專利名稱：人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種能用于從人表皮細(xì)胞分離得到人表 皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基和分離得到的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣 多能細(xì)胞及其制備方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞由于材料來源困難、倫理問 題和異種(異體)免疫排斥反應(yīng)等原因，不容易被應(yīng)用到臨床。成體干細(xì)胞存在于成體各 種組織中。由于其材料來源廣泛，可實(shí)施自體細(xì)胞移植，故在臨床疾病治療中有著廣泛的應(yīng) 用前景。目前國內(nèi)外分離成功的成體干細(xì)胞有間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、脂 肪干細(xì)胞和胰島干細(xì)胞等。但目前報(bào)道的這些成體干細(xì)胞要么生長速度緩慢，要么擴(kuò)增代 數(shù)有限，都不能在較短時(shí)間內(nèi)(三個(gè)月)獲得臨床疾病治療所需要的巨額細(xì)胞數(shù)。這也是 目前妨礙成體干細(xì)胞應(yīng)用到臨床的瓶頸之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種能用于從人表皮細(xì)胞分離得到人表皮源性間充 質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，該細(xì)胞培養(yǎng)基還可以用于人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣 多能細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。本發(fā)明的能用于從人表皮細(xì)胞分離得到人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的 細(xì)胞培養(yǎng)基為在葡萄糖含量為0. 5 5g/L的DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、 非必須氨基酸、L-谷氨酰胺、慶大霉素，并使各種添加成分的終濃度如下胎牛血清體積 分?jǐn)?shù)為 10 25%、1 40ng hbFGF/mL、0. 1 20ng hSCF/mL、0. 1 2mL 100X 非必須氨基 酸/100mL、0. 1 2mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和1000 8000U 慶大霉素/100mL。本發(fā)明的DMEM培養(yǎng)基是公知的培養(yǎng)基，葡萄糖、胎牛血清、hbFGF(人堿性成纖細(xì) 胞生長因子)、hSCF (重組干細(xì)胞因子)、100X的非必須氨基酸、L-谷氨酰胺、PBS溶液以及 慶大霉素都屬于現(xiàn)有技術(shù)的產(chǎn)品，要么能夠根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)配置，要么能夠從試劑公司購買 到。本發(fā)明的能用于從人表皮細(xì)胞分離得到人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的 細(xì)胞培養(yǎng)基的配制方法是在DMEM培養(yǎng)基中加入葡萄糖，攪拌均勻，使其終濃度為0. 5 5g/L，形成一級基礎(chǔ)培養(yǎng)基。然后在一級基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加胎牛血清，hbFGF、hSCF、非必 須氨基酸、L-谷氨酰胺、慶大霉素，并使各種添加成分的終濃度如下胎牛血清體積分?jǐn)?shù) 為 10 25%、1 40ng hbFGF/mL、0. 1 20ng hSCF/mL、0. 1 2mL 100X 非必須氨基酸 /100mL、0. 1 2mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和1000 8000U慶 大霉素/lOOmL，攪拌均勻后而制得能用于從人表皮細(xì)胞分離得到人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞 樣多能細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。所述的含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3% L-谷氨酰胺的PBS溶液是在每IOOmL的PBS溶液中加入3g的L-谷氨酰胺。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基制備人表皮源性間充 質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的方法及其制備出的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞。本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟a)將人表皮細(xì)胞在上述細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b)然后用消化液消化，祛除未消化下來的人表皮細(xì)胞，收集消化下來的間充質(zhì)干 細(xì)胞樣細(xì)胞，即為人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞。該人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞在體外條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，因此本發(fā)明 的第三個(gè)目的是提供本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的傳代培養(yǎng)方法，該方 法為以本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基作為傳代培養(yǎng)基，于36士 1°C、5士 C02、90 100%濕度下 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，而獲得人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株。本發(fā)明的人表皮源性間充 質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞生長速度快，隔1 4天就可以1 3的比例傳代一次，可在3個(gè)月內(nèi) 傳30代以上，且至少可以從每個(gè)臨床廢棄的皮膚標(biāo)本從約3 X IO4個(gè)細(xì)胞開始三個(gè)月內(nèi)獲 得2X1016個(gè)新的成體干細(xì)胞。所述的人表皮細(xì)胞的優(yōu)選獲取方法是取包皮或其他皮膚組織，用II型組織酶消 化獲得表皮，將表皮剪碎，再用胰蛋白酶進(jìn)一步消化，獲得表皮細(xì)胞。