一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因，其是在土生隱球酵母BSLL1-1菌株中克隆的，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，編碼如SEQIDNO：2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；將該蛋白在大腸桿菌中表達(dá)，并進(jìn)一步將該基因在釀酒酵母中成功表達(dá)，該基因使釀酒酵母耐鋁能力增加，基因工程菌可以吸附（或者吸收）培養(yǎng)介質(zhì)中的活性鋁，該釀酒酵母基因工程菌具有降低酸性土壤中活性鋁含量的應(yīng)用潛力。
【專利說(shuō)明】一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及土生隱球酵母編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基 的耐鋁基因，核苷酸序列和氨基酸序列，以及耐鋁蛋白的異源表達(dá)，涉及含有該基因的重組 質(zhì)粒和表達(dá)該耐鋁基因的工程菌株，它們的制備和表達(dá)方法，以及它們?cè)谖江h(huán)境中活性 鋁的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 酸性土壤在世界上廣泛存在，其中可耕種面積為1. 79億hm2。我國(guó)酸性土壤的分 布遍及14個(gè)省區(qū)，約占全國(guó)耕地面積的21% (熊毅和李慶逵，1987)。氮肥的過(guò)量施用是導(dǎo) 致農(nóng)田土壤酸化的最主要原因。此外，工業(yè)化發(fā)展導(dǎo)致的酸雨、人類不良的耕作方式和陽(yáng)離 子在土壤中的淋失，使酸性土壤的面積不斷擴(kuò)大，酸化程度不斷加劇。
[0003] 鋁（aluminum，A1)在地殼中分布廣泛，約占地殼總質(zhì)量的7%。在土壤中，鋁的主 要存在形態(tài)是不溶于水的氧化物或鋁硅酸鹽，這些形態(tài)是對(duì)植物和環(huán)境沒(méi)有傷害的。但是 隨著土壤酸化程度的增加，土壤中的鋁從不溶于水的形態(tài)中溶解出來(lái)，轉(zhuǎn)化為可溶于水的 無(wú)機(jī)離子態(tài)，如Al 3+、（A10H)2+、（A10H)2+，這些形態(tài)對(duì)植物根系的毒害作用最大，又稱為活性 A1。因此，在酸性土壤上鋁毒害是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的主要限制因素之一。通常，解決鋁毒害 的方法是大量施用石灰來(lái)提高土壤的pH值，使游離鋁沉淀。但是這種方法難以徹底解決土 壤酸度和鋁毒害問(wèn)題，同時(shí)還存在著潛在的環(huán)境問(wèn)題。
[0004] 土壤微生物是土壤生態(tài)體系的重要組成部分，在植物和土壤的相互作用過(guò)程中扮 演著重要的角色。土壤微生物參與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、物質(zhì)代謝、有機(jī)物分解、礦化以及污染物 降解等多種生化反應(yīng)。特別是，土壤微生物在土壤中污染物或者是重金屬清除中發(fā)揮了重 要作用，也即微生物修復(fù)技術(shù)。微生物修復(fù)技術(shù)是利用微生物(土著菌、外來(lái)菌、基因工程 菌)對(duì)污染物的代謝作用而轉(zhuǎn)化、降解污染物。微生物修復(fù)技術(shù)已成功應(yīng)用于煤氣廠址PAHs 污染修復(fù)，石油烴污染土壤修復(fù)，農(nóng)藥污染土壤修復(fù)等。此外，重金屬污染土壤的微生物修 復(fù)主要是利用土壤中天然的微生物資源，削減、凈化土壤中重金屬或降低重金屬毒性，從而 使污染物的濃度降低到可以接受的水平，或?qū)⒂卸居泻Φ奈廴疚镛D(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，也包 括將其穩(wěn)定化以減少其向周邊環(huán)境擴(kuò)散。在重金屬污染土壤的生態(tài)修復(fù)中微生物主要通過(guò) 以下幾種方式起作用：（1)通過(guò)微生物的吸附、代謝達(dá)到對(duì)重金屬消減、凈化作用和固定作 用；（2)通過(guò)微生物改變重金屬的化學(xué)形態(tài)，使重金屬固定或生物可利用性降低，減少重金 屬的危害；（3) 土壤微生物通過(guò)氧化還原作用改變根際重金屬形態(tài)或產(chǎn)生的有機(jī)酸可增加 金屬的溶解性，提高重金屬的有效性，以利于植物吸收；（4)通過(guò)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物 抗病性、抗逆能力等方式間接影響修復(fù)效率。因?yàn)槲⑸锓N類多，代謝類型豐富，生長(zhǎng)在酸 性環(huán)境中的微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，為了保護(hù)細(xì)胞免受鋁的毒害，產(chǎn)生了一系列的抗 鋁毒機(jī)制：如有機(jī)酸及其代謝產(chǎn)物對(duì)鋁的螯合作用；抗氧化脅迫作用；抗細(xì)胞程序性死亡 等。因此，篩選或者改良土壤微生物使其增加對(duì)鋁的耐受性或者提高其對(duì)土壤中鋁的清除 能力，是解決酸性土壤上鋁毒害的直接而有效的措施。
