專利名稱：：一種植物雙向啟動(dòng)子bigdb2的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種植物雙向啟動(dòng)子BI⑶B2的克隆與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：通過導(dǎo)入外源基因使植物獲得新的性狀并能穩(wěn)定遺傳是植物基因工程的最終目的?；ㄒ瞬《綜aMV35S啟動(dòng)子作為穩(wěn)定、高效的外源啟動(dòng)子，一直被人們廣泛的使用。然而在轉(zhuǎn)基因過程中由于重復(fù)序列的出現(xiàn)會(huì)引起基因沉默現(xiàn)象，尤其是進(jìn)行多個(gè)基因?qū)霑r(shí)，這種現(xiàn)象會(huì)更嚴(yán)重，從而嚴(yán)重影響了轉(zhuǎn)基因植株的獲得和后代的穩(wěn)定性。而在進(jìn)行兩個(gè)或兩個(gè)以上基因?qū)霑r(shí)，通常需要這些基因的表達(dá)量、表達(dá)時(shí)間和位置的同一性，進(jìn)而確保轉(zhuǎn)入基因行使正常的功能，使用35S啟動(dòng)子很難達(dá)到這樣的要求。這些都是植物基因工程中亟待解決的問題。對(duì)于轉(zhuǎn)基因引起的基因沉默現(xiàn)象人們已經(jīng)有了比較深入的認(rèn)識(shí)，引起轉(zhuǎn)基因沉默有多種因素，其中最主要的就是重復(fù)序列的產(chǎn)生，尤其是多個(gè)基因?qū)霑r(shí)，更人為的造成了多個(gè)35S啟動(dòng)子插入的情況，對(duì)此至今尚無有效的解決方法。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，多種生物基因組測(cè)序已完成，經(jīng)過生物信息學(xué)分析人們發(fā)現(xiàn)了雙向啟動(dòng)子的存在，這為我們利用植物自身的雙向啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，從而避免多基因插入引起的基因沉默現(xiàn)象提供了可能。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種DNA片段，來源于擬南芥。本發(fā)明提供的DNA片段的核苷酸序列是如下1)或2)或3):1)序列表中序列1所示的核苷酸序列；2)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列；3)與所述1)的核苷酸序列具有65%以上的同源性且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。序列表中的序列1由319個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，是擬南芥基因AT4G12600和AT4G12590的基因間序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2,7%SDS)中，65°C預(yù)雜交30min；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖液，pH7.2,7%SDS，同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr；棄雜交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，ρΗ7·2,5%SDS)，65°C洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸鈉緩沖液，ρΗ7·2,1%SDS)，65°C洗膜30min。本發(fā)明的DNA片段(啟動(dòng)子活性片段)還包括與來自序列表中序列1的片段的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。這里使用的術(shù)語“互補(bǔ)的”系指遵循堿基配對(duì)原則產(chǎn)生的之辰、ο本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的調(diào)控片段的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的調(diào)控片段的核苷酸序列70%或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表達(dá)靶基因的啟動(dòng)子活性，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同源性，，指與天然核酸序列的序列相似性。“同源性，，包括與本發(fā)明的調(diào)控片段的核苷酸序列具有優(yōu)選地75%或更高，更優(yōu)選地85%或更高，甚至更優(yōu)選地90%或更高，以及最優(yōu)選地95%或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同源性。含有上述的DNA片段的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述重組載體是上述的DNA片段插入載體PM0A34-G/L的多克隆位點(diǎn)制成的重組載體；上述載體pM0A34-G/L具體可以是將⑶S基因和LUC基因分別插入pM0A34載體的多克隆位點(diǎn)得到的載體。含有上述的DNA片段的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。含有上述的DNA片段的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述的DNA片段在作為啟動(dòng)子中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。進(jìn)一步講，上述啟動(dòng)子是雙向啟動(dòng)子。上述應(yīng)用具體可以是上述的DNA片段在驅(qū)動(dòng)目的基因在植物體內(nèi)表達(dá)中的應(yīng)用。上述植物為雙子葉植物或單子葉植物，如擬南芥或煙草。