專利名稱：一種類鈣調(diào)磷酸酶b亞基蛋白基因及其編碼蛋白質(zhì)和該基因的克隆的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體說是涉及在薔薇科植物中表達的類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白基因及其編碼的蛋白質(zhì)和該基因的克隆。
背景技術：
植物在生長發(fā)育過程中不可避免會遭受生物和非生物脅迫因子的影響，從而導 致細胞和分子的顯著變化。高鹽、水分虧缺、淹水、高低溫等極端條件會破壞植物的生命 周期，甚至影響其生存。而植物具有特殊的應對機制，通過在這些不利條件下改變自身 的分子、細胞和生理活動來適應逆境而生存(Yamaguchi-Shinozaki K. and ShinozakiK. Transcriptional regulatory networks in cellular responses and tolerance to dehydrationand cold stress. Annual Review of Plant Biology, 2006,57 :781_803)。 Ca2+作為最基本的第二信使，幾乎介導了植物生長、發(fā)育和逆境脅迫應答的所有過程。機 械刺激、低溫、紅光、植物激素、真菌激發(fā)子、缺氧和水分脅迫等刺激因素作用于不同的植 物細胞，最初反應幾乎都是引起胞內(nèi)Ca2+濃度變化(Bush D S. Calcium regulation in plant cell andits role in signaling. Annual Review of Plant Physiology and Plant MolecularBiology, 1995,46 95-122) 胞內(nèi)Ca2+濃度的變化可以通過Ca2+結(jié)合蛋白及其 靶蛋白進行識別、放大和向下游轉(zhuǎn)導(Reddy A S. Calcium :silver bullet in signaling. PlantScience，2001，160 :381_404)。類鈣調(diào)磷酸酶B 亞基蛋白(Calcineurin B-like (CBL) protein)是植物中一類重要的鈣離子傳感器(Batistic 0. and Kudla J. Plant calcineurin B-likeproteins and their interacting protein kinases. Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Molecular Cell Research, 2009,1793 985-992).該蛋白及其互 作分子蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPKs)與它們所調(diào)控的目標靶蛋白 在植物鈣信號的轉(zhuǎn)導過程中起著重要的信號傳遞作用(Cheong Y H，Pandey G K，Grant J J, et al. Twocalcineurin B-like calcium sensors interacting with protein kinase CIPK23 regulate leaftranspiration and root potassium uptake in Arabidopsis. Plant Journal, 2007, 52 =223-239) CBL是具有EF_手型超基因家族蛋白，通過與目標靶 蛋白激酶調(diào)節(jié)亞基結(jié)構(gòu)域結(jié)合，特異地參與調(diào)控植物CIPK/PKS基因家族蛋白激酶的活性， 在各種逆境條件下，包括干旱、鹽脅迫、傷害及病原菌的侵害反應中CBL及其調(diào)控蛋白起著 重要的調(diào)控作用(Cheong Y H, Kim K N, Pandey G K, et al. CBL, a calcium sensor that differentiallyregulates salt, drought and cold responses inArabidopsis. Plant Cell,2003,15 1833-1845)。最早被克隆的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因是擬南芥的S0S3基因(即AtCBL4 基因)，它編碼的S0S3蛋白能夠與其靶蛋白S0S2互作參與植物的耐鹽脅迫信號轉(zhuǎn)導途徑 (Liu J and Zhu J K. A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance. Science, 1998,280 =1943-1945)，除S0S3/AtCBL4外，研究者已從高等植物中分離了多個與