[0005] 鈣離子（Ca2+)作為動(dòng)植物及微生物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，參與了胞內(nèi)很多生理 反應(yīng)。Ca 2+作為離子信號(hào)分子，需要下游受體才能將信號(hào)傳遞下去，并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞反應(yīng)和 生物進(jìn)程。鈣調(diào)素（Calmodulin，CaM)是真核細(xì)胞內(nèi)高度保守的、廣泛存在的一種非常重要 的鈣離子受體蛋白。CaM自身不具有酶的活性，但其能與靶蛋白相互作用，從而對(duì)靶蛋白的 活性進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的Ca 2+濃度升高時(shí)，Ca2+會(huì)與CaM的EF-hand結(jié)構(gòu)域結(jié)合，直接導(dǎo) 致隹丐調(diào)素結(jié)合蛋白（calmodulin binding protein, CaMBP)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，CaM結(jié) 合結(jié)構(gòu)域被釋放出來(lái)，結(jié)合了四個(gè)Ca2+的CaM再通過(guò)CaM結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CaMBP相結(jié)合，從而 將信號(hào)傳導(dǎo)下去。鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN)是鈣調(diào)素下游結(jié)合靶蛋白的一種，是特 異性的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴的蘇氨酸/絲氨酸蛋白磷酸酶。鈣調(diào)磷酸酶是一個(gè)異源二聚體蛋 白，由一個(gè)71KDa的催化亞基A (CNA)和一個(gè)19KDa的調(diào)節(jié)亞基B (CNB)組成。CNA含有四 個(gè)功能區(qū)：分別是催化結(jié)構(gòu)域；CNB結(jié)合結(jié)構(gòu)域；鈣調(diào)素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD);自抑制域(AID)。 鈣調(diào)磷酸酶的調(diào)節(jié)亞基CNB是一個(gè)具有EF-hand結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，能與Ca 2+結(jié)合。Ca2+存 在時(shí)，B亞基與A亞基結(jié)合后，會(huì)使調(diào)節(jié)片段中的自抑制結(jié)構(gòu)域（AID)從催化活性中心上 脫落，從而降低了自抑制結(jié)構(gòu)域?qū)γ富钚缘淖砸种谱饔谩?br> [0006] 鈣調(diào)磷酸酶在很多細(xì)胞和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其主要作用是通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子 Crzl調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而使脅迫條件下細(xì)胞存活。在白色念珠菌中，鈣調(diào)磷酸酶的主要 作用是響應(yīng)各種刺激或脅迫（Zelteret al·，F(xiàn)ungal GenetBiol, 2004，41: 827-841; Stie and Fox, Eukaryot Cell, 2008，7: 177-186)。在高溫、高pH 以及I丐鹽離子脅 迫的情況下，鈣調(diào)磷酸酶對(duì)于釀酒酵母的生長(zhǎng)是必需的（Bonilla et al.，ΕΜΒ0，2002， 21:2343-2353)。在釀酒酵母中乙醇脅迫可以激活鈣離子介導(dǎo)的鈣調(diào)磷酸酶/Crzl途徑 (Araki et al·，J Biosci Bioeng, 2009，107(1):1_6)。通過(guò)研究|丐調(diào)磷酸酶對(duì)人類主要 病原菌念珠菌毒力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基（CMP1/CNA)的白色念珠菌 突變體和編碼鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)亞基（CNB1)的白色念珠菌突變體，對(duì)于鹽脅迫、堿脅迫和滲 透脅迫是敏感的（Bader et al·，Infect Immun, 2003，71:5344-5354; Blankenship et al.，Eukaryot Cell, 2003，2:422-430)。這些結(jié)果表明，鈣調(diào)素信號(hào)途徑可能是生物體 耐受逆境脅迫的一種普遍機(jī)制，過(guò)表達(dá)該途徑上的基因會(huì)提高對(duì)逆境脅迫的耐受能力。因 此，克隆這些基因?qū)ρ芯克鼈冊(cè)诳逛X毒中的作用具有非常重要的意義。