基因序列中與5'末端 堿基和3'末端堿基互補(bǔ)的堿基替換后形成的核苷酸序列作為鎖式探針的連接段部分，然 后進(jìn)行鎖式探針的合成，再對(duì)合成的鎖式探針進(jìn)行5’端磷酸化，所述的鎖式探針的核苷酸 序列如下5' -GAGTCGAGCT TGTGATCCAT tggactgctg aatccgttag ccagcagccg
6cctcgacgaatttctgccat tcatcccctt attatcactt attcaggcgt agcaccag CCACATAGTCCAGGCTGTAC-3‘ ；128根據(jù)鎖式探針的連接段序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物CF1 5 ’ -CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA-3，， 24CF2 :5， -GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG-3‘ ；21圖1為ISKNV-DP0L基因的HRCA鎖式探針和通用引物設(shè)計(jì)示意圖；通用引物中CFl 與鎖式探針的一段序列互補(bǔ)，CF2則與鎖式探針的一段序列相同用框架表示。圖2鎖式探針的連接反應(yīng)和HRCA反應(yīng)的原理圖，具體原理如下鎖式探針的兩端與靶序列特異性互補(bǔ)，當(dāng)無錯(cuò)配存在時(shí)，鎖式探針在連接酶的作 用下連接成環(huán)。成環(huán)后的鎖式探針在一個(gè)與鎖式探針連接段部分序列互補(bǔ)的引物CFl和具 有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，對(duì)環(huán)型探針進(jìn)行擴(kuò)增。該過程起始于引 物CFl和環(huán)形模板單鏈的雜交，接著引物CFl在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下延 伸，當(dāng)延伸反應(yīng)沿著環(huán)形模板進(jìn)行一周后，新形成的3'端一邊置換先前合成的序列，一邊 繼續(xù)延伸，形成一條具有大量重復(fù)序列且與環(huán)狀模板鏈完全互補(bǔ)的線狀單鏈。DNA的延伸可 以一直進(jìn)行下去，因此產(chǎn)生的DNA鏈?zhǔn)怯H代DNA單位長度的許多倍，與此同時(shí)，序列同鎖式 探針中部分序列相同的引物CF2結(jié)合于線狀單鏈的互補(bǔ)區(qū)域，并由引物CF2起始延伸。隨 著引物CFl起始合成的線狀單鏈的不斷延伸，與引物CF2互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)不斷暴露出來， CF2與新暴露出來的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，開始新的酶促延伸，并置換掉下游由CF2起始延伸的核 苷酸鏈。被上游引物CF2起始延伸所置換掉的延伸產(chǎn)物呈單鏈狀態(tài)，一旦其與引物CFl互 補(bǔ)的區(qū)域暴露出來，引物CFl將與之結(jié)合，并以之為模板進(jìn)行擴(kuò)增。2. 1. 2. 2鎖式探針連接條件的優(yōu)化首先要配制最佳的連接體系，連接反應(yīng)體系如下鎖式探針1 μ 1，10XT4 DNA LigaseBuffer 1 μ 1，DNA樣品模板2 μ 1，加雙蒸水至反應(yīng)總體積10 μ 1。確定鎖式探針的最優(yōu)用量對(duì)于保證反應(yīng)的正常進(jìn)行、降低本底信號(hào)以及節(jié)約成 本至關(guān)重要，應(yīng)用本發(fā)明提供的鎖式探針和連接反應(yīng)體系，取4個(gè)不同的鎖式探針濃度 (10 μ M、100nM、InMUOpM)進(jìn)行連接反應(yīng)以確定鎖式探針的最優(yōu)用量，反應(yīng)條件為94°C變 性3-5min后，冰浴3-5min，加lU/μ 1 T4 DNA Ligase，在37°C下連接反應(yīng)60min，反應(yīng)結(jié)束 后以2. 1. 2. 3中所述體系進(jìn)行HRCA反應(yīng)(不同濃度的鎖式探針對(duì)HRCA反應(yīng)的影響圖如圖 3所示)。為確定最優(yōu)連接時(shí)間，應(yīng)用確定的最優(yōu)鎖式探針濃度，在94°C 5min變性以后，冰 浴3-5min后，37°C下，連接反應(yīng)時(shí)間分別為10min、20min、30min、40min、60min 5個(gè)時(shí)段，反 應(yīng)結(jié)束后以2. 1. 2. 3中所述體系進(jìn)行HRCA反應(yīng)(鎖式探針連接時(shí)間對(duì)HRCA反應(yīng)的影響圖 如圖4所示)。2. 1. 2. 3 HRCA 條件的優(yōu)化本發(fā)明中最佳反應(yīng)體系的終濃度分別為dNTPs 0. 4mM、CFl 0. 4μ M、CF2 0. 4 μ Μ、 Tris-HCl(pH 8. 8)20mM、KCl IOmM^MgSO4 6. 5mM、(NH4)2SO4 10mM、0. 1% Tritonx-100 和 8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，連接產(chǎn)物2 μ 1，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體 積為25 μ 1。在HRCA反應(yīng)的過程中，反應(yīng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)物的量和反應(yīng)的特異性都有很大的影響，按 照本發(fā)明中最佳反應(yīng)體系配置反應(yīng)液，反應(yīng)時(shí)間為10min、20min、30min、40min、60min 5個(gè)