3非生物脅迫相關的CBL基因。薔薇科主要包括繡線菊亞科、蘋果亞科、薔薇亞科和李亞科四個亞科的植物。該科 包括著名的水果(如蘋果、沙果、海棠、梨、桃、李、杏、梅、櫻桃、枇杷、榲槨、山楂、草莓和樹 莓等)、藥用植物(如地榆、龍芽草、翻白草、郁李仁、金瑛子和木瓜等)、觀賞植物(如繡線 菊、繡線梅、珍珠梅、薔薇、月季、海棠、梅花、櫻花、碧桃、花楸、棣棠和白鵑梅等)和工業(yè)用 材(如懸鉤子、野薔薇和地榆的根皮可以提取單寧，桃仁、杏仁和扁桃仁可榨油以及玫瑰、 野薔薇、香水月季等的花瓣可以提取芳香油)。鑒于薔薇科植物的廣泛用途，對于該科植物 的抗逆境分子生物學研究具有重要現(xiàn)實意義。然而經(jīng)過對現(xiàn)有技術的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，至今沒有發(fā)現(xiàn)與薔薇科植物類鈣調(diào)磷酸酶 B亞基蛋白基因的描述與報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，鑒于薔薇科植物的抗逆境分子生物學研究存在的空白，提供 一種薔薇科植物類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因cDNA和DNA序列以及它們的編碼蛋白質(zhì)和 的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的克隆。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因，其特征在于它 源于薔薇科植物的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白，命名為PcCBL基因，所述PcCBL基因的核苷酸 序列為序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列外顯子部分。所述的SEQ IDN0 2序列包括9 個外顯子和8個內(nèi)含子。在本發(fā)明中所述PcCBL基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序 列。在本發(fā)明中PcCBL基因的編碼蛋白質(zhì)具有序列表SEQ ID NO 3蛋白質(zhì)活性多肽 的氨基酸序列，而且所述的氨基酸序列與SEQ ID NO 1第1-801位的核苷酸序列所編碼的 氨基酸序列至少有70%的同源性。所述的蛋白質(zhì)活性多肽的氨基酸序列SEQ ID N0:3是利用BioXM軟件對SEQ IDN0:2的核苷酸序列外顯子部分或SEQ ID NO :1的核苷酸序列進行翻譯后獲得；所述的 SEQ ID NO :3為含有266個氨基酸殘基的蛋白。一種PcCBL基因的克隆，其特征在于首先提取薔薇科植物的基因組DNA，克隆過 程中通過上游引物SEQ ID NO :8和下游引物SEQ ID NO 9配對擴增PcCBL基因SEQ ID NO: 2序列。一種PcCBL基因的克隆，其特征在于利用RACE技術克隆未知基因，具體步驟為 利用上游引物SEQ ID NO :4和下游引物SEQ ID NO :5，以總RNA反轉(zhuǎn)錄而來的第一鏈cDNA 為模板，通過RT-PCR獲得SEQ ID NO :1序列的保守區(qū)片段；根據(jù)SEQ IDN0:1序列的保守 區(qū)片段的序列信息，設計基因特異上游引物SEQ ID NO :6和基因特異下游引物SEQ ID NO 7，通過基因特異上游引物SEQ ID NO: 6與試劑盒中UPM引物配對進行RT-PCR擴增SEQ ID NO 1序列的3'末端序列；通過基因特異下游引物SEQ IDN0 7與試劑盒中UPM引物配對 進行RT-PCR擴增SEQ ID NO 1序列的5'末端序列；將得到的SEQ ID NO 1序列的3'和 5'末端序列，和SEQ ID NO :1序列的保守區(qū)片段進行拼接，最終獲得PcCBL的cDNA全長； 所述的試劑盒為 SMARTer RACE cDNAAmplification Kit。
本發(fā)明的優(yōu)點在于類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因在薔薇科植物中普遍存在，因 為該基因所編碼蛋白具有保守的氨基酸序列，通過本發(fā)明的方法能夠從薔薇科植物中克隆 獲得類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因，并且在薔薇科植物的逆境調(diào)控過程中，該基因能通過 提高自身的表達水平，來增強植物對生物和非生物脅迫的防御能力，展現(xiàn)出廣泛的應用前
旦
o


