專利名稱：ABA8'-羥化酶基因的RNAi植物表達(dá)載體及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種抑制ABA8’ -羥化酶基因表達(dá)的 RNAi植物表達(dá)載體及其用途，特別涉及基于大麥ABA8’ -羥化酶基因HvABAS’ OH-I的雙鏈 RNAi植物表達(dá)載體及其在抗穗發(fā)芽基因工程中的用途。
背景技術(shù)：
穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting, PHS)或穗萌是指籽粒收獲前遇到陰雨天氣或 潮濕環(huán)境下的穗上發(fā)芽。穗發(fā)芽時常發(fā)生于小麥、大麥、玉米和水稻等主要農(nóng)作物，嚴(yán)重 影響其產(chǎn)量和品質(zhì)，是世界性重要農(nóng)業(yè)災(zāi)害。穗發(fā)芽受環(huán)境和基因型互作的控制(Zhang HF, Lu RH. Study on the mechanism of the resistance to preharvest sprouting and inheritancein wheat. Acta Agron Sin，1993，19 (6) :523_530)，基因型影響穗發(fā)芽的因素 極其復(fù)雜(Sheng ZXjYu SRjWu ZS. Studies on pre-harvest sprouting resistance in wheatcultivars. Sci Agic Sin，1991，24 (5) :44_50;肖世和.小麥穗發(fā)芽研究.中國北 京.中國農(nóng)業(yè)出版社，2003)，目前已發(fā)現(xiàn)穗發(fā)芽性狀受多個遺傳系統(tǒng)的調(diào)控，種子休眠性 弱以及隨后產(chǎn)生的高？淀粉酶活性是導(dǎo)致籽粒穗發(fā)芽的主要原因(Biddulph TB，Plummer JA, Setter TL, Mares DJ. Influence of high temperature and terminal moisture stresson dormancy in wheat(Triticum aestivum L.). Field Crops Res，2007，103 139-153)。盡管目前已發(fā)現(xiàn)多個與休眠有關(guān)的QTL位點，其遺傳效應(yīng)在很大程度上受到環(huán) 境或其他基因互作的影響，難以有效用于育種實踐?？剐再Y源匱乏是作物抗穗發(fā)芽育種急 需解決的關(guān)鍵問題。脫落酸(ABA)是誘導(dǎo)和維持種子胚休眠并抑制萌發(fā)的重要植物激素(Gubler F, MillarAA, Jacobsen JV. Dormancy release, ABA and pre—harvest sprouting. Curr OpinPlant Biol,2005,8 183-187 ；Lefebvre V, North H, Frey A, Sotta B, Seo M, Okamoto M, Nambara E, Marion—Poll A. Functional analysis of Arabidopsis NCED6and NCED9 genes indicates that ABA synthesized in the endosperm is involved inthe induction of seed dormancy. Plant J, 2006，45 :309_319)，最新研究表明，ABA 合成關(guān) 鍵酶基因的突變導(dǎo)致水稻種子ABA含量下降并發(fā)生穗萌(Fang J, Chai CL, Qian Q，Chu CC, Li CL, Tang JY, Sun L, Huang ZJ, Guo XL, Sun CH, Liu M. Mutations ofgenes in synthesis of the carotenoid precursors of ABA lead to pre-harvestsprouting and photo-oxidation in rice. Plant J，2008，54 :177-189)。ABA 合成與分解代謝的動態(tài)平衡 共同調(diào)控植物內(nèi)源ABA水平，ABA 8’-羥化酶(ABA 8’_hydroxylation)是內(nèi)源ABA主要代 謝途徑的關(guān)鍵酶。研究表明，屬于細(xì)胞色素P450家族的ABA8’-羥化酶基因CYP707A與擬南 芥種子萌發(fā)過程中ABA的迅速下降有著密切的聯(lián)系，其中CYP707A2被認(rèn)為是調(diào)控種子ABA 水平，進(jìn)而影響種子從休眠向萌發(fā)狀態(tài)轉(zhuǎn)化的重要基因。目前已先后從水稻(Yang SH,Choi D. Characterization of genes encoding ABA -hydroxylase inethylene-induced stem growth of deepwater rice (Oryza sativa L. ). Biochem&Biophys Res Commun,2006，350 :685_690)、大麥(Millar AA, Jacobsen JV, Ross JJ, Helliwell CA, Poole AT, Scofield G, Reid JB, Gubler F. Seed dormancy and ABAmetabolism in Arabidopsis and barley :The role of ABA 8' -hydroxylase. Plant J, 2006,45 (6) :942_954)、小麥 (Zhang CL,He XY,He ZH,Wang LH,Xia XC. Cloningof TaCYP707Al gene that encodes ABA 8' -hydroxylase in common wheat(Triticumaestivum L.).Sci Agic Sin,2009,8 (8) 902-909)等物種中克隆到CYP707A2同源基因。