7不同時(shí)段(HRCA反應(yīng)時(shí)間對(duì)擴(kuò)增的影響圖如圖5所示)。實(shí)施例2 本發(fā)明ISKNV超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測技術(shù)的靈敏度測定1、將獲得的ISKNV基因組DNA模板原始濃度(109COpieS/μ 1) 10倍梯度稀釋，分 別作為樣品模板。2、使用實(shí)施例1中得出的優(yōu)化條件法對(duì)各濃度的模板進(jìn)行檢測從而得出本發(fā)明 的靈敏度(如圖6)。2. 1鎖式探針的連接連接反應(yīng)體系如下鎖式探針0. 1 μ M，IOXΤ4 DNA Ligase Buffer Ιμ ，樣品模 板2μ 1，加雙蒸水至反應(yīng)總體積10μ 1，94-100°C下變性3_5min后，冰浴3_5min，再加IU/ μ 1 Τ4 DNA Ligase，在 37°C條件下，反應(yīng) 30min。2. 2 HRCA 反應(yīng)反應(yīng)體系的終濃度分別為dNTPs0. 4mM、CFl 0. 4 μ Μ、CF2 0. 4 μ Μ、 Tris-HCl (ρΗ8· 8) 20mM、KCl 1 OmM、MgSO4 6· 5mM、(NH4)2SO4 10mM,0. 1% Triton χ-100 和 8UBst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，連接產(chǎn)物2 μ 1，加雙蒸水使反應(yīng)體系總 體積為25 μ 1。反應(yīng)條件為61°C，40min。ISKNV基因組DNA模板10倍梯度稀釋試驗(yàn)表明，HRCA法所能檢測的最低樣品模板 濃度為10° copies/μ (如圖6所示)。實(shí)施例3 本發(fā)明基于HRCA檢測ISKNV方法的特異性測定提取傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney virus)、對(duì)蝦白斑 綜合癥病毒(white spot syndrome virus)、淋巴囊月中病病毒(Lymphocystis disease virus)禾口趣魚春季病毒血癥病毒(spring viremia of carp virus),艮4種不同相關(guān)度病 毒的基因組DNA作為模板，用于本發(fā)明的特異性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其中雙蒸水作為陰性對(duì)照。其中 DNA提取方法和HRCA反應(yīng)體系和條件見前。擴(kuò)增產(chǎn)物分別通過瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果 顯示見圖7，說明本發(fā)明提供的ISKNV-HRCA檢測方法能保證對(duì)ISKNV的特異性檢測，并不與 其他相關(guān)病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。實(shí)施例4:用本發(fā)明HRCA法具體檢測魚體內(nèi)的ISKNV于浙江省象山港海灣水產(chǎn)苗種繁育中心收集大黃魚樣品15份，花鱸樣品15份，根 據(jù)以下步驟進(jìn)行ISKNV的檢測。1、制備待檢樣品的DNA樣品模板取待檢魚的脾臟組織0. 5g，采用 BIPospin Tissue Genomic DNA Extraction Kit (BIPoFlux公司)進(jìn)行組織DNA的提取純化，制備成用于HRCA反應(yīng)的DNA樣品模板。2、鎖式探針連接反應(yīng)取上述制備的DNA樣品模板2μ 1，加入如下反應(yīng)體系中鎖式探針0. ΙμΜ， 10XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，加雙蒸水至反應(yīng)總體積10 μ 1，94 °C變性5min，冰浴 3-5min后加T4 DNA Ligase IU/μ 1，37°C下連接反應(yīng)30min。連接反應(yīng)產(chǎn)物待用。3、HRCA反應(yīng)體系的配制及反應(yīng)
取上述連接反應(yīng)液2μ 1，加入如下反應(yīng)體系中dNTPs 0. 4mM, CFl 0. 4 μ Μ, CF2 0. 4 μ Μ, Tris-HCl (ρΗ8. 8) 20mM, KCl IOmM, MgSO4 6. 5mM, (NH4)2SO4 10mM,0. 1 % Tritonx-100,8U Bst DNA聚合酶大片段(New England Biolabs)，加雙蒸水使反應(yīng)體系總 體積為25 μ 1。其中DPOL-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽性對(duì)照模板，雙蒸水作為陰性對(duì)照模板，6rC 條件下反應(yīng)40min。4、判斷HRCA檢測結(jié)果擴(kuò)增結(jié)束后，取10 μ IHRCA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察擴(kuò)增條帶，如 果擴(kuò)增條帶呈階梯狀分布，則表示該樣品的ISKNV的檢測結(jié)果為陽性，反之無擴(kuò)增條帶或 擴(kuò)增條帶為非階梯狀分布，則為陰性。同時(shí)，上述檢測結(jié)果與PCR檢測的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，經(jīng)ISKNV的PCR檢測 方法確定為陽性的樣品，HRCA法均能檢測到ISKNV的存在。HRCA擴(kuò)增結(jié)果還可采用熒光染料顯色法目視觀測。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng) 小管混合液的外觀變化，向各反應(yīng)小管中加入lyL(l 10)的SYBR Green I熒光染料。 SYBRGreen I染料與雙鏈DNA結(jié)合會(huì)發(fā)綠色熒光，所以，在自然光下肉眼觀察，如果染料顏 色由開始的橙色變?yōu)榫G色，則說明檢測結(jié)果陽性，否則為陰性。