圖1不同植物類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因編碼的氨基酸序列比對。圖 1 中PcCBL 為豆梨(Pyrus calleryana) CBL 基因編碼蛋白；PtCBL6 為楊樹(Populus trichocarpa) CBL 蛋白，GenBank 序列號為 AB043665 ；AtCBLlO 為擬南芥(Arabidopsis thaliana)CBL 蛋白，GenBank 序列號為 NP195026 ；ZmCBLlO 為玉米(Zea mays) CBL 蛋白，GenBank 序列號為 ACJ65322 ；SbCBL7 為高粱(Sorghum bicolor) CBL 蛋白，GenBank 序列號為 ACQ83548。圖2豆梨類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因表達特點。圖 2 中PcCBL為豆梨類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因；Actin為豆梨肌動蛋白基因，作為內(nèi)參照基因；第1 7泳道分別為未處理豆梨植株葉片(對照)、100mM CaCl2、250mM NaCl2、 100 u M ABA、葉片機械損傷、整株吹干或4°C分別處理4h。
具體實施例方式下列實例中未注明的具體實驗方法的，均可按照常規(guī)方法進行。如J.薩姆布魯 克(Sambrook J.)和D. W.拉塞爾(Russell D ff.)著《分子克隆實驗指南》(科學出版社， 2005)中所述條件，或按照生物試劑生產(chǎn)廠商的使用說明。實施例1豆梨類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因cDNA的克隆設計引物對上游引物SEQID N0 :45 ‘ -GGNCTNATTCACAAGGAGGA-3‘下游引物SEQID N0 :55' -TACGGAAGATCATATTCTT-3‘。以200 ii M氯化鈉處理4h后的4葉一心豆梨植株葉片為植物材料，用RNAplant PlusKit (購自天根生物公司)提取總RNA，操作過程嚴格按照說明書的提取流程。采用 SMARTer RACE cDNAAmplif ication Kit (購自 TaKaRa 公司)逆轉(zhuǎn)錄 mRNA 成 cDNA 第一鏈， 方法按照試劑說明書進行。以逆轉(zhuǎn)錄的豆梨葉片cDNA第一鏈為模板，利用引物SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5，并采用Ex Taq (購自TaKaRa公司)進行RT-PCR擴增，加樣體系參照酶的 說明書，其PCR反應程序為94°C變性4min，隨后進行30個循環(huán)反應(94°C 30s,49°C 45s, 72°C lmin)，72°C延伸5min，獲得425bp的核心片段。
設計基因特異引物基因特異上游引物SEQ ID NO 65 ‘ -GGGCGGGAAGAAGTAAGGCAAATGG-3‘基因特異下游引物SEQ ID NO 75' -TGCCTTACTTCTTCCCGCCCGATGT-3‘。根據(jù)RACE方法，通過基因特異上游引物SEQ ID NO 6與試劑盒中的UPM引物配對 對425bp核心片段的3'端未知序列進行RT-PCR擴增；通過基因特異下游引物SEQID NO 7與試劑盒中的UPM引物配對對425bp核心片段的5'端未知序列進行RT-PCR擴增，試劑 盒采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (購自TaKaRa公司)，擴增程序和加樣體 系均按照說明書進行。對3 ‘端和5喘未知序列的擴增產(chǎn)物進行測序，最后與425bp的核心片段序列拼接 獲得全長cDNA序列ATGGCTGAGAGACCCAGATTGCAMTCCGTGACCTTCTATTTCGTATAGATTATTCCGCC60
TACAGCTTTACGACGAGTTCGAGCTCGCTGMGATCGGCGAGACTCTCTGTGCGTTGTGC120
AGACCACTGATTGGCCTGGTCGAGGCTTTCATCTTCAGCTTAGCTGGTTGCTTCGATTGC180
CACTGTCMCCTCACCGCCTTTCCTTCACCCACGACGACGTCGTTCGACTCGCCGCCACC240
TCTCCATTTAGTGTGMTGAAGTGGMGCATTGCGCGMCTGTTTMCMGTTMGTAGC300
TCCATTCTCGACGATGGATTACTTCACMGGAGGAGCTGAGGTTGGCGCTTTTCAAAACT360
CTAGCTGGTGAAMTCTTTTTCTTGATAGGGTGTTTGATGTTTTTGACGAAMGAMGAT420