所述的人表皮細(xì)胞在上述細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選培養(yǎng)條件為36士 1°C、5士 CO2,90 100%濕度，每隔2-3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。所述的b)步驟優(yōu)選為當(dāng)細(xì)胞生長至60 90%融合度時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的 胰蛋白酶與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的EDTA溶液按照體積比1 1混合而形成的消化液消化，祛 除未消化下來的人表皮細(xì)胞，收集消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞，即為人表皮源性間充 質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞。將本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞(見圖1、2)用常規(guī)的方法制備 染色體涂片，進(jìn)行核型檢查核型為正常男性46條染色體，帶型正常(見圖3、4)。使用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多 能細(xì)胞株的表面標(biāo)志(檢測方法是公知技術(shù)，商業(yè)試劑公司可提供試劑盒，按照試劑 公司提供的技術(shù)方案實(shí)施即可)，其表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志 CD73 (93. 5 99. 8% )、CD90(63. 4 99. 7% )、CD105(20. 3 92. 8% ) ,Vimentin (51. 3 96.7% )和Nestin(74. 2 98.4% )，如圖5所示，陽性的細(xì)胞呈棕色或棕黑色；不表達(dá) 或低表達(dá)終末神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血液細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志i3-IIItubulin(0 18. 7% )、MAP-2 (0 3. 2% )、GFAP (0 7. 2% )、CK19(0 1. 0% )、CD34 (0 1. 3% )、 CD45(0 0. 5%)、CD3(0 1. 1 % )、CD19 (0 0. 5% )、CD16 (0 0. 7%)、CD4(0 0. 5%), CD8 (0 0. 7% )、CD31(0 5. 8% )、VEGF-R2 (0 5. 5% )和 CDlO (0. 2 18. 2% )。用無血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)培養(yǎng)本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì) 干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株6天，再改用添加胎牛血清至終體積分?jǐn)?shù)為10%的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基 (購自GIBCO公司)培養(yǎng)7天，鏡檢發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞已形成神經(jīng)細(xì)胞樣的細(xì)長突起(見圖6)。激光 共聚焦顯微鏡觀察技術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志(檢測方法是公知技術(shù)，商業(yè)試劑公司可提供試 劑盒，按照試劑公司提供的技術(shù)方案實(shí)施即可)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志MAP-2、β -IIItubulin,陽性的細(xì)胞呈紅色熒光(見圖7，藍(lán)色為細(xì)胞核Hochest染色，紅色為標(biāo)記 紅色熒光單抗染色，由于圖7是黑白圖，藍(lán)色的細(xì)胞核呈橢圓狀，而紅色熒光呈點(diǎn)狀)。由此 可見本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株能分化為神經(jīng)樣細(xì)胞。用免疫細(xì)胞培養(yǎng)基(購自GIBCO公司)培養(yǎng)本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞 樣多能細(xì)胞株，7天后，鏡檢形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞形成了分泌泡，細(xì)胞內(nèi)外存在多量的折光 性強(qiáng)的圓形小泡(見圖8)。用流式細(xì)胞術(shù)檢測其表達(dá)免疫細(xì)胞特異性標(biāo)志的量增加，如 CD19(1. 7 11. 3% )、CD16(1. 3 5. 4% )、CD4(7. 3 14. 5% )、CD8 (4. 2 8. 1 % )。由 此可見本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株能分化成免疫細(xì)胞樣細(xì)胞。以每個(gè)胚胎4 8個(gè)本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的量注射入小 鼠囊胚腔內(nèi)制作嵌合體小鼠(常規(guī)制作方法)，經(jīng)PCR技術(shù)、人Y染色體原位雜交技術(shù)以及 抗人單抗免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)(檢測方法是公知技術(shù)，商業(yè)試劑 公司可提供試劑盒，按照試劑公司提供的技術(shù)方案實(shí)施即可)，在嵌合體小鼠血液中存在人 Y染色體以及人CD19等蛋白。如圖9 (PCR電泳圖)所示PCR技術(shù)檢測到在10號和11號 嵌合體小鼠(約5. 5月齡)血液中存在人Y染色體標(biāo)志性基因SRY基因(10和11泳道)； 如圖10 (人Y染色體原位雜交技術(shù)以及抗人單抗免疫熒光激光共聚焦顯微鏡觀察技術(shù)檢測 圖)所示10號嵌合體小鼠(約5. 5月齡)血液中存在的人Y染色體(圖IOA和D中的紅 色點(diǎn)，即圖IOA中箭頭所指的部分)和人標(biāo)志性蛋白CD19(圖IOB和D中的綠色熒光點(diǎn))。 由此可見本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞在5個(gè)月內(nèi)可以在嵌合體小鼠體 內(nèi)存活、遷移和分化。流式細(xì)胞術(shù)和免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)檢測(常規(guī)方法)發(fā)現(xiàn) HLA-DR(0 1. 3% )低表達(dá)或不表達(dá)和HLA-I (0. 