專(zhuān)利名稱(chēng)：一種檢測(cè)黃牛angptl4基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測(cè)，特別涉及一 種檢測(cè)黃牛ANGPTL4(類(lèi)血管生長(zhǎng)因子4)基因單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個(gè)體間基因組序列的差異，這些 差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失 以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美國(guó)麻省理工學(xué) 院的人類(lèi)基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類(lèi)遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組 DNA序列中由于單個(gè)核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。它的變異形式有顛換、轉(zhuǎn) 換、插入和缺失等，主要由單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs 約占2/3。根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類(lèi)基因編碼區(qū)單核苷 酸多態(tài)性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(Perigenic SNPs, pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs，iSNPs)。研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少，由于它在遺傳性疾病研究中卻具有重要 意義，因此，編碼區(qū)內(nèi)的cSNP的研究更受關(guān)注?；蚓幋a區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種一 種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP (Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會(huì)影響其 所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP (Non-Synonymous cSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改 變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection,MAS), 該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對(duì)遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對(duì)畜禽的綜合性狀進(jìn)行品種 改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。在肉牛育 種中，人們期望，通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的選擇， 達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過(guò)對(duì)遺傳 標(biāo)記的選擇來(lái)間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，使之能夠同時(shí)利用標(biāo)記位點(diǎn)信 息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計(jì)動(dòng)物個(gè)體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。 標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個(gè)階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋 白質(zhì)(酶)標(biāo)記對(duì)數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個(gè)階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記 技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個(gè)基因組的標(biāo)記成為可能，通過(guò)與QTL間的連鎖分析，實(shí)現(xiàn) 分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)作為 新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。ANGPTL4(類(lèi)血管生長(zhǎng)因子4)屬于類(lèi)血管生成素基因家族成員之一，也稱(chēng)禁食誘導(dǎo)的脂肪因子，它是過(guò)氧化物增殖體激活受體PPARy的靶基因。而PPARY主要參與脂肪 形成，促進(jìn)脂肪的分化和調(diào)控特殊脂肪細(xì)胞基因的表達(dá)。ANGPTL4基因可以抑制脂蛋白脂肪 酶的活性，正調(diào)控血漿甘油三酯水平，促進(jìn)脂肪動(dòng)員，抑制脂肪貯存。ANGPTL4能促進(jìn)血管 生成，并對(duì)脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)具有重要作用。同時(shí)，ANGPTL4在動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病、肝 癌、代謝綜合征等的發(fā)生和發(fā)展中有重要作用。因此，研究哺乳動(dòng)物ANGPTL4基因遺傳變異 和分子遺傳特征具有重要理論和實(shí)踐意義。目前，對(duì)于ANGPTL4基因的研究多在小鼠和人類(lèi)上，主要在肝癌，脂蛋白脂酶抑制 方面做了大量研究。國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于黃牛ANGPTL4基因遺傳變異的研究。中國(guó)黃牛ANGPTL4 基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如初 生重、日增重、體重等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種檢測(cè)的黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性 的方法，尋找與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含ANGPTL4基因的待測(cè) 黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛ANGPTL4基因；用限制性?xún)?nèi)切 酶Mspl消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚 丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛ANGPTL4基因第1422位的單核苷酸多態(tài)性；上游弓|物:tgcgaatcca gaatctac 18 ；下游弓丨物:agcaaaaggt tggacact 18。