同時(shí)，對(duì)克隆到的基 因進(jìn)行改造或者構(gòu)建基因工程菌株，還可以為治理酸性土壤上的鋁毒害問(wèn)題提供理論和應(yīng) 用基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所 示，編碼如SEQ ID N0 :2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；其由土生隱球酵母（C A腫icoA/s) BSLL1-1菌株產(chǎn)生，基因序列全長(zhǎng)1917bp，與黑白輪枝菌絲氨 酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶（PP2B)基因同源性達(dá)到81%，編碼鈣調(diào)磷酸酶催化亞基（CNA)蛋白 由638個(gè)氨基酸組成，分子量約為77KDa。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因的重組表達(dá)載體 PYES3/CT- CNA。
[0009] 本發(fā)明另一目的是提供一種含有鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因或上述重組表達(dá)載體 的釀酒酵母工程菌株。
[0010] 本發(fā)明另一目的是將鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因應(yīng)用在吸附環(huán)境中活性鋁中。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案： 1、 本發(fā)明提取從云南省保山市龍陵縣周邊茶園茶樹(shù)根際酸性土壤中分離的土生隱球 酵母BSLL1-1菌株基因組DNA，送上海人類基因組研究中心進(jìn)行基因組測(cè)序，得到CNA基因 組序列。根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，用土生隱球酵母的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增CNA 基因片段。將擴(kuò)增片段連接到PMD-18T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，然后涂布含氨芐青霉 素的平板，挑取陽(yáng)性菌落測(cè)序，鑒定出編碼CNA蛋白的基因，其序列如SEQ ID N0 :1所示，該 蛋白由638個(gè)氨基酸編碼，氨基酸序列如SEQ ID N0 :2所示； 2、 以土生隱球酵母cDNA為模板，用特異引物擴(kuò)增CNA片段，然后與經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶 切的pET-32a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，獲得重組質(zhì)粒pET-32a-CNA和含 重組表達(dá)質(zhì)粒的重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)_ pET-32a-CAN ; 3、 從測(cè)序正確的pMD18-T-CNA質(zhì)粒上酶切回收目的片段，連接到經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切 的酵母表達(dá)載體PYES3/CT質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒pYES3/CT-CNA，將重組質(zhì)粒用電擊法轉(zhuǎn)化 釀酒酵母（INVScl)感受態(tài)細(xì)胞，用Western blotting法在轉(zhuǎn)基因酵母中檢測(cè)到了目的條 帶的存在，從而成功得到含PYES3/CT-CNA表達(dá)載體的重組酵母工程菌株INVScl-pYES3/ CT-CNA。
[0012] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下： 本發(fā)明的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因可以增加酵母的耐鋁能力，鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基 因工程菌株可以通過(guò)吸附作用降低環(huán)境中活性鋁的含量，這種利用微生物修復(fù)環(huán)境中活性 鋁的技術(shù)費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便，對(duì)環(huán)境影響小，不會(huì)造成二次污染。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1為本發(fā)明中驗(yàn)證CNA和CaM之間相互作用的GST-pull down檢測(cè)圖；圖中： GST為純化的GST蛋白；GST-CAM為純化的GST-CaM融合蛋白； 圖2為本發(fā)明原核表達(dá)載體pET-32a-CNA質(zhì)粒及其漢3?HWa/7dIII雙酶切鑒定電泳檢 測(cè)圖，其中A圖中對(duì)照為對(duì)照質(zhì)粒；1，2,3為pET-32a-CNA質(zhì)粒；B圖中marker為DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)；2為2號(hào)質(zhì)粒雙酶切； 