GGAGTGATTGMTTTGAGGGGTTTGTCCACGCACTMGTGTGTTTCATCCGTATGCTTCT480
CTTGAGGCCAAGATTGATTTCGCATTTAGGTTGTATGATTTGAGGCAAACTGGATACATC540
GGGCGGGMG MGTMGGCAMTGGTAGTTGCTACTTTGTTGGMTCTGGCATTCAGATG600
CCGGATGAMCTCTGGMGCTATCGTCGATMGACGTTTGAGGTTGCCGACGTTGACMG660
GATGAAAAMTTGGCAMGACGMTGGAMGCCTATGCTACTCGGTACCCAACACTCCTA720
MGMCATGACCCTTCCATATTTAMGGACATCACGACTGTTTTTCCGAGTTTTATTTTC780
MCACTGGAGTCGMGACTGA801
該序列長度為801bp，它的開放閱讀框為SEQ. ID. NO. 1的自5'端第1位至801位
堿基，共801bp，其序列為SEQ. ID. NO. 1。該序列命名為PcCBL基因。實施例2豆梨類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因DNA的克隆設計引物對上游引物SEQID N0 :85 ‘ -ATGGCTGAGAGACCCAGATT-3‘下游引物SEQID N0 :95' -TCAGTCTTCGACTCCAGTGTTG-3‘以4葉一心豆梨植株葉片為植物材料，采用CTAB法提取基因組DNA。并根據(jù)PcCBL 基因的cDNA全長序列設計包含起始密碼子ATG的上游引物SEQ ID NO 8和終止密碼子TGA 的下游引物SEQ ID NO :9，采用Ex Taq (購自TaKaRa公司)對PcCBL基因的DNA序列進行 PCR擴增，加樣體系參照酶的說明書，其PCR反應程序為94°C變性4min，隨后進行30個循 環(huán)反應(94°C 30s，53°C 45s，72°C lmin)，72°C延伸lOmin。對擴增序列進行測序，獲得DNA序列ATGGCTGAGAGACCCAGATTGCAMTCCGTGACCTTCTATTTCGTATAGATTATTCCGCC60
TACAGCTTTACGGTACTATTCTCACTCTCTMCTTTTATCCTTCTTTGTTTGTTTGTTTC120
CCGACAAMTMTTAGAMGAAMTTTCACTCAMCGCCAATCTGTGCTGCTTCTGTGM180
TMTTCAGACGAGTTCGAGCTCGCTGMGATCGGCGAGACTCTCTGTGCGTTGTGCAGAC240
CACTGATTGGCCTGGTCGAGGCTTTCATCTTCAGCTTAGCTGGTTGCTTCGATTGCCACT300
GTCMCCTCACCGCCTTTCCTTCACCCACGACGACGTCGTTCGACTCGCCGCCACCTCTC360
CATGTTTGTACATAGCTTTTCTTCAGTATATMTTTTTCAGAMTGACMTATGTTTTTA420
MTAMTAMTMTTAGTTGGATMTGTTTCTCGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT480
CTCTCTCTCTCTCTCAGTTAGTGTGMTGAAGTGGMGCATTGCGCGMCTGTTTMCM540
GTTMGTAGCTCCATTCTCGACGATGGATTACTTCACMGGTTCATCAACTTATGCACTT600
CTTCTACMTTTTTGGTTTTTTMTTTTMTTTCTTTGACATGGGTCGTGGAMTTATAT660
CTTTTTCCTTGATTTTTTTTTTCATTTATTAGTAGCTGMATTTTATTTGTTGTTCATGT720
CCAGGAGGAGCTGAGGTTGGCGCTTTTCMMCTCTAGCTGGTGAAMTCTTTTTCTTGA780
TAGGGTMGCTCGCTTGTGATATTCTMTTTMTCTMTCCTMCTGTGGGMTGGAGAT840
TGGATGTCGGATGCATAGGGAGAGCACATCCGCTCTMTTTCTCATCCGGGTACATCTAT900
TMTTAGTTGCTGCTATTTTTTTTTTTCMGCAAAMGGAMGTGTGMGATTTCATMT960
TCTTTATTCCTTAGTGACATTCTTTAGCTTTMTAGCCGCTTTTTCATCTTTCCATTTCA1020
ATGCMCATTTTTTTCMCTATGTMTGTGACTCMGCGATTTACGTTATCMTCTTGTC1080
TGMCACTGAACCMCATATATATTGATCTGTTTCCTTTTMTCTGTGATGAMTGGGAT1140