所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C 預(yù)變性 5min ；30 35 個(gè)循環(huán) 94°C 變性 30s，58 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s ； 72°C延伸 lOmin。所述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為質(zhì)量濃度10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。所述根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛ANGPTL4基因第1422位的單核苷酸 多態(tài)性為T(mén)T基因型表現(xiàn)為292bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為292bp、179bp和113bp條帶；CC 基因型表現(xiàn)為1179bp和113bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明對(duì)黃牛ANGPTL4基因第1422位點(diǎn)上的錯(cuò)義突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā) 生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)?shù)?422位點(diǎn)由T突變?yōu)镃時(shí)，三聯(lián)密碼CTG改變?yōu)?CCG，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程相應(yīng)位置的蛋白質(zhì)編碼氨基酸發(fā)生改變(由Leu突變?yōu)镻ro)，使具有重要 生理功能的ANGPTL4基因所編碼蛋白的空間二、三級(jí)構(gòu)型發(fā)生變化，以至影響蛋白的生物 學(xué)功能。本發(fā)明提供的黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法，針對(duì)第1422位點(diǎn)由 T突變?yōu)镃突變的檢測(cè)，通過(guò)內(nèi)切酶Mspl的識(shí)別來(lái)判斷是否發(fā)生了突變，再通過(guò)電泳檢測(cè) 分型可以準(zhǔn)確、快速、方便的檢測(cè)ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性TT基因型表現(xiàn)為292bp條 帶；TC基因型表現(xiàn)為292bp、179bp和113bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為179bp和113bp條帶；進(jìn)而對(duì)3個(gè)黃牛群體的SREBPlc基因SNP的等位基因和基因型頻率的變化監(jiān)控。由于ANGPTL4基因功能涉及初生重、體重、日增重、體高、體重、體斜長(zhǎng)、坐骨端寬 等生長(zhǎng)性狀，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為ANGPTL4基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了 基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃 牛種群。


圖1為黃牛ANGPTL4基因PCR產(chǎn)物電泳圖2為黃牛ANGPTL4基因包含第1422位的多態(tài)位點(diǎn)的279bp PCR產(chǎn)物的Mspl酶 切電泳結(jié)果；圖3為黃牛ANGPTL4基因SNP的不同基因型測(cè)序圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用對(duì)黃牛ANGPTL4基因第1422位點(diǎn)錯(cuò)義突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā) 生變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇，快 速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。下面結(jié)合具體樣本的檢測(cè)和性狀關(guān)聯(lián)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步 的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛ANGPTL4基因含第三外顯子區(qū)域PCR引物的設(shè)計(jì)以NCBI所公布的牛(NC 007305)序列為參考，利用Primer 5. 0設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增包 含黃牛ANGPTL4基因第九外顯子區(qū)域的PCR引物，其引物序列如下上游弓|物 PI :tgcgaatcca gaatctac 18;下游弓丨物 R1 :agcaaaaggt tggacact 18;以上述引物對(duì)黃?；蚪M擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含黃牛ANGPTL4基因(NC_007305序 列)第三外顯子區(qū)域第1243bp 1535bp的292bp的基因片段，擴(kuò)增后片段的電泳檢測(cè)如 圖1所示，泳道M為Marker ；對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序鑒定后，其中，第1243bp 1303bp的 序列(5’ > 3’)如下所示atggatcacc tggcccccag gcac |ctg| ggc cacgagatgg ccaagcccgc caggaggaa ；當(dāng)?shù)?422bp(S卩ANGPTL4基因CDS區(qū)第476位)的T突變?yōu)镃時(shí)，密碼子由CTG (如 框線所示序列)突變?yōu)镃CG，從而形成錯(cuò)義密碼子突變，即由Leu突變?yōu)镻ro。當(dāng)?shù)?422bp由T突變?yōu)镃時(shí)，PCR擴(kuò)增ANGPTL4基因產(chǎn)物的第1419bp 1423bp 序列為ccgg，形成了限制性?xún)?nèi)切酶Mspl的酶切位點(diǎn)，當(dāng)在1422位點(diǎn)沒(méi)有突變時(shí)，PCR擴(kuò)增 ANGPTL4基因產(chǎn)物的第1419bp 1423bp序列為ctgg，限制性?xún)?nèi)切酶Mspl不能識(shí)別；這樣 就可以對(duì)該位點(diǎn)SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)。b、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測(cè)黃牛的ANGPTL4基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以3個(gè)中國(guó)地方黃牛品種的種群作為檢測(cè)對(duì)象，具體采集樣本見(jiàn)表1 河南平頂山市郟縣紅牛(414)，河南南陽(yáng)牛(215)，陜西秦川牛(230)；表1黃牛樣本的采集品種樣品數(shù)樣品名稱(chēng)樣品來(lái)源采樣方式郟縣紅牛 (JX cattle)414血樣采自河南省平頂山市郟縣紅牛育種中 心及各村鎮(zhèn)靜脈采血 16號(hào)針頭南陽(yáng)牛 (NY cattle)215血樣采自河南省南陽(yáng)市黃牛良種繁育場(chǎng)(國(guó) 家級(jí)黃牛保種場(chǎng))靜脈采血 16號(hào)針頭秦川牛 (QC cattle)230血樣采自陜西省秦川牛場(chǎng)、陜西省秦川牛良 種繁育中心和陜西省大荔縣靜脈采血 16號(hào)針頭2、血樣基因組DNA的分離、提取、純化1)冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 iiL至1.5mL Eppendorf離心 管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心lOmin (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟
至上清液透明、沉淀呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 u L，搖動(dòng)，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁， 37°C 水浴 lh ；3)加蛋白酶K至3iiL(20mg/mL)并混勻，55°C過(guò)夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加 1 P L蛋白酶K混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 y L，溫和搖動(dòng)離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次；5)加氯仿500 u L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24 1) 500 u L，充分混勻20min, 4°C，12000r/min離心 lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中；7)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管， 直至白色的絮狀沉淀析出，-20°C保存30 60min ；8) 4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9) 4°C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；10)干燥后的DNA溶于80 100 y L的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0. 8%瓊 脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，-80°C保存。 ll)500uL的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0.1%，加入蛋白酶K至終濃 度達(dá)到50 u g/mL ；12) 5 °C 保溫 1 Oh 左右；13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)和氯仿分別抽提一次；14) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無(wú)水乙醇沉淀DNA ；16)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 ii L滅菌超純水溶解，4°C待檢測(cè)。3、PCR 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個(gè)反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和 1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個(gè)數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個(gè)1. 5mL離心管中，充分混勻后瞬時(shí)離心，再分裝到每個(gè)0. 2mLEppendorfPCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時(shí)離 心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2:表2PCR反應(yīng)體系 25iiL反應(yīng)體系包括0.625U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)， 2 X Buffer 12. 5 y L (內(nèi)含Mg2+、dNTPs等)(北京天根科技有限公司Mix)，50ng/ y L含 ANGPTL4基因的黃?；蚪MDNA 0. 45 u L，lOpmol/ u L上、下游引物各0. 5 u L ；PCR反應(yīng)程序94°C 預(yù)變性 5min;
94°C變性 30 s，
58°C退火30 s, 夂30 35個(gè)循環(huán)； 72°C 延伸 30 s,)72°C延伸 lOmin ；對(duì)3個(gè)黃牛品種的859個(gè)樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得859個(gè)個(gè)體的黃 牛ANGPTL4基因中包含該SNP位點(diǎn)的292bp的DNA片段。c、Mspl酶切消化PCR擴(kuò)增的ANGPTL4基因片段l、MspI酶切反應(yīng)消化體系(25 30 ii L) :10 15 ii LPCR產(chǎn)物，10 X緩沖液(含 BSA)2.5 3.0iiL，MspI(10U/iiL)為 1. 0 1.5yL，滅菌純水(H20)11.5 16. 5 u L ；2、酶切消化條件37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5 10h。d、Mspl消化PCR產(chǎn)物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析1)將PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行10%的聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)檢測(cè)，點(diǎn)樣后200V電壓電 泳50min，電泳結(jié)束后EB染色；
2)用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)成像照相分析，并人工判型；ANGPTL4基因的第1422bp由T突變?yōu)镃時(shí)，PCR擴(kuò)增的ANGPTL4基因產(chǎn)物的第 1243bp 1535bp序列為ccgg，限制性?xún)?nèi)切酶Mspl識(shí)別后在c/cgg對(duì)擴(kuò)增片段酶切，將擴(kuò)增 片段切為2段；而ANGPTL4基因的第1422bp沒(méi)有發(fā)生突變，限制性?xún)?nèi)切酶Mspl不能識(shí)別；具體凝膠成像結(jié)果如如圖2所示，圖中TT基因型個(gè)體(292bp)，CC基因型個(gè)體 (179bp 和 113bp), TC 基因型個(gè)體(292bp、179bp 和 113bp)M 為 Marker I (600bp, 500bp, 400bp,300bp,200bp,lOObp)。3)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物的測(cè)序驗(yàn)證利用ABI 377和ABI 3730測(cè)序儀對(duì)不同基因型個(gè)體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向 測(cè)序；同時(shí)，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié)果表明包含179bp和113bp條帶的雜合子TC基因型個(gè)體 其1422位的測(cè)序圖的確表示為T(mén)或C，如圖3a所示，而CC基因型、TT基因型分別為C、T， 如圖3b、c所示。e、黃牛ANGPTL4基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計(jì)分析1)基因和基因型頻率基因型頻率是指一個(gè)群體中某一性狀的某種基因型個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的比率。PAA =NAA/N，其中PAA代表某一位點(diǎn)的AA基因型頻率；Nm表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)； N為檢測(cè)群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個(gè)群體中某一基因數(shù)對(duì)其等位基因總數(shù)的相對(duì)比率。計(jì)算的公式
