專利名稱：：一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
：多年來(lái)，許多育種工作者試圖采用傳統(tǒng)的育種手段來(lái)獲得油菜良種，但進(jìn)展十分緩慢。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們愈來(lái)愈傾向于通過(guò)基因工程的手段改良油菜的產(chǎn)量、品質(zhì)及抗逆性。目前應(yīng)用于油菜的轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法、基因槍方法、化學(xué)方法(如利用聚乙二醇)和物理方法(如利用電導(dǎo)入法)。其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法因其簡(jiǎn)單、有效而得到廣泛應(yīng)用。采用該方法在油菜中已經(jīng)建立了基于組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體系，但該轉(zhuǎn)化過(guò)程比較復(fù)雜，涉及無(wú)菌苗的培養(yǎng)、外植體的切取、浸染、愈傷誘導(dǎo)、分化、生根、移栽等，因而油菜再生頻率受到外植體類型、基因型、激素、外植體生理狀態(tài)等多種因素的影響，使得油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率較低。近年發(fā)展了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的floral-dip轉(zhuǎn)化方法，該方法省去了組織培養(yǎng)的繁瑣步驟，克服了植株再生的困難，可直接獲得轉(zhuǎn)化種子，因而具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。但是油菜的不同發(fā)育時(shí)期、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液組成成分、浸染次數(shù)、浸染時(shí)間等都在不同程度上影響油菜的轉(zhuǎn)化效率。因此，優(yōu)化floral-dip轉(zhuǎn)化方法的方案是進(jìn)一步提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵。徐光碩等(見參考文獻(xiàn))用inplanta法處理5個(gè)甘藍(lán)型油菜品種，獲得了轉(zhuǎn)基因油菜植株，平均轉(zhuǎn)化效率為O.1%左右，且各甘藍(lán)型油菜品種間的轉(zhuǎn)化率無(wú)明顯差異。其技術(shù)方案如下(1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)吸取甘油冷凍保存的含有目的基因的農(nóng)桿菌100iiL，接種于10mL新鮮的LB(1%蛋白胨，O.5%酵母提取物，1%NaCl，pH7.0)培養(yǎng)基中，在28。C左右150r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。吸取上述培養(yǎng)物10mL接種于1L含有合適濃度抗生素的5%蔗糖培養(yǎng)液中，在28t:左右150r/min振蕩培養(yǎng)24h以上，直至0D66。=5。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液配置①將上述0D66。=1-1.5的農(nóng)桿菌懸浮液在8000Xg下離心8min，沉淀后的農(nóng)桿菌用1L新鮮的LB培養(yǎng)基重新懸浮。②將培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌懸浮液離心后重新懸浮于浸染液(5%蔗糖，0.02%Silwet-77)中。(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液浸染油菜花序①轉(zhuǎn)化時(shí)期及轉(zhuǎn)化前預(yù)處理在油菜大田中選擇花上沒(méi)有露水和泥土的植株，然后選擇那些有花即將開放的分枝，剪去分枝上已經(jīng)開放的花。②浸染時(shí)間將枝條彎曲，使整個(gè)花序浸泡在盛有菌液的燒杯中，上下?lián)u動(dòng)lmin左右。③浸染次數(shù)及間隔時(shí)間整個(gè)過(guò)程自第一次浸染后每天或隔天進(jìn)行一次，共1015次。④浸染后植株的管理在確保所有花都已被浸染后，用硫酸鈉紙袋將處理過(guò)的花序套住。于終花期將花序上的紙袋取下，管理好植株。待種子成熟時(shí)，將經(jīng)過(guò)inplanta處理過(guò)的分枝剪下單獨(dú)收獲種子，曬干后脫粒儲(chǔ)藏。(3)轉(zhuǎn)基因植株的篩選在經(jīng)過(guò)inplanta處理的種子中選擇較飽滿者，用0.1%的升汞浸泡1215min，然后經(jīng)無(wú)菌水清洗3次后，均勻播撒于含有卡那霉素(270mg丄—0的MS固體培養(yǎng)基上。