9
權(quán)利要求
傳染性脾腎壞死病毒的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測方法，其特征在于包括以下步驟(1)鎖式探針的合成從ISKNV DPOL基因序列中分別選取20個(gè)堿基作為鎖式探針5′端和3′端的特異識(shí)別區(qū)，5′末端堿基和3′末端堿基在ISKNV DPOL基因序列上連續(xù)，從質(zhì)粒載體pNAK1中選取3779 3692nt段的基因序列，將該基因序列中與5′末端堿基和3′末端堿基互補(bǔ)的堿基替換后形成的核苷酸序列作為鎖式探針的連接段部分，然后進(jìn)行鎖式探針的合成，再對(duì)合成的鎖式探針進(jìn)行5’端磷酸化，所述的鎖式探針的核苷酸序列如下5’ GAGTCGAGCT TGTGATCCAT tggactgctg aatccgttag ccagcagccg cctcgacgaatttctgccat tcatcccctt attatcactt attcaggcgt agcaccag CCACATAGTCCAGGCTGTAC 3’；128(2)根據(jù)鎖式探針的連接段序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物CF15’ CTGGTGCTACGCCTGAATAAGTGA 3’，24CF25’ GCTGAATCCGTTAGCCAGCAG 3’； 21(3)配制連接反應(yīng)體系連接反應(yīng)體系的終濃度分別為鎖式探針1pM 1μM，10×T4 DNA Ligase Buffer 1μl，樣品模板2μl，加雙蒸水至反應(yīng)總體積10μL；(4)鎖式探針的連接反應(yīng)將上述連接反應(yīng)體系在94 100℃下變性3 5min后，冰浴3 5min，再加1U/μl T4 DNA Ligase，在37℃條件下，反應(yīng)10 60min；(5)配制HRCA反應(yīng)體系反應(yīng)體系各組分終濃度分別為dNTPs 0.4mM、CF10.4μM、CF2 0.4μM、pH 8.8的Tris HCl 20mM、KCl 10mM、MgSO4 6.5mM、(NH4)2SO4 10mM、0.1％Triton x 100和8U Bst DNA聚合酶大片段，連接產(chǎn)物2μl，加雙蒸水至反應(yīng)體系總體積為25μl；(6)HRCA反應(yīng)體系擴(kuò)增將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為61 65℃，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為10 60min；(7)HRCA反應(yīng)產(chǎn)物的檢測將HRCA擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增條帶，呈階梯狀分布則表示該樣品的ISKNV的檢測結(jié)果為陽性，反之無擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增條帶為非階梯狀分布，則為陰性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性脾腎壞死病毒的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測方法，其特征在 于步驟(1)中所述的5'端特異識(shí)別區(qū)和3'端特異識(shí)別區(qū)的解鏈溫度一致。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的傳染性脾腎壞死病毒的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測方法，其特征在 于步驟(6)中所述的最適反應(yīng)溫度為61°C，最適反應(yīng)時(shí)間為40min。
全文摘要
本發(fā)明公開了傳染性脾腎壞死病毒的超分支滾環(huán)擴(kuò)增檢測方法，特點(diǎn)是包括以下步驟(1)設(shè)計(jì)1條鎖式探針和1對(duì)針對(duì)鎖式探針連接序列的通用引物；(2)配制鎖式探針連接反應(yīng)體系，進(jìn)行連接反應(yīng)；(3)配制HRCA反應(yīng)體系，進(jìn)行HRCA擴(kuò)增反應(yīng)，最后對(duì)HRCA反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測，優(yōu)點(diǎn)是具有比現(xiàn)有技術(shù)的PCR檢測傳染性脾腎壞死病毒的方法具有更高的靈敏度、特異性和便捷性，并且可以在實(shí)際生產(chǎn)中現(xiàn)場應(yīng)用，有利于檢測和控制水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中傳染性脾腎壞死病毒的傳染和交叉。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101906488SQ201010251439
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者史雨紅, 孔誠將, 李明云, 李登峰, 陸新江, 陳炯 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)