GTAGGTGTTTGATGTTTTTGACGAAMGMAGATGGAGTGATTGAATTTGAGGGGTTTGT1200
CCACGCACTAAGTGTGTTTCATCCGTATGCTTCTCTTGAGGCCMGATTGATTGTMGTA1260
CTCMCMCCCMTGTCAGCTGCTTMCMTMGTTTGGAGGTGTTCGTGTTAMCGACA1320
TTGTCGTCTTCTTTCTCTTTGGTCGCTTGCAGTCGCATTTAGGTTGTATGATTTGAGGCA1380
MCTGGATACATCGGGCGGGMGMGTMGTATCTTGATGTGTTTGAGACTGTGMCMG1440
TTCTGTCGTTTCGGTTCATCATAGTTTTGTAMCMTTMTTCGTCTGTTGTATTACTTC1500
TACGGTCTAC CTTMCAGCTGCAGTTGCTTTCAGGTCAGGCAMTGGTAGTTGCTACTTT1560
GTTGGMTCTGGCATTCAGATGCCGGATGAMCTCTGGMGCTATCGTCGATAAGGCAAG1620
MTTGTGGATTTTTTAMCTTGAGTTCTTTACCTATATTCTGMGTTTTACACTCTCAM1680
GCTATGTTTTCTAGCTCAGACGTTTGAGGTTGCCGACGTTGACMGGATGAAAAMTTGG1740
CAMGACGMTGGAMGCCTATGCTACTCGGTACCCMCACTCCTAAAGAACATGACCCT1800
TCCATATTTAMGTACCTTTCCCTTACTGTCATTCCTTCGCGTTCMTTCTTTTTATATT1860
CTTCCCCMTCCATTTCTTCTCCTAMCGTGTTCTMTTATGTTATTGACACGCCAGGGA1920
CATCACGACTGTTTTTCCGAGTTTTATTTTCMCACTGGAGTCGAAGACTGA1972該序列長度為1972bp，該序列由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。序列為SEQ. ID. NO. 2。實施例3豆梨類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的序列信息與同源性分析PcCBL基因核苷酸翻譯采用BioXM軟件，氨基酸序列比對采用DNAMAN軟件完成，所 用其它植物的CBL蛋白序列來自http://www.ncbi.nlm.nih.gov。PcCBL基因編碼蛋白是-個含有266個氨基酸殘基的蛋白
0099]MetAlaGluArgProArgLeuGinlieArgAspLeuLeuPheArglie0100]1510150101]AspTyrSerAlaTyrSerPheThrThrSerSerSerSerLeuLyslie0102]2025300103]GlyGluThrLeuCysAlaLeuCysArgProLeulieGlyLeuValGlu0104]3540450105]AlaPheliePheSerLeuAlaGlyCysPheAspCysHisCysGinPro0106]5055600107]HisArgLeuSerPheThrHisAspAspValValArgLeuAlaAlaThr0108]657075800109]SerProPheSerValAsnGluValGluAlaLeuArgGluLeuPheAsn0110]8590950111]LysLeuSerSerSerlieLeuAspAspGlyLeuLeuHisLysGluGlu0112]1001051100113]LeuArgLeuAlaLeuPheLysThrLeuAlaGlyGluAsnLeuPheLeu0114]1151201250115]AspArgValPheAspValPheAspGluLysLysAspGlyVallieGlu0116]1301351400117]PheGluGlyPheValHisAlaLeuSerValPheHisProTyrAlaSer0118]1451501551600119]LeuGluAlaLyslieAspPheAlaPheArgLeuTyrAspLeuArgGin0120]1651701750121]ThrGlyTyrlieGlyArgGluGluValArgGinMetValValAlaThr0122]1801851900123]LeuLeuGluSerGlylieGinMetProAspGluThrLeuGluAlalie0124]1952002050125]ValAspLysThrPheGluValAlaAspValAspLysAsp GluLyslie0126]2102152200127]GlyLysAspGluTrpLysAlaTyrAlaThrArgTyrProThrLeuLeu0128]2252302352400129]LysAsnMetThrLeuProTyrLeuLysAsplieThrThrValPhePro0130]2452502550131]SerPheliePheAsnThrGlyValGluAsp0132]2602650133]該序列為SEQ. ID.NO. 3o0134]PcCBL基因編碼蛋白預測的等電點(pi)為4.(35，蛋白質(zhì)相對分子,