1 61. )低表達(dá)或中度表達(dá)；以每只 鼠約IXlO7個(gè)將細(xì)胞經(jīng)腹腔注射和皮下注射入SCID小鼠體內(nèi)3個(gè)月后無發(fā)現(xiàn)腫瘤產(chǎn)生。 由此表明本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞生物安全性良好。綜上所述，本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞樣的 表形、核型正常，能夠表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志，不表達(dá)或低表達(dá)終 末神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血液細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志，能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì) 胞和免疫細(xì)胞樣細(xì)胞，生物安全性良好。利用本發(fā)明提供的細(xì)胞培養(yǎng)基，按照本發(fā)明的分離方法，可從人表皮細(xì)胞中分離 得到人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞，該人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞生物安 全性良好，能夠分化為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞和免疫細(xì)胞樣細(xì)胞，具有在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、免疫 系統(tǒng)疾病治療和異種器官構(gòu)建的應(yīng)用潛能。本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞 生長速度快，在本發(fā)明的體外傳代培養(yǎng)條件下，可在短時(shí)間內(nèi)(三個(gè)月內(nèi))至少可以傳代30 代，每個(gè)臨床廢棄的皮膚標(biāo)本從約3 X IO4個(gè)細(xì)胞開始最終至少可以獲得2 X IO16個(gè)細(xì)胞，足 以滿足臨床疾病治療和構(gòu)建組織工程化器官所需。


圖1和圖2是人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株的普通光學(xué)形態(tài)圖，類似間 充質(zhì)干細(xì)胞的表形；圖3和圖4是本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株的染色體涂片的帶 型圖5是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞 樣多能細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志圖；圖6是顯微鏡下觀察本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞分化為神經(jīng) 細(xì)胞樣細(xì)胞圖；圖7是激光共聚焦顯微鏡觀察技術(shù)檢測細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志MAP-2、 β -IIItubulin的圖；圖7A是細(xì)胞核Hochest染色(藍(lán)色)，圖7B是細(xì)胞體紅色熒光標(biāo)記 單抗染色、圖7C是圖7A和圖7B的重疊圖。圖8是顯微鏡下觀察本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞分化為免疫 細(xì)胞樣細(xì)胞的圖；圖9是對嵌合體小鼠的血液經(jīng)PCR技術(shù)檢測的電泳圖，其中M =Marker,H20 水、N 正常鼠外周血(陰性對照)、6 6號嵌合體小鼠外周血、7 7號嵌合體小鼠外周血、8 8號嵌 合體小鼠外周血、9 9號嵌合體小鼠外周血、10 10號嵌合體小鼠外周血、11 11號嵌合體 小鼠外周血、P 人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞(陽性對照)；圖10是應(yīng)用Y染色體原位雜交技術(shù)以及抗人單抗免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察技 術(shù)檢測嵌合體小鼠血液的圖；圖IOA是人Y染色體原位雜交圖(紅色點(diǎn)代表人Y染色體)、 圖IOB是綠色熒光標(biāo)記的人CD19單抗共聚焦顯微鏡觀察圖(綠色代表人CD19蛋白)、圖 IOC是細(xì)胞核Hochest染色(藍(lán)色)、圖IOD是圖10A、圖IOB和圖IOC的重疊圖。經(jīng)重疊后 可見人Y染色體位于細(xì)胞核內(nèi)，人CD19蛋白位于細(xì)胞體上。
具體實(shí)施例方式以下是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實(shí)施例11.配制細(xì)胞培養(yǎng)基在葡萄糖含量為0. 5g/L的DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必須氨 基酸、L-谷氨酰胺、慶大霉素，并使上述各種添加成分的終濃度如下胎牛血清體積分?jǐn)?shù) 為 10%、40ng hbFGF/mL、0. Ing hSCF/mLUmL 100X 非必須氨基酸/100mL、2mL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和1000U慶大霉素/100mL。由此而形成本實(shí)施例的 細(xì)胞培養(yǎng)基。所述的100X的非必須氨基酸購自購自GIBCO公司，其貨號為11140。2.獲取表皮組織和表皮細(xì)胞取臨床廢棄的包皮組織，浸泡在含1000U慶大霉素/mL的PBS溶液中，4°C保存；4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行如下處理用PBS充分洗滌，祛除血細(xì)胞，剪去皮下疏松結(jié)締組織，用II型組織 酶(2U/mL)浸泡消化過夜，獲得表皮，然后將表皮剪碎，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶進(jìn) 一步消化30分鐘，獲得表皮細(xì)胞，用PBS洗滌，然后離心祛除消化酶，用本實(shí)施例的細(xì)胞培 養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。3.培養(yǎng)表皮細(xì)胞將每個(gè)標(biāo)本獲得的表皮細(xì)胞接種于含有本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶3 4個(gè)中，于36士 1°C、5士 C02、90 100%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔2 3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。4.篩選和富集人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞
當(dāng)細(xì)胞生長至60 90%的融合度時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶加質(zhì)量分 數(shù)為0. 02%的EDTA(按體積比1 1混合)組成的消化液進(jìn)行分段消化；收集消化下來的 間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞，祛除未消化下來的表皮細(xì)胞；將收集到的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞置于 離心管內(nèi)，1000 1500rpm、5min離心祛除消化液；然后用本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮 細(xì)胞，該細(xì)胞即為本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞，將該細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。5.體外培養(yǎng)人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株將計(jì)數(shù)好的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞以約1 X105f/mL的密度接種 于含有本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中，于36士 1°C、5士 CO2,90 100%濕度培 養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔1 4天，以1 3比例傳代一次，直至30代以上，而獲得人表皮源性 間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株。每個(gè)臨床廢棄的皮膚標(biāo)本獲得的細(xì)胞三個(gè)月內(nèi)至少傳代30 代以上，從約3 X IO4個(gè)細(xì)胞最終至少獲得2X IO16個(gè)新的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能 細(xì)胞。對本實(shí)施例的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞株具 有間充質(zhì)干細(xì)胞樣的表形，核型正常，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志 ⑶73、⑶90、⑶105、Vimentin和Nestin ；不表達(dá)或低表達(dá)終末神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血液細(xì) 胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志β -III tubulin、MAP-2、GFAP、CK19、CD34、CD45、CD3、CD19、CD16、 ⑶4、⑶8、⑶31、VEGF-R2和⑶10 ；能分化為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞和免疫細(xì)胞樣細(xì)胞；HLA-DR低 表達(dá)或不表達(dá)和HLA-I低表達(dá)或中度表達(dá)。以每只鼠約1 X IO7個(gè)將細(xì)胞經(jīng)腹腔注射和皮 下注射入SCID小鼠體內(nèi)3個(gè)月后沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤產(chǎn)生。由此表明本發(fā)明人表皮源性間充質(zhì) 干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株生物安全性良好。實(shí)施例21.配制細(xì)胞培養(yǎng)基在葡萄糖含量為5g/L的DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必須氨基 酸、L-谷氨酰胺、慶大霉素，并使上述各種添加成分的終濃度如下胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為 25%Ung hbFGF/mL、20ng hSCF/mL、2mL 100X 非必須氨基酸/100mL、0. ImL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和8000U慶大霉素/100mL。由此而形成本實(shí)施例的細(xì) 胞培養(yǎng)基。所述的100X的非必須氨基酸購自購自GIBCO公司，其貨號為11140。2.獲取表皮組織和表皮細(xì)胞取臨床廢棄的包皮組織，浸泡在含1000U慶大霉素/mL的PBS溶液中，4°C保存；4 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行如下處理用PBS充分洗滌，祛除血細(xì)胞，剪去皮下疏松結(jié)締組織，用II型組織 酶(2U/mL)浸泡消化過夜，獲得表皮，然后將表皮剪碎，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶進(jìn) 一步消化30分鐘，獲得表皮細(xì)胞，用PBS洗滌，然后離心祛除消化酶，用本實(shí)施例的細(xì)胞培 養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。3.培養(yǎng)表皮細(xì)胞將每個(gè)標(biāo)本獲得的表皮細(xì)胞接種于含有本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶3 4個(gè)中，于36士 1°C、5士 C02、90 100%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔2 3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。4.篩選和富集人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞生長至60 90%的融合度時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的EDTA(按體積比1 1混合)組成的消化液進(jìn)行分段消化；收集消化下來的 間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞，祛除未消化下來的人表皮細(xì)胞；將收集到的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞置 于離心管內(nèi)，1000 1500rpm、5min離心祛除消化液；然后用本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸 浮細(xì)胞，該細(xì)胞即為本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞，將該細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。5.