將存活下來(lái)的幼苗移栽至營(yíng)養(yǎng)缽，經(jīng)DNA檢測(cè)確信外源基因的存在后移至土壤中。從上述技術(shù)方案來(lái)看，存在如下缺點(diǎn)(1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)是采用液體培養(yǎng)，需要經(jīng)過(guò)離心和重新懸浮菌體，操作麻煩。(2)配置農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液的轉(zhuǎn)化液為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基或者為含5%蔗糖和0.02%Silwet-77的溶液，因?qū)ㄓ袚p害而降低外源基因進(jìn)入植物基因組中的頻率。(3)用轉(zhuǎn)化菌液浸泡花序的時(shí)間為1分鐘，時(shí)間太長(zhǎng)，對(duì)花損傷重。(4)浸染同一花序的次數(shù)太多，并且間隔時(shí)間短，對(duì)花損傷重。(5)于終花期將花序上的紙袋取下，可能因套袋時(shí)間太長(zhǎng)，使果莢因缺乏光照而生長(zhǎng)不良，影響種子的質(zhì)量?？傊捎谠摲椒ù嬖谏鲜鋈秉c(diǎn)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率低，僅為0.1%(見表1)。表linplanta轉(zhuǎn)化方法在各油菜品種中的轉(zhuǎn)化效率TablelThefrequenceoftransformantsindifferentcultivarsofrapeseedbyinplantamethod<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>付紹紅等(見參考文獻(xiàn))用floral-dip法處理甘藍(lán)型油菜，主要是研究表面活性劑Silwet-77對(duì)floral-dip轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜效果的影響，獲得了抗性植株，認(rèn)為0.05%的表面活性劑Silwet-77對(duì)floral-dip轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜最為有利。其技術(shù)方案如下[OO32](1)農(nóng)桿菌培養(yǎng)農(nóng)桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基蛋白胨10g/L，酵母提取物10g/L，NaCl5g/L。溶質(zhì)完全溶解后用Na0H調(diào)節(jié)pH至7.O，定容至1L(固體培養(yǎng)基含1.5%瓊脂)，用接種環(huán)接觸穿剌的培養(yǎng)基畫線接種。放在2『C黑暗條件下培養(yǎng)3天。挖一塊穿剌物的瓊脂，接種于含合適濃度抗生素的YEP液體培養(yǎng)基上，于28振蕩培養(yǎng)1-2天，再取25ml放入500mlYEB(含合適濃度抗生素)中，搖菌24小時(shí)以上(0D6。。在1.8-2.0)。[OO34](2)轉(zhuǎn)化菌液配置4000rmp離心15min(室溫)，用2倍體積(1L)轉(zhuǎn)化液(MS基本培養(yǎng)基+6BAP(0.01ng/L)+蔗糖5%+0.05%Silwet-77;pH5.8)溶解，混勻后準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化。(3)農(nóng)桿菌菌液浸染油菜花序①轉(zhuǎn)化時(shí)期及轉(zhuǎn)化前預(yù)處理選擇初花期的甘藍(lán)型油菜植株處理，前1天田間澆透水。去除主花序和每個(gè)分枝花序的頂端花蕾，同時(shí)除去已開放的花朵，只保留快要開放的花蕾。②浸染次數(shù)及間隔時(shí)間同一花序連續(xù)浸染3次，間隔時(shí)間為1天。③浸染后植株的管理浸染完后套上紙袋。最后一次浸染處理24小時(shí)后除去紙袋直至收獲種子。(4)轉(zhuǎn)基因植株的篩選對(duì)浸染處理后獲得的1\代種子經(jīng)75%酒精表面消毒30秒，O.1%HgC12消毒10分鐘，鋪在預(yù)先倒好的篩選培養(yǎng)基(預(yù)先確定好最佳濃度培養(yǎng)基)平板上，經(jīng)7-15天篩選培養(yǎng)，將正常生長(zhǎng)的綠色苗進(jìn)行第2次抗性篩選(7-15天)，將第2次篩選后的抗性植株進(jìn)行第3次抗性篩選(7-15天)，第2次，第3次篩選培養(yǎng)基為Ms+Km(150mg/L)。從上述技術(shù)方案來(lái)看，存在如下缺點(diǎn)(1)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)是采用液體培養(yǎng)，需要經(jīng)過(guò)離心和重新懸浮菌體，操作麻煩。