30. 30KDa。不同植物來源的CBL蛋白同源性分析結(jié)果表明豆梨PcCBL的cDNA序列編碼 的氨基酸序列與其他物種相比同源性相對較高(圖1)。與楊樹(Populus trichocarpa)PtCBL6蛋白(GenBank序列號為AB043665)的同源一致性達到68 %，相似性達到82 % ； 與擬南芥(Arabidopsis thaiiana)AtCBLlO 蛋白(GenBank 序列號為 NP195026)的同源 一致性達到65%，相似性達到76% ；與玉米(Zea mays)ZmCBLlO蛋白(GenBank序列號為 ACJ65322)的同源一致性達到57%，相似性達到68%;與高粱(Sorghum bicolor) SbCBL7蛋 白(GenBank序列號為ACQ83548)的同源一致性達到55%，相似性達到67%。實施例4豆梨類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的表達研究對4葉一心的豆梨植株進行脅迫處理，包括澆灌IOOmL 1/2MS液體培養(yǎng)基配制 的IOOmM CaCl2,250mM NaCl2或100 μ M ΑΒΑ，葉片機械損傷，整株吹干或4°C處理。以不經(jīng) 任何處理的植株為對照。不同處理植株均在4h后采集葉片，保存于-70°C冰箱待用。以 保存的葉片為植物材料，用RNAplant Plus Kit (購自天根生物公司)提取總RNA，操作過 程嚴格按照說明書的提取流程。葉片總RNA按照以下方法逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈1. 0 μ L 50 μ mol · L-1Oligo (dT) 15, 2 μ g 總 RNA, l.OyL IOmmol · L_1dNTP, RNase free water 補足 10. 0μ L，65°C 保溫 5min，冰浴冷卻 2min，離心數(shù)秒，加入 4. 0 μ L 5XPrimeScriptBuffer, 0. 5 μ L 40U ‘ μ L^1RNase inhibitor, 1. 0 μ L 200U · μ L^1PrimeScriptReverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄酶，RNase free water 補足 20. 0 μ L，輕輕混勻，42°C保溫 60min， 70°C加熱15min終止反應，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于_20°C備用于基因表達研究。設計引物對特異性上游引物CBL-I 5' -CCGCCACCTCTCCATTTAG-3‘；特異性下游引物CBL-2 5' -CATGTTCTTTAGGAGTGTTGGG-3‘。上游引物B-I 5' -GGAATGGTCAAGGCTGGGTT-3‘；下游引物B-2:5' -CAAAGCATCTGTGAGGTCACG-3‘。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μ1為模板，利用PcCBL基因跨6個內(nèi)含子設計的特異性引物 CBL-I 和 CBL-2，進行半定量 RT-PCR。反應參數(shù)-MV 5min ；94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 2min, 30個循環(huán)；72°C 5min。選用豆梨肌動蛋白Actin基因為內(nèi)參照基因，設計上游引物B-I和 下游引物B-2，在相同條件下進行擴增，比較研究PcCBL基因的表達情況。PcCBL基因在未處理豆梨植株葉片中并無表達，在人工脅迫條件下處理4h后，豆 梨葉片中PcCBL基因均被誘導表達(圖2)，其中，人工脅迫為分別澆灌IOOmL V2MS液體 培養(yǎng)基配制的IOOmM CaCl2,250mM NaCl2UOOyM ABA，葉片機械損傷、整株吹干或4°C處理， 它們的PcCBL基因均被誘導表達，依次分別為電泳圖中的第2 7泳道，第1泳道為空白對 照。這表明該基因參與了豆梨對生物或非生物脅迫的防御機制。鑒于豆梨為一種梨樹，屬于薔薇科中的蘋果亞科果樹，是我國南方梨產(chǎn)區(qū)廣泛使 用的砧木之一，以上實施例僅以豆梨為試驗材料，但這不是對本發(fā)明的限制，運用薔薇科的 其他植物重復上述實驗過程也能夠獲得相同的技術效果，無論是采用薔薇科哪種植物進行 試驗，其基因克隆的步驟和基因表達特點的研究均按照權利要求的規(guī)范予以設置。