體外培養(yǎng)人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株將計(jì)數(shù)好的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞以約1 X105f/mL的密度接種 于含有本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中，于36士 1°C、5士 CO2,90 100%濕度培 養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔1 4天，以1 3比例傳代一次，直至30代以上，而獲得人表皮源性 間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株。每個(gè)臨床廢棄的皮膚標(biāo)本獲得的細(xì)胞三個(gè)月內(nèi)至少傳代30 代以上，從約3 X IO4個(gè)細(xì)胞最終至少獲得2X IO16個(gè)新的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能 細(xì)胞。對本實(shí)施例的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞株具 有間充質(zhì)干細(xì)胞樣的表形，核型正常，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志 ⑶73、⑶90、⑶105、Vimentin和Nestin ；不表達(dá)或低表達(dá)終末神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血液細(xì) 胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志β -III tubulin、MAP-2、GFAP、CK19、CD34、CD45、CD3、CD19、CD16、 ⑶4、⑶8、⑶31、VEGF-R2和⑶10，能分化神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞和免疫細(xì)胞樣細(xì)胞。HLA-DR低表 達(dá)或不表達(dá)和HLA-I低表達(dá)或中度表達(dá)，以每只鼠約1 X IO7個(gè)將細(xì)胞經(jīng)腹腔注射和皮下注 射入SCID小鼠體內(nèi)3個(gè)月后沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤產(chǎn)生，由此表明本發(fā)明人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞 樣多能細(xì)胞生物安全性良好。實(shí)施例31.配制細(xì)胞培養(yǎng)基在葡萄糖含量為2. 5g/L的DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必須氨基 酸、L-谷氨酰胺、慶大霉素，并使上述各種添加成分的終濃度如下胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為 18%,20ng hbFGF/mLUOng hSCF/mL、0. ImL 100X 非必須氨基酸/100mL、ImL 含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 3% L-谷氨酰胺的PBS溶液/IOOmL和4000U慶大霉素/100mL。由此而形成本實(shí)施例的細(xì) 胞培養(yǎng)基。所述的100X的非必須氨基酸購自購自GIBCO公司，其貨號為11140。2.獲取表皮組織和表皮細(xì)胞取臨床廢棄的人包皮組織，浸泡在含1000U慶大霉素/mL的PBS溶液中，4°C保存； 4小時(shí)內(nèi)進(jìn)行如下處理用PBS充分洗滌，祛除血細(xì)胞，剪去皮下疏松結(jié)締組織，用II型組 織酶(2U/mL)浸泡消化過夜，獲得表皮，然后將表皮剪碎，用為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%胰蛋白酶 進(jìn)一步消化30分鐘，獲得表皮細(xì)胞，用PBS洗滌，然后離心祛除消化酶，用本實(shí)施例的細(xì)胞 培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。3.培養(yǎng)表皮細(xì)胞將每個(gè)標(biāo)本獲得的表皮細(xì)胞接種于含有本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶3 4個(gè)中，于36士 1°C、5士 C02、90 100%濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔2 3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。4.篩選和富集人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞當(dāng)細(xì)胞生長至60 90%的融合度時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25%的胰蛋白酶加質(zhì)量分 數(shù)為0. 02%的EDTA(按體積比1 1混合)組成的消化液進(jìn)行分段消化；收集消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞，祛除未消化下來的表皮細(xì)胞；將收集到的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞置于 離心管內(nèi)，1000 1500rpm、5min離心祛除消化液；然后用本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基重新懸浮 細(xì)胞，該細(xì)胞即為本發(fā)明的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞，將該細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。5.體外培養(yǎng)人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株將計(jì)數(shù)好的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞以約1 X105f/mL的密度接種 于含有本實(shí)施例的細(xì)胞培養(yǎng)基的T25培養(yǎng)瓶中，于36士 1°C、5士 CO2,90 100%濕度培 養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔1 4天，以1 3的比例傳代一次，直至30代以上，而獲得人表皮源 性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株。每個(gè)臨床廢棄的皮膚標(biāo)本獲得的細(xì)胞三個(gè)月內(nèi)至少傳代30 代以上，從約3 X IO4個(gè)細(xì)胞最終至少獲得2X IO16個(gè)新的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能 細(xì)胞。