(2)配置農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液的轉(zhuǎn)化液為MS基本培養(yǎng)基+6BAP(0.01ng/L)+蔗糖5%+0.05%Silwet-77;pH5.8，沒(méi)有添加促進(jìn)外源基因進(jìn)入植物基因組中的物質(zhì)，因此在一定程度上影響轉(zhuǎn)化效率。(3)菌液浸泡花序的時(shí)間不明確，浸泡時(shí)間長(zhǎng)短也會(huì)影響到轉(zhuǎn)化效率。(4)浸染同一花序的間隔時(shí)間太短，這對(duì)花有損害。(5)最后一次浸染處理24小時(shí)后就除去紙袋，套袋時(shí)間太短，不利于保持農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化活性?？傊捎谠摲椒ù嬖谏鲜鋈秉c(diǎn)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率較低，僅為2.03%。參考文獻(xiàn)[1]徐光碩，饒勇強(qiáng)，陳雁，張椿雨，孟金陵.用inplanta方法轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜.作物學(xué)報(bào)，2004，1:1-5.[2]付紹紅，牛應(yīng)澤，楊洪全，韋獻(xiàn)雅.表面活性劑silwetL-77對(duì)floral-dip轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜效果的影響.分子植物育種，2004，2(5):661-666.
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率高的適用于構(gòu)建油菜突變體庫(kù)的轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明主要是從農(nóng)桿菌培養(yǎng)、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液配置、重復(fù)浸染間隔時(shí)間、浸染時(shí)間、及浸染后植株的管理入手，通過(guò)優(yōu)化農(nóng)桿菌介導(dǎo)的floral-dip轉(zhuǎn)化方法方案，提出一種高效的適用于油菜突變體庫(kù)構(gòu)建的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法。具體技術(shù)方案如下[OO57](1)農(nóng)桿菌培養(yǎng)5將含有pSKI015質(zhì)粒和pMP90RK輔助質(zhì)?；蛘吆衟EGAD質(zhì)粒的GV3101菌株進(jìn)行活化和抗生素篩選培養(yǎng)。對(duì)陽(yáng)性克隆的農(nóng)桿菌菌液，按1:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液涂布新鮮的含抗生素的YEB固體平板上(100X20mm)，28。C下培養(yǎng)2-3天。[OOSO](2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液配置首先配置1/2MS液體培養(yǎng)基，然后在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其終濃度分別為5%、0.05%-0.1%、0.2%-0.4%和0.001%。-0.002%。，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.7_5.8。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液組成成分中乙酰丁香酮的作用原理，是其可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進(jìn)外源基因整合到植物基因組中。因此，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中配置一定濃度的乙酰丁香酮有利于提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率。(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液配置用轉(zhuǎn)化液將培養(yǎng)在固體平板上的農(nóng)桿菌洗脫下來(lái)，每個(gè)固體平板上(100X20mm)的農(nóng)桿菌大概需要150ml轉(zhuǎn)化液洗脫，洗脫下來(lái)的農(nóng)桿菌需要充分懸浮，然后用分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)化菌液的OD值，并用轉(zhuǎn)化液將轉(zhuǎn)化菌液0D6。。的值調(diào)至0.6-0.8。