大麥同源基因HvABA8，0H_1 (gi =81362265) 基因表達(dá)譜分析表明，種子吸脹過程中該基因表達(dá)量在不休眠種子中明顯高于休眠種子， 與這一時期種子中ABA含量的明顯下降相對應(yīng)，說明HvABAS’ 0H-1可能是種子萌發(fā)過程中 的一個關(guān)鍵基因(Millar AA, Jacobsen JV, RossJJ, Helliwell CA, Poole AT, Scofield G, Reid JB,Gubler F. Seed dormancy and ABAmetabolism in Arabidopsis and barley :The role of ABA 8'-hydroxylase. Plant J，2006，45 (6) :942_954)。基因序列比對發(fā)現(xiàn)，位于 大麥同源基因HvABA8’ 0H-1編碼區(qū)1006_1298bp的片段比較保守，在不同物種中相似性平 均達(dá)到80%左右，與水稻同源基因0SCYP707A5的相似性高達(dá)93%。RNA干擾(RNAi)是指轉(zhuǎn)基因植物中雙鏈RNA誘導(dǎo)同源mRNA降解，導(dǎo)致特定基 因不表達(dá)或表達(dá)量很低的現(xiàn)象。隨著植物基因組測序工作的完成，以及越來越多生物代 謝途徑中某些關(guān)鍵酶基因的發(fā)現(xiàn)，RNAi技術(shù)已成為動植物性狀改良和疾病基因治療的強 有力工具(Wang MB, Abbott DC, Waterhouse PM. A single copy of a virus-derived transgene encodinghairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus. Mol Plant Pathol,2000,1(6) 347-356 ；Regina A, Bird A, Topping D, Bowden S, Freeman J, Barsby T,Kosar-Hashemi B,Li ZY, Rahman S,Morell M. High-amylose wheat generated by RNAinterference improves indices of large-bowel health in rats. PNAS,2006, 103 =3546-3551)。選擇控制內(nèi)源ABA主要代謝途徑的ABA 8，-羥化酶基因序列，設(shè)計構(gòu)建 高效的RNAi植物表達(dá)載體用于轉(zhuǎn)化植物組織細(xì)胞，通過特異性抑制內(nèi)源ABA代謝相關(guān)的酶 基因表達(dá)來提高種子內(nèi)源ABA含量，增強種子胚休眠水平從而抑制穗發(fā)芽，有可能從根本 上控制作物穗發(fā)芽的危害。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物ABA代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因的雙鏈RNAi植物表 達(dá)載體及其用途。本發(fā)明提供的RNAi植物表達(dá)載體含有來源于大麥ABA 8’-羥化酶基因 (ΗνΑΒΑ8 Η-1)堿基序列的發(fā)卡RNA(hpRNA)表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒。hpRNA表達(dá)盒 含有pGlub種子特異性啟動子驅(qū)動的ABA 8'-羥化酶基因反向重復(fù)序列片段，是來自序列 表1的5'端第1 006位核苷酸序列按照序列表1的核苷酸排列方式向3'端延長，長度為 293bp的脫氧核苷酸片段，在植物細(xì)胞內(nèi)能轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA。選擇標(biāo)記基因表 達(dá)盒含有PNos啟動子、潮霉素抗性基因hpt和Nos終止子。上述hpRNA表達(dá)盒以及含有它的重組表達(dá)載體，包括構(gòu)建的中間載體和具選擇標(biāo) 記基因的RNAi表達(dá)載體，工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的RNAi植物表達(dá)載體通過使用Ti質(zhì)粒、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、農(nóng)桿菌介 導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)能轉(zhuǎn)錄形成hpRNA雙鏈RNA分子。經(jīng)種子特異表達(dá)的hpRNA誘導(dǎo)產(chǎn)生的RNAi能抑制ABA 8’ -羥化酶基因表達(dá)，降低轉(zhuǎn)化植 株的ABA代謝水平，使內(nèi)源ABA含量維持在一定水平，從而增強種子休眠性和抗穗發(fā)芽能 力。使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織獲得18個轉(zhuǎn)基因水稻株系，種子萌發(fā)實驗的結(jié)果 初步表明，部分轉(zhuǎn)基因水稻株系的種子萌發(fā)速率明顯降低。引發(fā)RNAi的效應(yīng)分子是長度僅 為21-23bp的雙鏈RNA(dsRNA)，用于構(gòu)建本載體的大麥HvABA8’ OH-I基因片段與水稻、小 麥同源基因的相似性高達(dá)93%以上，載體可以形成長度為293bp的dsRNA。因此該載體可 以轉(zhuǎn)化小麥、大麥、水稻等重要禾本科作物，在培育抗穗發(fā)芽轉(zhuǎn)基因作物新品種領(lǐng)域具有很 好的應(yīng)用前景。