可以寫(xiě)成PA = (2NM+NAal+NAa2+NAa3+NAa4+......+NAan)/2N式中，PA表示等位基因A頻率，^表示群體中具有AA基因型的個(gè)體數(shù)量，NAai表 示群體中具有Aai基因型個(gè)體數(shù)量，al-an為等位基因A的n個(gè)互不相同的復(fù)等位基因。本研究所涉及的等位基因?yàn)門(mén)和C，所以具體的基因頻率計(jì)算公式為Pc = (2Ncc+Ntc) /2NPT = (2Ntt+Ntc) /2N式中，PT，Pc分別表示等位基因T和C等位基因的頻率，NTT、NTe和Nee分別表示TT、 TC和CC基因型的個(gè)體數(shù)量，N表示總?cè)后w數(shù)目。在不同黃牛品種ANGPTL4基因SNP中的T等位基因頻率變化幅度在88. 5 % 93%, C等位基因頻率變化幅度在7.0% 11. 5%之間，符合動(dòng)物分子標(biāo)記育種中SNP大 5% 10%的要求，具備群體遺傳多樣性特征，可作為標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行育種。表3黃牛ANGPTL4基因第1422位SNP基因頻率分布表
黃牛品種基因型的觀測(cè)數(shù)目總計(jì)等位基因頻率TTTCCC940TC秦川牛1983202300.9300.070南陽(yáng)牛1734022150.8980.102郟縣紅牛3248554140.8850.115
f、黃牛PRDM16基因SNP位點(diǎn)基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)MspI識(shí)別的基因型(TT和TC，且CC基因型個(gè)體太少不作統(tǒng)計(jì))生產(chǎn)數(shù)據(jù)南陽(yáng)牛體尺數(shù)據(jù)。關(guān)聯(lián)分析模型先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對(duì)數(shù)據(jù)校正； 根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應(yīng)用SAS(9. 1)軟件的GLM過(guò)程分析基因型和瓶中對(duì)各性狀效應(yīng)。在對(duì)基因 型效應(yīng)進(jìn)行分析時(shí)采用了固定模型YiJkl = li +BFi+MonthJ+Gk+eiJkl其中Tukl為性狀觀察值，P為總體均值，BF,為第i個(gè)品種和農(nóng)場(chǎng)的固定效， Monthj為第j個(gè)月觀測(cè)的固定效應(yīng)，Gk為第k個(gè)單SNP標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)，eiJkl為隨機(jī) 誤差。結(jié)果表明(見(jiàn)表4)在Mspl位點(diǎn)，在12月齡和24月齡TT基因型的個(gè)體體重，胸 圍，體斜長(zhǎng)等生產(chǎn)性狀均高于TC基因型個(gè)體且差異顯著(P<0.05)；而在出生重和6、18月 齡倆種基因型的個(gè)體在體重，胸圍，體斜長(zhǎng)等生產(chǎn)性狀上差異不顯著(P > 0. 05)。說(shuō)明TT 基因型可以做為一個(gè)提高黃牛體重和日增重的候選分子遺傳標(biāo)記。表4ANGPTL4基因Mspl多態(tài)位點(diǎn)與南陽(yáng)牛體尺指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析
權(quán)利要求
一種檢測(cè)黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含ANGPTL4基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛ANGPTL4基因；用限制性?xún)?nèi)切酶MspI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛ANGPTL4基因第1422位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對(duì)P為上游引物tgcgaatcca gaatctac18；下游引物agcaaaaggt tggacact18。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所 述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min ；30 35個(gè)循環(huán)94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸30s ；72°C延 伸 lOmin。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所 述的聚丙烯酰胺凝膠電泳為質(zhì)量濃度10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于， 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛ANGPTL4基因第1422位的單核苷酸多態(tài)性為T(mén)T 基因型表現(xiàn)為292bp條帶；TC基因型表現(xiàn)為292bp、179bp和113bp條帶；CC基因型表現(xiàn)為 179bp 和 113bp 條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)黃牛ANGPTL4基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含ANGPTL4基因的待測(cè)黃牛全基因組DNA為模板，以引物對(duì)P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛ANGPTL4基因；用限制性?xún)?nèi)切酶MspI消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對(duì)酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛ANGPTL4基因第1422位的單核苷酸多態(tài)性。由于ANGPTL4基因功能涉及體重、日增重、體斜長(zhǎng)和胸圍4個(gè)重要的生長(zhǎng)性狀，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法為ANGPTL4基因的SNP與生長(zhǎng)性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國(guó)黃牛肉用生長(zhǎng)性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921856SQ201010255658
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月18日
發(fā)明者侯飛, 朱金龍, 李榮榮, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 馬云 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)