(4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液浸染油菜花序①最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期及轉(zhuǎn)化前預(yù)處理將油菜播種在大田，當(dāng)油菜的主枝和部分側(cè)枝現(xiàn)蕾并有幾朵小花開放時(shí)，去除主花序和每個(gè)分枝花序已開放的花朵，只剩下花蕾。處于最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期的油菜見圖3。②浸染時(shí)間將轉(zhuǎn)化菌液(400-500ml)裝入塑料袋(35X25cm)中，并將去掉已開放花的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑料袋，讓轉(zhuǎn)化菌液充分浸泡花序，時(shí)間為30秒，浸泡后的花序立即用羊皮紙袋(40X18cm)包扎(圖4)。400-500ml的轉(zhuǎn)化菌液可浸染6_8株油菜。③浸染次數(shù)及間隔時(shí)間同一花序連續(xù)浸染3次，間隔時(shí)間為2-3天。花序頂端出現(xiàn)新的快開放花蕾的時(shí)間大約為2-3天，因而間隔2-3天時(shí)重復(fù)浸染可使受浸染的花蕾數(shù)增加。④浸染后植株的管理浸染完后套上羊皮紙袋(圖4)。在完成最后一次轉(zhuǎn)化的7-10天后，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾(圖4)。待種子成熟后，收獲曬干，即得Tl代種子。(5)轉(zhuǎn)基因植株的篩選將獲得的T1代種子播種于大田，在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔2-3天噴施一次，連續(xù)噴4-5次，在完成最后一次噴施的10-15天后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率(圖5)。本發(fā)明的油菜轉(zhuǎn)化效率達(dá)2.5%-3.8%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)(1)本發(fā)明農(nóng)桿菌的培養(yǎng)采用固體平板培養(yǎng)，簡(jiǎn)化了農(nóng)桿菌菌體收集過(guò)程，因此也避免了液體培養(yǎng)的農(nóng)桿菌因離心、懸浮等操作過(guò)程而降低農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化活力。(2)與液體培養(yǎng)相比，農(nóng)桿菌采用固體平板培養(yǎng)可以節(jié)約成本，尤其在大規(guī)模轉(zhuǎn)化時(shí)更加體現(xiàn)了該方法的優(yōu)越性。例如配置500ml的轉(zhuǎn)化菌液，如果農(nóng)桿菌采用液體培養(yǎng)，至少需要500ml液體培養(yǎng)基；如果采用固體培養(yǎng)，只需要液體培養(yǎng)基80ml和瓊脂1.2g，用于準(zhǔn)備4個(gè)固體平板。由此可見，配置相同體積的轉(zhuǎn)化菌液，采用固體平板培養(yǎng)農(nóng)桿菌所需的成本可降低約4倍。(3)本發(fā)明在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液組成成分中加入乙酰丁香酮，并找到了加入的合適濃度，通過(guò)促進(jìn)外源基因整合到植物基因組中，而提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率。(4)本發(fā)明在完成最后一次轉(zhuǎn)化后，需套紙袋7-10天保濕，有利于保持農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化活力和浸染后花的復(fù)蘇。(5)本發(fā)明在完成最后一次轉(zhuǎn)化的7-10天后，摘除花序上的羊皮紙袋有利于油菜果莢的生長(zhǎng)，提高種子質(zhì)量。(6)在完成最后一次轉(zhuǎn)化的7-10天后，摘除花序頂端的花及花蕾，可以減少篩選時(shí)的工作量，并進(jìn)一步提高油菜轉(zhuǎn)化效率。這主要是由于油菜的花序?yàn)闊o(wú)限花序，7-10天后新長(zhǎng)出的花蕾是沒(méi)有被轉(zhuǎn)化的，因此需要去除。(7)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化效率達(dá)2.5%-3.8%，適用于建立油菜突變體庫(kù)。圖1為激活標(biāo)記質(zhì)粒pSKI015圖譜質(zhì)粒T-DNA上帶有除草劑抗性標(biāo)記基因BASTA和4個(gè)35S增強(qiáng)子(4X35Se);LB:T-DNA左邊界；RB:T-DNA右邊界。圖2為pEGAD質(zhì)粒T-DNA表達(dá)框35S:CaMV35S啟動(dòng)子；AtGA2ox8:目的基因AtGA2ox8;BastaR:除草劑抗性標(biāo)記基因；EGFP:—種產(chǎn)生較強(qiáng)熒光的突變性綠色熒光蛋白。圖3為處于最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期的油菜植株照片。