圖1為HvABA8 iOH-I基因片段RNAi載體的構(gòu)建流程 2 為 HvABA8 iOH-I 基因片段 RNAi 載體分別經(jīng) EcoR I/PstI 和 Spel/BamH I 雙 酶切的電泳圖。圖中1為未酶切的重組質(zhì)粒，2為酶切的重組質(zhì)粒，M為DL2000 Maker，A為 HvABAS' OH-I基因片段酶切圖，B為內(nèi)含子酶切圖。圖3為PABA8，OH-I載體的質(zhì)粒圖譜。圖4為轉(zhuǎn)基因水稻的PCR鑒定。M為DL2000 Maker，1為質(zhì)粒陽性對照，2為未轉(zhuǎn) 化植株陰性對照，3、4、6、7、8、10均為轉(zhuǎn)基因植株，5和9為轉(zhuǎn)基因陰性植株。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1菌株、質(zhì)粒的獲得及PCR引物的合成菌株和質(zhì)粒作為骨架載體的克隆載體pGreenll具有潮霉素抗性基因。質(zhì)粒PBI121、質(zhì)粒 PBIlOl和質(zhì)粒PTCK303分別提供構(gòu)建載體需要的pGlub胚乳特異性啟動子、NOS終止子和 內(nèi)含子。大腸桿菌(Escherichia coli)菌株為 DH5a，農(nóng)桿菌(Agrobacterim tumefacieus) 菌株為AGLl。PCR引物序列啟動子采用來自質(zhì)粒PBI121的胚乳特異性啟動子pGlub，設(shè)計含有SacI和NotI 酶切位點的上下游引物PgluB-FP :5’ AAGGAGCTCAGCTAGTATAGCTATCTAGGGTG 3’PgluB-RP :5，AAGGCGGCCGCTAGCGGTGGCGTTTGGGTGG 3，。以質(zhì)粒PBIlOl為模板，擴增Nos終止子，設(shè)計含有KpnI和XhoI酶切位點引物Nos-FP :5，AAGCTCGAGGATCGTTCAAACATTTGG 3，Nos-RP :5，AAGGGTACCGTAACATAGATGACACCG 3，。以質(zhì)粒PTCK303為模板擴增內(nèi)含子，分別攜帶SpeI和BamH I酶切位點引物Intron-FP :5’ AAGACTAGTAGATCTGCTAGCGGTAAGTTAC 3’Intron-RP :5，AAGGGATCCCTGAAAATCTCGAAACAGCC 3，。以大麥RNA反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA為模板，擴增HvABAS’ OH-I基因片段，設(shè)計正向引 物所帶酶切位點為XbaI和NotI，反向引物所帶酶切位點為EcoR I和PstI。
OHlCF :5’ TTGTCTAGAGCGGCCGCCGGGTGATCCAGGAGACGAT 3’OHlCR :5’ TTGACTAGTCTGCAGAGGTGGTGGCAGAGGACGAG 3’實施例2 RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化啟動子，終止子與內(nèi)含子的PCR擴增以質(zhì)粒載體PBI121、PBI101和PTCK303為模板，分別用攜帶相應(yīng)酶切位點的上、下 游引物進(jìn)行PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物，得到的特異性片段大小分別為1200、250、500bp 左右，與預(yù)期目的片段大小一致。HvABA8 ‘0H-1 基因片段的 RT-PCR 擴增以大麥cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增。擴增出293bp與預(yù)期大小相符的基因片段，經(jīng) 測序驗證片段序列正確。HvABA8 ‘0H-1基因片段RNAi載體的構(gòu)建克隆骨架載體采用攜帶潮霉素抗性選擇標(biāo)記基因(hpt)的雙元載體pGreenll。根 據(jù)酶切位點，連接的先后順序為=PGlub啟動子、Nos終止子、HvABAS’ OH-I基因反向片段和 HvABAS Η-1基因的正向片段，最后將內(nèi)含子連接上(圖1)。各元件經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后， 連接進(jìn)克隆載體pGreenll，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切，與 目的片段大小吻合(圖2)，并將重組子送奧科生物公司測序驗證正確。將構(gòu)建正確的包含 HvABA8’ OH-I基因片段的RNAi載體命名為pABA8’ OH-I。4.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻及轉(zhuǎn)基因植株鑒定采用電擊法將載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1，并用來轉(zhuǎn)化420粒粳稻品種‘日本晴’成 熟種子胚愈傷組織，獲得再生植株52株，移栽成活50株。