圖3為本發(fā)明CNA重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)電泳檢測(cè)圖，其中Marker為蛋白分子 量標(biāo)準(zhǔn)；0h，2h，4h，6h，8h為誘導(dǎo)時(shí)間；對(duì)照為轉(zhuǎn)空載體的菌株；上清為誘導(dǎo)菌體上清 液；沉淀為誘導(dǎo)菌體沉淀； 圖4為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母的構(gòu)建及檢測(cè)圖，其中圖A為pYES3/CT-CNA質(zhì)粒的酶切 檢測(cè)圖，Μ為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2，3，4為質(zhì)粒你/7dIII酶切；圖B為Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)基因酵母中CNA蛋白的表達(dá)； 圖5為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母耐鋁能力檢測(cè)圖； 圖6為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母吸附(或吸收）鋁能力的檢測(cè)圖；其中：圖A為0. 2mM鋁時(shí)轉(zhuǎn) 基因酵母和對(duì)照酵母培養(yǎng)基中剩余鋁含量；圖B為2mM鋁時(shí)轉(zhuǎn)基因酵母和對(duì)照酵母培養(yǎng)基 中剩余鋁含量。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無(wú)特殊說(shuō)明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無(wú)特殊說(shuō)明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0015] 實(shí)施例1: 土生隱球酵母（C Awsico^A^BSLLl-l菌株CNA基因的克隆和鑒定 提取土生隱球酵母菌基因組DNA (奧斯伯等，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南(第 五版)，北京：科學(xué)出版社，2008)，送上海人類基因組研究中心進(jìn)行基因組測(cè)序，得 到CNA基因組序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下：正向引物CNA-F :5' -GGATCCATGACCTCTCCGGCGACCCAGC-3 ' （下劃線為 酶切位點(diǎn)），反向引物 CNA-R : 5 ' - AAGCTTTTAGGCAATAGAGTTCTCGG-3' (下劃線為你 fldlll酶切位點(diǎn)）。用土生隱球酵母的cDNA 為模板，用設(shè)計(jì)好的引物擴(kuò)增CNA基因 片段。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性3min，然后按照 94°C變性30s，65 °C退火30s，72 °C延伸2min的程序進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72 °C反應(yīng) lOmin。CNA基因的PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，獲得TA克隆載體命名為pMD18-T-CNA， 然后對(duì)獲得的TA克隆載體進(jìn)行酶切驗(yàn)證，對(duì)酶切檢測(cè)正確的pMD18-T-CNA質(zhì)粒送北京六合 華大基因科技股份有限公司測(cè)序，CAN核苷酸序列如序列表SEQ ID N0 :1所示。
[0016] 實(shí)施例2 :驗(yàn)證CNA和CaM的互作 合成CNA的多肽611-627 :RLAEVISSPTKGGQGER，免疫雄兔，制備CNA抗體； 1)免疫：選取3. 0kg左右的新西蘭大白兔，免疫之前，耳靜脈取陰性血清，取1000 μ g鈣 調(diào)磷酸酶催化亞基的多肽，用生理鹽水稀釋到ΙΟΟΟμ 1，再加入等體積弗氏佐劑(初次免疫 用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫用弗氏不完全佐劑)。用研缽將溶液和佐劑研磨混勻，使溶液形 成油包水的狀態(tài)。將混勻好的免疫原進(jìn)行皮下注射，一般免疫三次，前兩次免疫間隔兩周， 最后一次免疫間隔一周。第一次免疫在腳掌部注射打2-3個(gè)點(diǎn)，后兩次在背部免疫打4-5 個(gè)點(diǎn)。
[0017] 2)心臟采血：將兔仰面，四肢縛于動(dòng)物固定架上（或由助手抓住四肢）。用乙醚麻 醉，剪去左胸部毛發(fā)，消毒皮膚。剪開(kāi)皮膚，將心臟剝離，用50ml注射器（連接16號(hào)針頭） 傾斜進(jìn)針，對(duì)準(zhǔn)心搏最強(qiáng)處刺入心臟抽血。將抽取的血液立即注入無(wú)菌50ml離心管中，待 凝固后分離血清。
[0018] 3)分離血清：于10000rpm，4°C，離心15 min，取上清，分裝后置-20°C冰箱中保存 備用。
[0019] 4)多抗效果檢測(cè)：用Western blotting方法檢測(cè)得到的多克隆抗體，用陰性血清 作為負(fù)對(duì)照。檢測(cè)得到的抗體效果很好，可以用于做后面的實(shí)驗(yàn)。