圖4為轉(zhuǎn)化菌液浸染油菜花序過(guò)程；A:開花后5天的油菜花序；B:用轉(zhuǎn)化菌液浸泡花序；C:浸染后將花序用羊皮紙袋套上保濕；D:7-10天后取掉紙袋。圖5為轉(zhuǎn)基因植株的篩選A:沒(méi)有噴施除草劑Basta的1\代幼苗；B:噴施除草劑Basta后存活的1\代幼苗(抗Basta的轉(zhuǎn)基因植株)。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1:(1)油菜種植油菜品種1244怖為半冬性中熟甘藍(lán)型油菜(B.napus，染色體組AACC，2n=38)。其主要特點(diǎn)是分枝性強(qiáng)，枝葉繁茂，細(xì)根較發(fā)達(dá)；耐寒、耐濕、耐肥，抗霜霉病、菌核病和病毒病能力強(qiáng)；花瓣大，花黃色，角果較長(zhǎng)，結(jié)莢多，籽粒飽滿；種子含油量較高，一般為35%50%。生長(zhǎng)期約227天，產(chǎn)量約340-350斤/畝。將油菜種子于9月15日播種于苗床育苗，苗床的土壤應(yīng)肥沃且濕潤(rùn)。大約一個(gè)月以后，幼苗長(zhǎng)出3-4片真葉，此時(shí)將幼苗移植到大田。大田的廂寬2米，行距0.4米，株距0.3米，廂與廂之間的溝距0.3米，溝深0.2米。種植5000株油菜，占地面積大約為200平方米。油菜肥水管理按常規(guī)方法進(jìn)行，次年春天(3月上旬)開花。此時(shí)，選擇最佳時(shí)期進(jìn)行油菜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。圖3為處于最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期的油菜植株。(2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)pSKI015質(zhì)粒圖譜見圖1，該質(zhì)粒帶有除草劑抗性標(biāo)記基因BASTA和4個(gè)35S增強(qiáng)子(4X35Se)。本發(fā)明用該質(zhì)粒的目的有兩個(gè)一是解決目前限制油菜突變體庫(kù)建立的轉(zhuǎn)基因技術(shù)瓶頸問(wèn)題；二是利用本發(fā)明建立油菜激活標(biāo)記突變體庫(kù)。將保存于-80。C的含有pSKI015質(zhì)粒的GV3101(含pMP90RK輔助質(zhì)粒)菌株進(jìn)行活化，劃線培養(yǎng)在含抗生素利福平、卡那霉素、羧芐青霉素和慶大霉素的YEB固體平板上(100X20mm)，抗生素終濃度分別為50mg.L—\50mg.L—\50mg.L-1和25mg.L—、28。C下培養(yǎng)2-3d，然后挑取單菌落于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR檢測(cè)。這主要是由于含有pSKI015質(zhì)粒的農(nóng)桿菌如果于-S(TC儲(chǔ)存太久，會(huì)影響pSKI015質(zhì)粒中的CaMV35S增強(qiáng)子重復(fù)序列的穩(wěn)定性，因此在轉(zhuǎn)化前需檢測(cè)該重復(fù)序列是否存在于農(nóng)桿菌中。檢測(cè)引物為T7，5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，或M13(-20)，5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3，與IK007，5，-CCCGCCAATATATCCTG-3，。對(duì)陽(yáng)性克隆的農(nóng)桿菌菌液，按1:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液涂布新鮮的含抗生素的YEB固體平板(100X20mm)上，28。C下培養(yǎng)2_3d。YEB固體培養(yǎng)基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白胨5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、瓊脂粉1.5%，pH7.2。YEB液體培養(yǎng)基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白胨5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、pH7.2。[cmo](3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液配置首先配置1/2MS液體培養(yǎng)基，然后在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其終濃度分別為5%、0.05%、0.4%和0.002%。，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.8。