對本實(shí)施例的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞株具 有間充質(zhì)干細(xì)胞樣的表形，核型正常，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志 ⑶73、⑶90、⑶105、Vimentin和Nestin ；不表達(dá)或低表達(dá)終末神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞、血液細(xì) 胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志β -Illtubulin、MAP-2、GFAP, CK19、CD34、CD45、CD3、CD19、CD16、 ⑶4、⑶8、⑶31、VEGF-R2和⑶10，能分化為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞和免疫細(xì)胞樣細(xì)胞。HLA-DR低 表達(dá)或不表達(dá)和HLA-I低表達(dá)或中度表達(dá)，以每只鼠約1 X IO7個(gè)將細(xì)胞經(jīng)腹腔注射和皮下 注射入SCID小鼠體內(nèi)3個(gè)月后沒有發(fā)現(xiàn)腫瘤產(chǎn)生，由此表明本發(fā)明人表皮源性間充質(zhì)干細(xì) 胞樣多能細(xì)胞生物安全性良好。
權(quán)利要求
一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于在葡萄糖含量為0.5～5g/L的DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必須氨基酸、L 谷氨酰胺、慶大霉素，并使上述各種添加成分的終濃度如下胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為10～25％、1～40ng hbFGF/mL、0.1～20ng hSCF/mL、0.1～2mL 100X非必須氨基酸/100mL、0.1～2mL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％L 谷氨酰胺的PBS溶液/100mL和1000～8000U慶大霉素/100mL。
2.—種人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a)將人表皮細(xì)胞在權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；b)然后用消化液消化，祛除未消化下來的人表皮細(xì)胞，收集消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞 樣細(xì)胞，即為人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的制備方法，其特征在 于，所述的步驟a)的人表皮細(xì)胞的獲取方法為取包皮或其他皮膚組織，用II型組織酶消 化獲得表皮，將表皮剪碎，再用胰蛋白酶進(jìn)一步消化，獲得人表皮細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的制備方法，其特征 在于，所述的步驟a)中人表皮細(xì)胞在權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 36士 1°C、5士 C02、90 100%濕度，每隔2-3天更換細(xì)胞培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的制備方法，其特征在 于，所述的步驟b)的具體步驟為當(dāng)細(xì)胞生長至60 90%融合度時(shí)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 25% 的胰蛋白酶與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%的EDTA溶液按照體積比1 1混合而形成的消化液消化， 祛除未消化下來的人表皮細(xì)胞，收集消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞，即為人表皮源性間 充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞的制備方法制備的人 表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞。
7.一種將權(quán)利要求6所述的人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)的方 法，其特征在于，傳代培養(yǎng)的條件為，以權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基作為傳代培養(yǎng)基，于 36士 1°C、5士 C02、90 100%濕度下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，而獲得人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣 多能細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明公開一種細(xì)胞培養(yǎng)基和人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞及其制備方法。該培養(yǎng)基為在葡萄糖含量為0.5～5g/l的DMEM培養(yǎng)基中添加胎牛血清、hbFGF、hSCF、非必須氨基酸、L-谷氨酰胺、慶大霉素，并使其終濃度為胎牛血清體積分?jǐn)?shù)為10～25％、1～40ng hbFGF/ml、0.1～20ng hSCF/ml、0.1～2ml 100X非必須氨基酸/100ml、0.1～2ml含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％l-谷氨酰胺的PBS溶液/100ml和1000～8000U慶大霉素/100ml。將人表皮細(xì)胞在上述細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用消化液消化，祛除未消化下來的人表皮細(xì)胞，收集消化下來的間充質(zhì)干細(xì)胞樣細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)傳代后即為人表皮源性間充質(zhì)干細(xì)胞樣多能細(xì)胞株。該多能細(xì)胞株生物安全性良好，能分化為神經(jīng)細(xì)胞樣細(xì)胞和免疫細(xì)胞樣細(xì)胞，具有在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)、免疫系統(tǒng)疾病治療和異種器官構(gòu)建的應(yīng)用潛能。
文檔編號C12N5/0775GK101948803SQ201010282388
公開日2011年1月19日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者葛堅(jiān), 黃冰 申請人:中山大學(xué)中山眼科中心