[0020] 驗(yàn)證 CNA 和 CaM 之間的相互作用。Glutathione S-transferase(GST)和 GST-CaM 在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并且分別用GST親和層析柱純化獲得純度較高的目的蛋白。分別 取50 Pg純化的GST和GST-CaM融合蛋白與20 mM A1處理12 h的土生隱球酵母總蛋白500 吒在結(jié)合緩沖液（50 mM Tris-Cl，pH 7.5,100 mM NaCl，0.25% TritonX-100，lmM EDTA， ImM DTT)中共同震蕩孵育2 h;加入30 μ? GST瓊脂糖結(jié)合樹(shù)脂在4°C搖床（40 rpm)孵育 過(guò)夜；4°C，3500g離心5min收集沉淀物，收集的沉淀蛋白混合物用結(jié)合緩沖液洗滌三次；沉 降下來(lái)的蛋白質(zhì)混合物加入10 μ? SDS凝膠加樣緩沖液（Tris-HCl 50 mM，pH 6. 8;SDS 2 % ;DTT 100 mM ;溴酚藍(lán)0· 1 % ;甘油10 %)，用沸水浴煮；在12%的SDS-PAGE膠分離所沉淀 的蛋白質(zhì)；分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后分別用anti-CNA特異性抗體孵育膜，隨后 在Chemidoc XRS⑵/0-7?仍中進(jìn)行成像觀察。結(jié)果表明，CNA可以被GST-CaM蛋白沉淀；然 而負(fù)對(duì)照GST蛋白沒(méi)有沉淀到CNA (圖1)。因此，CaM和CNA在體外是可以相互作用的。
[0021] 實(shí)施例3 :CNA蛋白的異源表達(dá) 以土生隱球酵母的cDNA作為模板，用特異引物CNA-F和CNA-R擴(kuò)增CNA片段，然后與經(jīng) 限制性內(nèi)切酶你 fldlll酶切的pET-32a載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株， 獲得重組質(zhì)粒pET-32a-CNA。提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，檢測(cè)到與目的條帶 和載體片段同樣大小的兩條帶，如圖2所示，說(shuō)明原核表達(dá)載體pET-32a-CNA構(gòu)建成功。將 重組質(zhì)粒pET-32a-CNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，得到含重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌株大腸桿 菌 BL21(DE3)- pET-32a-CNA。
[0022] 將重組大腸桿菌BL21(DE3)_ pET-32a-CNA菌株和對(duì)照菌株即含有pET-32a質(zhì) 粒的大腸桿菌BL21(DE3) - pET-32a，接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，200 rpm、37°C培養(yǎng)過(guò)夜，再按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，20°C培養(yǎng)至0D_為 0. 6-0. 8時(shí)，加入ITPG至終濃度為ImM，對(duì)含有CNA目的基因的表達(dá)載體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；分 別收集誘導(dǎo)他、211、411、611、811后的表達(dá)菌體21111，收集后的菌液于4 1：、12 000印111離心1 min，棄上清液，沉淀用2M尿素100 μ 1重懸，之后再加20 μ 1 SDS凝膠加樣緩沖液，煮沸5 -lOmin后，12 000 rpm離心1 min,取20 μ 1上清進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定菌體的最優(yōu)表 達(dá)時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)以含有目的基因的表達(dá)菌誘導(dǎo)〇 h和含pET-32a空載體的大腸桿菌誘導(dǎo)表 達(dá)6 h作為對(duì)照。隨后，對(duì)收集的菌體進(jìn)行超聲波破碎，4°C，12000rpm離心20min，收集上 清與沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白的表達(dá)形式。SDS-PAGE分離膠的濃度為12%，濃縮膠濃度為 4%。SDS-PAGE結(jié)果表明，CNA基因編碼的蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達(dá)，且在上清 和沉淀中都有表達(dá)（圖3)。重組蛋白的最佳表達(dá)條件為20°C，lmM IPTG，誘導(dǎo)時(shí)間為6h。