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液組成成分中乙酰丁香酮的作用原理，是其可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進(jìn)外源基因整合到植物基因組中。因此，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中配置一定濃度的乙酰丁香酮有利于提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率。[O112](4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液配置用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液將培養(yǎng)在固體平板上的農(nóng)桿菌洗脫下來(lái)，每個(gè)固體平板上(100X20mm)的農(nóng)桿菌大概需要150ml轉(zhuǎn)化液洗脫，洗脫下來(lái)的農(nóng)桿菌需要充分懸浮，然后用分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)化菌液的OD值，并用轉(zhuǎn)化液將轉(zhuǎn)化菌液0D6。。的值調(diào)至0.8。(5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液浸染油菜花序①最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期的選擇及轉(zhuǎn)化前預(yù)處理次年春天(3月上旬)，油菜進(jìn)入初花期。此時(shí)，選擇主枝和部分側(cè)枝現(xiàn)蕾并有幾朵小花開放的油菜植株，去除主花序和每個(gè)分枝花序已開放的花朵，剩下快開放的花蕾和花序頂端花蕾。圖3為處于最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期的油菜植株。②確定浸染時(shí)間于上午8時(shí)開始進(jìn)行浸染，避免在中午紫外線較強(qiáng)時(shí)進(jìn)行浸染。浸染時(shí)，將轉(zhuǎn)化菌液(400-500ml)裝入塑料袋(35X25cm)中，并將去掉已開放花的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑料袋，讓轉(zhuǎn)化菌液充分浸泡花序，時(shí)間為30秒，浸泡后的花序立即用羊皮紙袋(40X18cm)包扎(圖4)。400_500ml的轉(zhuǎn)化菌液可浸染6-8株油菜。③浸染次數(shù)及間隔時(shí)間同一花序連續(xù)浸染3次，間隔時(shí)間為2-3天?；ㄐ蝽敹顺霈F(xiàn)新的快開放花蕾的時(shí)間大約為2-3天，因而間隔2-3天時(shí)重復(fù)浸染可使受浸染的花蕾數(shù)增加。④浸染后植株的管理浸染完后套上羊皮紙袋(圖4)。在完成最后一次轉(zhuǎn)化的7天后，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾(圖4)。待種子成熟后，收獲曬干，即得1\代種子。(6)轉(zhuǎn)基因植株的篩選將獲得的1\代種子播種于大田，在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔2-3天噴施一次，連續(xù)噴4-5次，在完成最后噴施的10-15天后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率(圖5)。本發(fā)明的油菜轉(zhuǎn)化效率達(dá)3.8%。實(shí)施例2:(1)油菜種植油菜品種N529為半冬性中熟甘藍(lán)型油菜(B.n即us，染色體組AACC，2n=38)。將油菜種子于9月15日播種于苗床育苗，苗床的土壤應(yīng)肥沃且濕潤(rùn)。大約一個(gè)月以后，幼苗長(zhǎng)出3-4片真葉，此時(shí)將幼苗移植到大田。大田的廂寬2米，行距0.4米，株距0.3米，廂與廂之間的溝距0.3米，溝深0.2米。種植5000株油菜，占地面積大約為200平方米。油菜肥水管理按常規(guī)方法進(jìn)行，次年春天(3月上旬)開花。此時(shí)，選擇最佳時(shí)期進(jìn)行油菜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。(2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)pEGAD質(zhì)粒的T-DNA圖譜見圖2。該T-DNA序列中帶有目的基因、除草劑抗性標(biāo)記基因BASTA和突變性綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因，這些基因都由CaMV35S啟動(dòng)子(35S)驅(qū)動(dòng)表達(dá)。將保存于-S(TC的含有pEGAD質(zhì)粒的GV3101菌株進(jìn)行活化，劃線培養(yǎng)在含抗生素利福平、卡那霉素和慶大霉素的YEB固體平板上(100X20mm)，抗生素終濃度分別為50mg.L入50mg.L—1和25mg.L—、28。