專利名稱：一種獨(dú)立診斷肝臟疾病的miRNA表達(dá)量模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種獨(dú)立診斷肝臟疾病的miRNA表達(dá)
量模型。
背景技術(shù)：
慢性乙肝、丙型肝炎(簡稱丙肝)、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌等肝臟相關(guān)疾病 依舊是嚴(yán)重危害人們身體健康的重大疾病。研究表明，在正常生理狀態(tài)下，miRNAs與肝臟 發(fā)育、肝細(xì)胞表型分化、肝臟代謝及應(yīng)激等基本生命活動(dòng)密切相關(guān)，而miRNAs的異常表達(dá) 調(diào)控與肝臟病毒感染與復(fù)制、HCC(肝細(xì)胞癌)、的發(fā)生發(fā)展等密切關(guān)聯(lián)。例如，肝臟特異性 表達(dá)的miR-122可能通過調(diào)控CAT-I等靶基因的表達(dá)進(jìn)而影響肝細(xì)胞的生長發(fā)育、膽固醇 及脂類代謝。另外，miR-122不但與HCV的復(fù)制密切相關(guān)，還以類似于抑癌基因的作用方式 參與HCC的發(fā)生發(fā)展。研究表明，機(jī)體內(nèi)組織、器官的代謝異常或器質(zhì)性病變可能會(huì)導(dǎo)致特定疾病狀態(tài) 下某些循環(huán)miRNAs的表達(dá)水平升高或降低。例如腫瘤細(xì)胞可以釋放其內(nèi)源性miRNAs進(jìn)入 外周血循環(huán)；組織細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNAs可因細(xì)胞壞死而直接進(jìn)入血循環(huán)，導(dǎo)致特定疾 病狀態(tài)下特定循環(huán)miRNAs的表達(dá)水平顯著變化。因此，可以通過深入研究不同疾病狀態(tài)下 循環(huán)miRNAs表達(dá)譜的差異性及其與疾病的關(guān)聯(lián)關(guān)系為疾病診斷、篩查及療效監(jiān)控等提供 新的分子標(biāo)志物。目前篩選標(biāo)志性循環(huán)miRNAs的研究策略主要是通過比較不同生理和病理?xiàng)l件 下miRNAs表達(dá)譜的差異，尋找相應(yīng)的miRNAs作為生理和病理相關(guān)的候選分子并進(jìn)行病 例-對照研究，分析循環(huán)miRNAs的差異化表達(dá)與生理、臨床病理資料的相關(guān)性，進(jìn)而結(jié)合 miRNAs功能分析，評(píng)價(jià)候選循環(huán)miRNAs作為輔助診斷等標(biāo)志物的可能性，其中的關(guān)鍵問題 是找到不同病理生理狀態(tài)下差異化表達(dá)的miRNAs。近年，通過基因芯片等高通量表達(dá)譜分析技術(shù)可以從CHB(慢性乙肝)、HCV感染 肝組織標(biāo)本、LC(肝硬化)和HCC等肝臟組織標(biāo)本中檢測到多種異常表達(dá)的、與肝臟疾病 發(fā)展可能密切相關(guān)的miRNAs。例如，miR-101在肝細(xì)胞肝癌的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑 制成瘤。再如，Murakami等發(fā)現(xiàn)miR-18、miR-224和pre miR-18在肝癌組織中高表達(dá)，而 miR-195, miR-199a, miR-200a和miR_125a在肝癌組織中低表達(dá)；基于異常表達(dá)的miRNAs， 利用支持向量機(jī)(support vector machine, SVM)可對97. 8%的肝癌進(jìn)行準(zhǔn)確判別。此外 發(fā)現(xiàn) miR-182，miR-224，miR-15b 和 miR_199b 前體在 CHB 中表達(dá)升高，而 miR-28，miR_342， miR-126，miR-199a和miR_145b等8種miRNAs在LF中表達(dá)升高。顯然，深入解析理解 miRNAs與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，有助從發(fā)展新的肝病診療技術(shù)。就肝病的血清學(xué)診斷而言，除了 ALT、AST和AFP等傳統(tǒng)的生化標(biāo)志物以外，發(fā)現(xiàn)、 發(fā)展更加特異、敏感、微創(chuàng)性的肝病標(biāo)志物，對于肝臟相關(guān)疾病的輔助診斷、治療評(píng)價(jià)、病情 評(píng)估等依然具有十分重要的臨床意義。miR-885-5p基因定位于3號(hào)染色體的p25. 3，由Berezikov E等克隆測序發(fā)現(xiàn)，目