[0023] 實(shí)施例4 : CNA轉(zhuǎn)基因酵母的構(gòu)建及檢測(cè) 將測(cè)序正確的PMD18-T-CNA質(zhì)粒用fe?HI和班/7dIII酶切，回收CNA片段，用fe?HI 和班/7dIII酶切pYES3/CT質(zhì)粒，回收得到帶有fe?HI和班/7dIII酶切位點(diǎn)的線性pYES3/CT 片段，然后將二者進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PYES3/CT-CNA質(zhì)粒。用fe?HI和班/7dIII對(duì)pYES3/ CT-CNA質(zhì)粒酶切，酶切產(chǎn)物電泳檢測(cè)到了目的條帶（圖4A)，說(shuō)明外源基因成功插入到酵母 表達(dá)載體上。
[0024] 將檢測(cè)正確的PYES3/CT-CNA質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc 1感受態(tài)細(xì)胞，在 SD-Trp平板上長(zhǎng)2-3天，挑取單菌落，30°C培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體后提取總蛋白，用CNA抗體進(jìn) 行Western blotting檢測(cè)，在轉(zhuǎn)基因酵母中檢測(cè)到了與目的蛋白大小的條帶，結(jié)果如圖4B 所示，這進(jìn)一步驗(yàn)證了外源基因在釀酒酵母細(xì)胞得到了成功表達(dá)。
[0025] 實(shí)施例5 :轉(zhuǎn)基因酵母耐鋁能力檢測(cè) 配制鋁濃度為〇、〇. l、〇. 2、2mM的Yro誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基(碳源為半乳糖)，將活化的 菌體按初始〇D6(?為1，稀釋倍數(shù)分別為10° UCT1、10_2、10_3、10_4,將稀釋的菌液5μ1 點(diǎn)種到平板上，48h后觀察生長(zhǎng)情況，從圖5中看出，隨著鋁濃度的增加，轉(zhuǎn)基因酵母 INVScl-pYES3/CT-CNA耐鋁能力都明顯高于對(duì)照酵母INVScl-pYES3/CT。在含有0. ImM鋁的 固體平板上，與對(duì)照酵母相比，轉(zhuǎn)基因酵母菌落較大，表明對(duì)照酵母生長(zhǎng)受到抑制。在含有 2mM鋁的固體平板上，稀釋倍數(shù)為10_ 4時(shí)，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母生長(zhǎng)良好，對(duì)照酵母 基本不生長(zhǎng)。隨著鋁濃度的增加，轉(zhuǎn)基因酵母生長(zhǎng)狀況比對(duì)照酵母好，說(shuō)明在鋁脅迫下CNA 基因有促進(jìn)生長(zhǎng)的作用。
[0026] 實(shí)施例6 :轉(zhuǎn)基因酵母吸附(或吸收）鋁的檢測(cè) 通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基中剩余活性鋁的含量，進(jìn)而檢測(cè)PYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母吸收或吸 附鋁的能力。分別用含有〇. 2mM和2mM鋁的培養(yǎng)基作為對(duì)照，其培養(yǎng)基中剩余鋁含量定義 為100%。在含有0. 2mM鋁時(shí)，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)基中活性鋁剩余量為33. 54%， 與轉(zhuǎn)空載體PYES3/CT酵母相比，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母的培養(yǎng)基中剩余的活性鋁明顯 減少。在含有2mM鋁時(shí)，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母培養(yǎng)基中活性鋁剩余量為74. 19%，與轉(zhuǎn) 空載體PYES3/CT酵母相比，pYES3/CT-CNA轉(zhuǎn)基因酵母的培養(yǎng)基中剩余的活性鋁也明顯減 少（圖6)。這些結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因酵母中，CNA基因可能通過(guò)增加菌體對(duì)鋁的吸附或者吸 收來(lái)達(dá)到耐鋁的目的。
【權(quán)利要求】
1. 一種鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，編碼如SEQ ID NO :2所不氣基酸序列的蛋白質(zhì)。
2. -種含有權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因的重組表達(dá)載體。
3. -種釀酒酵母工程菌株，所述工程菌株含有權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基 基因或權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體。
4. 權(quán)利要求1所述的鈣調(diào)磷酸酶催化亞基基因在吸附環(huán)境中活性鋁中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/16GK104195152SQ201410423663
【公開(kāi)日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】年洪娟, 張磊, 張晶晶, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)