C下培養(yǎng)2_3d，然后挑取單菌落于含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。將農(nóng)桿菌菌液按l:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液涂布新鮮的含抗生素的YEB固體平板(100X20mm)上，28。C下培養(yǎng)2_3d。YEB固體培養(yǎng)基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白胨5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、瓊脂粉1.5%，pH7.2。YEB液體培養(yǎng)基的組成成分為酵母提取物lg.L—、蛋白胨5g.L—、蔗糖5g.L—、MgS04.7H200.5g.L—、pH7.2。(3)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液配置首先配置1/2MS液體培養(yǎng)基，然后在溶液中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其終濃度分別為5%、0.05%、0.4%和0.002%。，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.8。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液組成成分中乙酰丁香酮的作用原理，是其可誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的活化，從而促進(jìn)外源基因整合到植物基因組中。因此，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液中配置一定濃度的乙酰丁香酮有利于提高油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率。(4)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液配置用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化液將培養(yǎng)在固體平板上的農(nóng)桿菌洗脫下來(lái)，每個(gè)固體平板上(100X20mm)的農(nóng)桿菌大概需要150ml轉(zhuǎn)化液洗脫，洗脫下來(lái)的農(nóng)桿菌需要充分懸浮，然后用分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)化菌液的OD值，并用轉(zhuǎn)化液將轉(zhuǎn)化菌液0D6。。的值調(diào)至0.8。(5)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液浸染油菜花序①最佳轉(zhuǎn)化時(shí)期的選擇及轉(zhuǎn)化前預(yù)處理次年春天(3月上旬)，油菜進(jìn)入初花期。此時(shí)，選擇主枝和部分側(cè)枝現(xiàn)蕾并有幾朵小花開放的油菜植株，去除主花序和每個(gè)分枝花序已開放的花朵，剩下快開放的花蕾和花序頂端花蕾。②確定浸染時(shí)間于上午8時(shí)開始進(jìn)行浸染，避免在中午紫外線較強(qiáng)時(shí)進(jìn)行浸染。浸染時(shí)，將轉(zhuǎn)化菌液(400-500ml)裝入塑料袋(35X25cm)中，并將去掉已開放花的油菜花序抓成一束，輕輕伸入塑料袋，讓轉(zhuǎn)化菌液充分浸泡花序，時(shí)間為30秒，浸泡后的花序立即用羊皮紙袋(40X18cm)包扎。400-500ml的轉(zhuǎn)化菌液可浸染6_8株油菜。③浸染次數(shù)及間隔時(shí)間同一花序連續(xù)浸染3次，間隔時(shí)間為2-3天?；ㄐ蝽敹顺霈F(xiàn)新的快開放花蕾的時(shí)間大約為2-3天，因而間隔2-3天時(shí)重復(fù)浸染可使受浸染的花蕾數(shù)增加。④浸染后植株的管理浸染完后套上羊皮紙袋。在完成最后一次浸染的IO天后，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾。待種子成熟后，收獲曬干，即得1\代種子。(6)轉(zhuǎn)基因植株的篩選將獲得的1\代種子播種于大田，在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔2-3天噴施一次，連續(xù)噴4-5次，在完成最后噴施的10-15天后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明的油菜轉(zhuǎn)化效率達(dá)2.5%。