以總DNA為模板，通過PCR鑒定 轉(zhuǎn)基因植株中的潮霉素抗性基因，結(jié)果表明8株為水稻陽性植株。種子萌發(fā)實驗通過轉(zhuǎn)基因水稻Fl種子的發(fā)芽試驗，篩選獲得4個發(fā)芽率明顯低于對照的轉(zhuǎn)基因 水稻株系，初步表明通過人工構(gòu)建載體誘導(dǎo)的RNAi來增強種子胚休眠性，從而提高種子抗 穗發(fā)芽能力是有可能實現(xiàn)的。序列表1 :HvABA8，OH-I基因全序列ATGGGTGCCTTCATCCTCCTCCTCTGCTTGCTCGTGCCGTTGGTGCTCGTGTGCGCCGTCCGCGCCAGG AAGGGCGCCGGCGGGCGGTCGTCGTCGGGCGGCGGCAAGAAGGGCAGGCTGCCGCCGGGGTCCATGGGGTGGCCGTA CGTGGGCGAGACCACGCAGCTCTACTCCTCCAAGAACCCCAACGTCTTCTTCGCCAGGAAGCGTAACAAGTACGGGC CCATCTTCAAGACGCACATCCTCGGGTGCCCCTGCGTCATGGTGTCCAGCCCGGAGGCCGCCAAGTTCGTGCTCGTC ACGCAGGCGCACCTCTTCAAGCCTACCTTCCCGGCCAGCAAGGAGCGGATGCTGGGCCGCCAGGCCATCTTCTTCCA GCAGGGGGACTACCACACCCACCTCCGCCGTCTCGTCTCCCGCGCCTTCTCCCCCGAGGCCATCCGCGGCTCCGTTT CCTCCATCGAGGCCATCGCCCTCCGCTCCCTCGGCTCATGGGAAGGCCATGAAGTCAACACCTTCCAAGAAATGAAG ACTTACGCTCTGAATGTGGCATTGCTGTCCATCTTCGGGGAGGAGGAGATGCAGTACATCGAGGAGCTGAAGCAGTG CTACCTGACGCTGGAGAAGGGGTACAACTCGATGCCGGTGAACCTGCCGGGCACGCTGTTCCACAAGGCCATGAAGG CCCGGAAGCGGCTGGGCGCCATTGTGGCCCACATCATCTCAGCCCGGCGCGAGCGGGAGCGCGGGAGCGACCTCCTG GGCTCCTTCATGGACGGCCGCGAGGCGCTCACCGACGACCAGATCGCCGACAACGCCATCGGCGTCATCTTCGCCGC GCGGGACACCACCGCCAGCGTGCTCACGTGGATGGTCAAGTTCCTCGGCGACAACCCCGCCGTCCTCAAAGCCGTCA CCGAAGAGCACGCCGAGATCGCGAGGGAGAAGGCGTTGTCCGGCGAGCCGCTGTCGTGGGCCGACACGCGGCGGATGCGGGTGACGGGCCGGGTGATCCAGGAGACGATGCGGGTGGCGTCCATCCTCTCCTTCACCTTCAGAGAGGCCGTCGA GGACGTGGAGTACCAAGGGTACCTGATCCCCAAGGGCTGGAAAGTGCTTCCCCTGTTCCGGAACATCCACCACAACC CCGACCACTTCCCCTCCCCCGAAAAGTTCGATCCTTCACGATTCGAGGTGGCCCCCAAGCCCAACACGTTCATGCCG TTCGGGAACGGGACCCACTCGTGCCCCGGCAACGAGCTGGCCAAGCTGGAGATGCTCGTCCTCTGCCACCACCTCGC CACCAAGTACAGATGGTCTACCTCCAAGTCCGAGAGCGGCGTGCAGTTCGGCCCCTTCGCCCTGCCCATCAACGGCC TCCCCATGACCTTCACCCGCAAGGCCTGASEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院成都生物研究所<120>ABA8’羥化酶基因的RNAi植物表達(dá)載體及用途<130> 說明書<160>9<170> PatentIn version 3. 3<210>1<211>32<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>1aaggagctca gctagtatag ctatctaggg tg 32<210>2<211>31<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>2aaggcggccg ctagcggtgg cgtttgggtg g 31<210>3<211>27<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>3aagctcgagg atcgttcaaa catttgg27<210>4<211>27<212>DNA<213>Hordeum bogdanii<400>4aagggtaccg taacatagat gacaccg27<210>5<211>31<212>DNA<213>Hordeum bogdanii0076