3前未見其功能研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明采用“miRNAs cDNA文庫+文庫預(yù)擴(kuò)增+TLDA”的研究策略，首先建立基于 臨床常規(guī)收集的血清樣本篩查差異化表達(dá)miRNAs的技術(shù)路徑，并以肝硬化和肝癌患者為 研究對象，利用基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，rt-qPCR)的低密度 陣列TLDA (TaqMan low density array, TLDA)為基本技術(shù)平臺(tái)，對健康對照、肝硬化及肝癌 患者血清標(biāo)本中潛在的循環(huán)miRNAs表達(dá)譜進(jìn)行了分析和比對。本發(fā)明通過對肝硬化、肝細(xì)胞癌患者血清標(biāo)本中潛在的循環(huán)miRNAs種類及相對 表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并與健康對照血清中相應(yīng)的循環(huán)miRNAs的表達(dá)豐度進(jìn)行了比較，找 到了與肝臟疾病相關(guān)的循環(huán)miRNAs中的miR-885-5p表達(dá)量模型。具體的，本發(fā)明提供了一種診斷肝臟疾病的模型，該模型由miR-885-5p的表達(dá)量 指標(biāo)組成，其中miR-885-5p表達(dá)水平顯著高于健康對照，達(dá)到ρ < 0. 0001。具體的，患者是否患有肝臟疾病，通過驗(yàn)證該診斷模型是否符合標(biāo)準(zhǔn)即可，如果患 者的miR-885-5p表達(dá)水平顯著高于健康對照，則說明其患有肝臟疾病。其中肝臟疾病優(yōu)選為HCC、LC和CHB中的一種或多種。本發(fā)明通過病例-對照研究，發(fā)現(xiàn)HCC、LC和CHB患者血清中miR-885_5p的表達(dá) 水平顯著高于健康對照。ROC曲線分析顯示，miR-885-5p鑒別肝臟疾病HCC、LC和CHB和健 康對照的效能為AUC = 0. 904，敏感性和特異性分別為90. 5%陽79. 2%。在肝病疾患個(gè)體中，miR-885-5p的升高與傳統(tǒng)肝功生化參數(shù)ALT、AFP、AST和GGT 間未見相關(guān)關(guān)系。因此，循環(huán)miR-885-5p是一種相對獨(dú)立的肝臟疾病標(biāo)志物。本發(fā)明通過篩選可能與肝病相關(guān)的循環(huán)miRNAs作為候選分子進(jìn)行了驗(yàn)證。最 終結(jié)果顯示，HCC、LC和CHB患者血清中miR-885-5p的表達(dá)水平顯著高于健康對照(ρ < 0. 0001)，而GC(胃癌)患者血清中miR-885-5p的表達(dá)水平與健康對照組比較未見顯著 差異。ROC曲線分析顯示，miR-885-5p對肝臟疾病(HCC、LC和CHB)和健康對照的鑒別效 能為0. 904(95% CI 0. 837-0. 951)，敏感性和特異性分別為90. 5%和79. 2%，遠(yuǎn)高于ALT 的鑒別效能(AUC = 0. 742)。在肝臟疾患個(gè)體中，miR-885-5p的升高與傳統(tǒng)肝功生化參數(shù) ALT、AFP、AST和GGT間未見相關(guān)關(guān)系。因此，血清循環(huán)miR-885_5p是一種潛在的、相對獨(dú) 立的肝臟疾病標(biāo)志物。


圖1 不同組別間miR-885-5p相對表達(dá)水平的比較(使用U6 snRNA標(biāo)化miRNAs ； 組間比較采用 Mann-Whitney 或 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn))·圖2 =ROC曲線分析顯示血清miR-885-5p對肝臟疾病(N = 95)和健康對照(N = 24)的鑒別效能·圖3 =ALT對肝臟疾病組(N = 95)和健康對照組(N = 24)的鑒別效能.(R0C曲線 的縱軸表示真陽性率，TPR橫軸示假陽性率FPR).圖4 對ICC、FNH及NC血清標(biāo)本中miR-885_5p的定量(散點(diǎn)圖中橫線表示各組 中miR-885-5p的中位數(shù)值；ICC，肝膽管細(xì)胞癌，F(xiàn)NH，肝臟結(jié)節(jié)性增生).