權(quán)利要求一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，包括以下步驟(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液配置將活化的陽(yáng)性克隆農(nóng)桿菌菌液，稀釋涂布在YEB固體平板上培養(yǎng)；在1/2MS液體培養(yǎng)基中依次加入蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP，使其質(zhì)量終濃度分別為5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰，最后用NaOH調(diào)節(jié)pH值為5.7-5.8；配置成轉(zhuǎn)化液；用配置的轉(zhuǎn)化液將固體平板上的農(nóng)桿菌洗脫下來(lái)，并繼續(xù)用轉(zhuǎn)化液將洗脫的轉(zhuǎn)化菌液OD500的值調(diào)至0.6-0.8；(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化菌液浸染油菜花序①轉(zhuǎn)化前預(yù)處理當(dāng)油菜的主枝和部分側(cè)枝出現(xiàn)花蕾并有幾朵小花開放時(shí)，去除主花序和每個(gè)分枝花序已開放的花朵，只剩下花蕾；②浸染將①步中經(jīng)過(guò)預(yù)處理的油菜花序抓成一束，輕輕伸入轉(zhuǎn)化菌液中充分浸泡花序，時(shí)間為30秒，浸泡后的花序立即用羊皮紙袋包扎；400-500ml的轉(zhuǎn)化菌液浸染6-8株油菜；同一花序連續(xù)浸染3次，間隔時(shí)間為2-3天；(3)浸染后植株的管理在完成最后一次轉(zhuǎn)化的7-10天后，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾；待種子成熟后，收獲曬干，即得T1代種子；(4)轉(zhuǎn)基因植株的篩選將獲得的T1代種子播種，通過(guò)噴施除草劑抗性選擇標(biāo)記篩選。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(1)所述的農(nóng)桿菌菌株是含有pSKI015質(zhì)粒和pMP90RK輔助質(zhì)?；蚝衟EGAD質(zhì)粒的GV3101菌株。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(1)所述的YEB固體平板培養(yǎng)是將陽(yáng)性克隆的農(nóng)桿菌菌液按1:100的比例稀釋，取200iU稀釋菌液涂布含抗生素的100X20mmYEB固體平板上，28。C下培養(yǎng)23天。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(1)所述的洗脫過(guò)程中每個(gè)100X20mm固體平板上的農(nóng)桿菌用150ml轉(zhuǎn)化液洗脫，洗脫下來(lái)的農(nóng)桿菌充分懸浮。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(2)中浸染時(shí)，轉(zhuǎn)化菌液裝在規(guī)格為35X25cm塑料袋中。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(3)中羊皮紙袋規(guī)格為40X18cm。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于，步驟(4)中所述的抗性篩選具體是在幼苗期按1:800(V/V)噴施除草劑Basta，每隔23天噴施一次，連續(xù)噴4-5次。全文摘要本發(fā)明公開了一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜大田轉(zhuǎn)基因方法。用蔗糖、Silwet-77、乙酰丁香酮和6-BAP濃度分別為5％、0.05％-0.1％、0.2％-0.4％和0.001‰-0.002‰的1/2MS液體培養(yǎng)基洗脫YEB固體平板上的農(nóng)桿菌；轉(zhuǎn)化前當(dāng)油菜的主枝和部分側(cè)枝出現(xiàn)花蕾并有幾朵小花開放時(shí)，去除主花序和每個(gè)分枝花序已開放的花朵，只剩下花蕾；將花序在洗脫的轉(zhuǎn)化菌液中浸泡30秒后立即包扎；同一花序連續(xù)浸染3次，間隔2-3天；轉(zhuǎn)化后的7-10天，摘除花序上的羊皮紙袋和花序頂端的花及花蕾。該方法操作簡(jiǎn)單，所需成本降低，轉(zhuǎn)基因效率高，無(wú)基因型依賴性，在利用基因工程手段培育油菜新品種和油菜突變體庫(kù)建立方面都具有很好的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12N15/84GK101748148SQ20101030090公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2010年1月28日優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日發(fā)明者劉選明,唐冬英,廖紅東,林建中,林辰濤,趙小英申請(qǐng)人:湖南大學(xué)