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0101]atgggtgccttcatcctcctcctctgcttgctcgtgccgttggtgctcgtgtgcgccgtc600102]cgcgccaggaagggcgccggcgggcggtcgtcgtcgggcggcggcaagaagggcaggctg1200103]CCgCCggggtccatggggtggccgtacgtgggcgagaccacgcagctctactcctccaag1800104]aaccccaacgtcttcttcgccaggaagcgtaacaagtacgggcccatcttcaagacgcac2400105]atcctcgggtgcccctgcgtcatggtgtccagcccggaggccgccaagttcgtgctcgtc3000106]acgcaggcgcacctcttcaagcctaccttcccggccagcaaggagcggatgctgggccgc3600107]caggccatcttcttccagcagggggactaccacacccacctccgccgtctcgtctcccgc4200108]gccttctcccccgaggccatccgcggctccgtttcctccatcgaggccatcgccctccgc4800109]tccctcggctcatgggaaggccatgaagtcaacaccttccaagaaatgaagacttacgct5400110]ctgaatgtggcattgctgtccatcttcggggaggaggagatgcagtacatcgaggagctg6000111]aagcagtgctacctgacgctggagaaggggtacaactcgatgccggtgaacctgccgggc6600112]acgctgttccacaaggccatgaaggcccggaagcggctgggcgccattgtggcccacatc7200113]atctcagcccggcgcgagcgggagcgcgggagcgacctcctgggctccttcatggacggc7800114]cgcgaggcgctcaccgacga ccagatcgccgacaacgccatcggcgtcatcttcgccgcg840
8
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acctccaagtccgagagcggcgtgcagttcggccccttcg ccctgcccatcaacggcctc1380
cccatgaccttcacccgcaaggcctga140權(quán)利要求
一種基于大麥ABA 8’-羥化酶基因HvABA8’OH-1序列的發(fā)卡RNA表達(dá)盒，其特征在于含有來自序列表1的5′端第1006位核苷酸序列按照序列1的核苷酸排列方式向3′端延長，長度為293bp的反向重復(fù)脫氧核苷酸片段。
2.一種大麥ABA 8’ -羥化酶基因的RNAi植物表達(dá)載體，包括抗生素抗性選擇標(biāo)記基 因，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的大麥ABA 8’ -羥化酶基因的發(fā)卡RNA表達(dá)盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種大麥ABA8’ -羥化酶基因的RNAi植物表達(dá)載體，其特 征在于所述的抗生素抗性選擇標(biāo)記基因為潮霉素抗性基因hpt。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的大麥ABA8，-羥化酶基因的RNAi植物表達(dá)載體， 其特征在于所述載體能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA分子，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì) 胞產(chǎn)生RNAi。
5.含有權(quán)利要求1所述大麥ABA8’-羥化酶基因的發(fā)卡RNA表達(dá)盒的重組表達(dá)載體、 工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求1所述的大麥ABA8’ -羥化酶基因的發(fā)卡RNA表達(dá)盒在培育抗穗發(fā)芽植 物中的用途。
7.權(quán)利要求2或3或5所述的大麥ABA8，-羥化酶基因的發(fā)卡RNA表達(dá)盒在培育抗 穗發(fā)芽植物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于大麥ABA 8′-羥化酶基因(HvABA8 OH-1)序列的發(fā)卡RNA表達(dá)盒、RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明大麥ABA 8′-羥化酶基因的發(fā)卡RNA表達(dá)盒、RNAi植物表達(dá)載體含有來自序列表1的5′端第1006位核苷酸序列按照序列1的核苷酸排列方式向3′端延長，長度為293bp的反向重復(fù)脫氧核苷酸片段，能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA分子，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生RNAi降低內(nèi)源ABA代謝水平，從而增強轉(zhuǎn)基因植物種子休眠性。本發(fā)明的載體在培育抗穗發(fā)芽轉(zhuǎn)基因作物新品種方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/00GK101880667SQ201010301188
公開日2010年11月10日 申請日期2010年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月4日
發(fā)明者劉春明, 鄭寒, 陳靜 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所