具體實(shí)施例方式
為了理解本發(fā)明，下面以實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。研究對象
血清標(biāo)本包括24例健康對照(NC)、23例CHB、26例肝硬化(LC)和46例肝細(xì)胞癌 (HCC)患者。另外，納入17例胃癌(GC)血清標(biāo)本作為疾病對照。其中，健康對照、肝硬化、 肝細(xì)胞癌的納入標(biāo)準(zhǔn)同前所述。所有CHB病例的乙肝表面抗原HBsAg均為陽性。胃癌患者 均為首次入院接受治療的患者，入院前未曾接受任何藥物或手術(shù)治療，排除所有肝臟相關(guān) 疾病，術(shù)后均經(jīng)過病理檢查確認(rèn)。其中健康對照血清來自本院工作人員，除個(gè)別人員患有糖 尿病或高血脂外，其他檢查均未見異常。肝硬化和肝細(xì)胞癌患者血清標(biāo)本收集自本院生化 科。標(biāo)本收集所有血清標(biāo)本均于血樣采集后24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行血清收集及處理，獲得無細(xì)胞血清 標(biāo)本。其中，健康對照血清樣本來自本院健康體檢中心，所有納入個(gè)體的血液常規(guī)、血液生 化檢測、肝功等參數(shù)均未見異常，排除相關(guān)肝臟疾病。肝硬化診斷由富有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)師按 照相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，標(biāo)本的納入依據(jù)臨床診斷。肝細(xì)胞癌病例的納入標(biāo)準(zhǔn)為首次就診、 病理診斷確切、血清樣本收集前尚未經(jīng)任何治療。肝硬化和肝細(xì)胞癌患者血清標(biāo)本收集自 本院生化科。主要儀器、試劑及耗材主要儀器設(shè)備參見第一部分，多通道移液器(0. 5-10 μ L量程)為Eppendorf公司 產(chǎn)品，96-孔板及光學(xué)貼膜購自ABI公司。_TaqMan gene expression master mixmiRNAs反轉(zhuǎn)錄試劑盒mirVana PARIS kitRNase/DNase free waterhsa-miR-885-5p assayU6 snRNA assayDNase I瓊脂糖_血清(漿)總RNA的抽提與純化按照mirVana PARIS試劑盒(Ambion)使用說明書從血清(血漿)中提取400 μ 1 血清(血漿)總RNA。使用DU-800 (Beckman Coulter，美國)對RNA抽提液濃度進(jìn)行定量， 詳細(xì)操作見儀器使用說明書。根據(jù)血清總RNA定量結(jié)果，將每一份總RNA提取液的濃度均調(diào)整為2ng/ μ L，分裝， 置_80°C低溫冰箱凍存?zhèn)溆?。RNA提取液的消化參照DNase I (promega)使用說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄(RT)ABI公司 ABI公司 Ambion公司 Sigma ABI公司 ABI公司 Promega Sigma
利用Mastercycler印gradient PCR儀進(jìn)行批量RT反應(yīng)。RT反應(yīng)體系及參數(shù)同 第一部分，共計(jì)7. 5 μ L的RT反應(yīng)體系中包括包括2. 08 μ L水、0. 75 μ L的10XRT緩沖液、 0. 075 μ L 的 dNTP mix,RNA 酶抑制劑 0. 095 μ L、miR-885_5p 的莖-環(huán)式 RT 引物 1. 5 μ L、反 轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ L及消化后RNA樣品2. 5 μ L (5ng)。RT 參數(shù)設(shè)置為16°C 30min,42°C 30min,85°C 5min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，RT 產(chǎn)物 置-20°C凍存?zhèn)溆?。miR-885-5p 的序列入庫號(hào)為 MIMAT0004947，序列為 uccauuacacuacccugccucu實(shí)時(shí)熒光定量PCR所有實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)均于96-孔板進(jìn)行，每一個(gè)樣品中對miRNAs及內(nèi)參 基因TOsnRNA的定量均做3次復(fù)孔，計(jì)算平均值。qPCR在ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR系 統(tǒng)上進(jìn)行，每一孔的反應(yīng)體積為10 μ L，讀取Ct (cycle threshold, Ct)值時(shí)系統(tǒng)閾值均設(shè) 定為0.2。qPCR循環(huán)參數(shù)按照5ul(RT產(chǎn)物)29ul (水)的比例對RT產(chǎn)物進(jìn)行稀釋， 短暫vortex混勻、離心。按照“4. 5ul RT產(chǎn)物稀釋液TaqMan基因表達(dá)定量主反應(yīng)液 5. Oul TaqMan microRNA assay的0. 5ul ”的比例確定PCR體系，利用ABI 7300系統(tǒng)進(jìn)行 miRNA定量檢測，循環(huán)參數(shù)設(shè)定為95°C IOmin活化Taq酶，然后95°C 15sec，60°C lmin，共 40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析采用內(nèi)參基因TOsnRNA標(biāo)化、計(jì)算被檢miRNAs的Δ Ct值，錄入Excel數(shù)據(jù)表，建 庫。