權利要求
一種類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因，其特征在于它源于薔薇科植物的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因，所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO2的核苷酸序列外顯子部分。
2.根據(jù)權利要求1所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因，其特征在于所述的類鈣調(diào) 磷酸酶B亞基蛋白基因的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO :1的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的編碼蛋白質(zhì)，其特征在 于編碼蛋白具有序列表SEQ ID NO :3蛋白質(zhì)活性多肽的氨基酸序列，而且所述的氨基酸 序列與SEQ ID NO :1第1 801位的核苷酸序列所編碼蛋白質(zhì)至少有70%的同源性。
4.根據(jù)權利要求3所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的編碼蛋白質(zhì)，其特征在于 編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列SEQ ID N0:3是利用BioXM軟件對SEQ ID NO 2的核苷酸序列 外顯子部分或SEQ ID NO :1的核苷酸序列進行翻譯后獲得；所述的SEQ IDN0:3為含有266 個氨基酸殘基的蛋白。
5.一種如權利要求1所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的克隆，其特征在于首 先提取薔薇科植物的基因組DNA，克隆過程中通過上游引物SEQ ID NO :8和下游引物SEQ IDN0 9配對擴增SEQ IDN0 2序列。
6.一種如權利要求2所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因的克隆，其特征在于利用RACE技術克隆未知基因，具體步驟為利用上游引物SEQ ID NO :4和下游引物SEQID NO :5，以總RNA反轉(zhuǎn)錄而來的第一鏈cDNA為模板，通過RT-PCR獲得SEQ ID NO 1序列 的保守區(qū)片段；根據(jù)SEQ ID NO :1序列的保守區(qū)片段的序列信息，設計基因特異上游引物SEQ IDN0 6和基因特異下游引物SEQ ID NO :7，通過基因特異上游引物SEQ ID NO :6與試劑盒中UPM 引物配對進行RT-PCR擴增SEQ ID NO 1序列的3'末端序列；通過基因特異下游引物SEQ ID NO 7與試劑盒中UPM引物配對進行RT-PCR擴增SEQ ID NO 1序列的5'末端序列；將 得到的SEQ ID NO :1序列的3'和5'末端序列和SEQ ID NO :1序列的保守區(qū)片段，進行拼 接，最終獲得PcCBL的cDNA全長；所述的試劑盒為 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因及其編碼蛋白質(zhì)和該基因的克隆，所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因源于薔薇科植物，類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因為SEQ ID NO1或SEQ ID NO2，其編碼蛋白質(zhì)為SEQ ID NO3；所述的類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因可以通過設計的引物予以克?。活愨}調(diào)磷酸酶B亞基蛋白基因可以通過提高自身的表達水平來增強植物對生物和非生物脅迫的防御能力，對于該科植物的抗逆境分子生物學研究具有重要現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N15/29GK101979579SQ20101051266
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權日2010年10月20日
發(fā)明者叢郁, 常有宏, 李慧, 藺經(jīng) 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院