采用相對定量法(2_δ Δε 法)分析不同組別間的miRNAs表達(dá)水平的差異。以計(jì)算 A組樣品和B組樣品間某一個(gè)靶基因表達(dá)水平差異為例，-Δ ACt的計(jì)算公式為- Δ Δ Ct = (Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因)Α組樣品-(Ct麵因-Ct內(nèi)參基因)Β組樣品數(shù)據(jù)正態(tài)性檢驗(yàn)采用動(dòng)差法，非正態(tài)數(shù)據(jù)的組間比較采用Marm-Whitney檢驗(yàn)或 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Chiss 2005軟件完成，以ρ < 0. 05為顯著性 檢驗(yàn)水準(zhǔn)。數(shù)據(jù)相關(guān)性分析采用 Sigmaplot。ROC(receiver operating characteristic, ROC)分析及 AUC(area under the curve, AUC)計(jì)算由 MedCalc 9. 6. 4 軟件完成。獨(dú)立納入的樣本包括健康對照24例，肝臟疾病患者共計(jì)95例，包括CHB (N = 23)、 肝硬化(N = 26)和肝細(xì)胞癌(N = 46例)。另以17例胃癌(GC)血清標(biāo)本為疾病對照。定量分析結(jié)果證實(shí)，HCC和LC患者血清中miR-885_5p的表達(dá)水平顯著高于健康對 照(ρ < 0. 0001)，且 CHB 患者血清中 miR-885-5p 亦顯著高表達(dá)(ρ < 0. 0001，Mann-Whitney 檢驗(yàn))。有趣的是，GC患者血清中miR-885-5p的表達(dá)水平與健康對照組比較未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差 異(圖1)。將HCC、LC和CHB患者視為同一個(gè)肝臟疾病組(N = 95)，利用ROC曲線分析 miR-885-5p對肝臟疾病和健康對照的鑒別效能。結(jié)果顯示，通過ROC分析得到的最佳 cut-off值為1. 06 (2_Δ"，相對于TOsnRNA)，此時(shí)得到的曲線下面積(AUC) % 0. 904(95% CI 0. 837-0. 951) 2)，敏感性和特異性分別為90. 5%和79. 2%，而此時(shí)ALT對肝臟疾病 組和健康對照組的鑒別效能為AUC = 0. 742 (圖3)。另外，對數(shù)例ICC(肝膽管細(xì)胞癌)、FNH(肝臟結(jié)節(jié)性增生)患者血清標(biāo)本中 miR-885-5p定量檢測也發(fā)現(xiàn)，其中位數(shù)值高于健康對照(圖4)。
綜上試驗(yàn)，本發(fā)明提供的應(yīng)用miR-885_5p的指標(biāo)值作為診斷肝臟疾病的模型敏 感性和特異性高。本發(fā)明的模型已經(jīng)通過具體的實(shí)施例進(jìn)行了描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本發(fā) 明的內(nèi)容適當(dāng)改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離 本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動(dòng)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為 包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種診斷肝臟疾病的模型，該模型由miR 885 5p的表達(dá)量指標(biāo)組成，其中miR 885 5p表達(dá)水平顯著高于健康對照，達(dá)到p＜0.0001。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的模型，其中肝臟疾病為HCC、LC和CHB中的一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種獨(dú)立診斷肝臟疾病的miRNA表達(dá)量模型。通過對肝硬化、肝細(xì)胞癌患者血清標(biāo)本中潛在的循環(huán)miRNAs種類及相對表達(dá)水平進(jìn)行了分析，并與健康對照血清中相應(yīng)的循環(huán)miRNAs的表達(dá)豐度進(jìn)行了比較，找到了與肝臟疾病相關(guān)的循環(huán)miRNAs中的miR-885-5p表達(dá)量模型。該模型由miR-885-5p的表達(dá)量指標(biāo)組成，其中miR-885-5p表達(dá)水平顯著高于健康對照，達(dá)到p＜0.0001。ROC曲線分析顯示，miR-885-5p鑒別肝臟疾病HCC、LC和CHB和健康對照的效能為AUC＝0.904，敏感性和特異性分別為90.5％和79.2％。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101921863SQ20101026836
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月1日
發(fā)明者張朋軍, 桂俊豪, 田亞平 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院