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的BI⑶B2插入載體pM0A34-G/L中的⑶S和LUC之間后，BI⑶B2能啟動(dòng)⑶S表達(dá)；將BI⑶B2反向插入pM0A34_G/L中的⑶S和LUC之間后同樣能啟動(dòng)GUS表達(dá)，說明BIGDB2在擬南芥中具有雙向啟動(dòng)功能。圖1為pM0A34-G/L-BI⑶B2植物雙元載體圖譜。圖2為轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色結(jié)果，A是子葉期幼苗，B是兩片真葉的幼苗，C是花序。圖3為轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S分析結(jié)果。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、啟動(dòng)子的獲得及其檢測(cè)一、啟動(dòng)子的獲得根據(jù)生物信息學(xué)分析的結(jié)果，擬南芥基因組中存在一些潛在的雙向啟動(dòng)子序列。以擬南芥基因組DNA為模板，利用正向引物(Bi⑶B2-F:5'-GAGCTCTAGAGCGGCCGCTCTAAACCCTAATTATCTCTCTTTCTCGTC-3‘)和反向弓丨物(BIGDB2-R:5‘-ACGCGTCGACCCCGGGCTTCTTCTTCGTCTACGAGAGTTCTTTG-3‘)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分離，回收并連接到pEASY-Tl(全式金公司)克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-BLUE(AgilentTechnologies-StratageneProducts)中，經(jīng)測(cè)序后確定克隆載體正確，擴(kuò)增產(chǎn)物(命名為BIGDB2)的核苷酸序列如序列表中序列1所示。二、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、帶標(biāo)記基因的中間載體(pM0A34-G/L)的構(gòu)建以pCambial300_221(CAMBIA公司)載體為模版，禾U用引物GUS-F5‘-ACGCGTCGACATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAAC-3‘禾PGUS-R5'-CAGCCGACCGGTTCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3‘?dāng)U增出1812bp的GUS基因，經(jīng)測(cè)序后，通過SalI和AgeI雙酶切連接到pM0A34載體上(記載該材料的文獻(xiàn)是Barrell，P.J.andConner,A.J.(2006)MinimalT-DNAvectorssuitableforagriculturaldeploymentoftransgenicplants,公眾可從中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)，構(gòu)建成pM0A34_G中間載體。將pGL3_EnhancerVector(Promaga公司)經(jīng)XbalI(補(bǔ)平)和XhoI雙酶切后的產(chǎn)物L(fēng)UC基因與中間載體pM0A34-G經(jīng)SpeI(補(bǔ)平)和XhoI雙酶切后的載體進(jìn)行連接，獲得攜帶兩個(gè)標(biāo)記基因GUS和LUC的表達(dá)載體pM0A34-G/L。2、表達(dá)載體pM0A34-G/L-BIGDB2的構(gòu)建用SalI和NotI雙酶切步驟一驗(yàn)證正確的克隆載體和步驟二的步驟1得到的植物表達(dá)載體PM0A34-G/L，回收后經(jīng)T4DNA連接酶連接得到pM0A34-G/L_BI⑶B2植物表達(dá)載體(圖1)。3、表達(dá)載體pM0A34-G/L-BI⑶B2(反向)的構(gòu)建將pM0A34-G/L-BIGDB2中BIGDB2序列調(diào)轉(zhuǎn)方向，構(gòu)建成pM0A34_G/L_BIGDB2(反向)載體。以步驟一中帶有BI⑶B2基因正確序列的克隆載體為模板，利用引物BI⑶B2-F25'-GAGCGTCGACTCTAAACCCTAATTATCTCTCTTTCTCGTC-3'和BIGDB2-R25'-ACGCGCGGCCGCCTTCTTCTTCGTCTACGAGAGTTCTTTG-3‘，獲得BIGDB2反向片段，經(jīng)測(cè)序后用SalI和NotI雙酶切連接到步驟二的步驟1得到的植物表達(dá)載體PM0A34-G/L，得到pM0A34-G/L_BI⑶B2(反向)植物表達(dá)載體。三、轉(zhuǎn)化植物并培養(yǎng)1、導(dǎo)入農(nóng)桿菌通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將步驟二中的pM0A34-G/L-BI⑶B2陽性克隆導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，挑取重組農(nóng)桿菌單克隆菌落轉(zhuǎn)入3-4mlLB培養(yǎng)液中(含100μg/ml壯觀霉素和50μg/ml利福平)，28°C搖菌過夜。培養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)接于500mlLB(含100μg/ml壯觀霉素和50μg/ml利福平)，28°C搖菌過夜。當(dāng)菌液0D600值為1.0，收集菌液入離心管，4000rpm、20min，收集菌體。用新鮮配制的如下溶液重懸菌體溶劑為水，溶質(zhì)是壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)和蔗糖，其中，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(Fluka74385)的濃度為0.05%和蔗糖的質(zhì)量百分濃度為5%。2、轉(zhuǎn)化擬南芥選取抽苔期的野生型col-0生態(tài)型擬南芥(美國俄亥俄州立大學(xué)的生物資源中心(ABRC))健壯植株，通過真空滲透法將步驟1得到的農(nóng)桿菌導(dǎo)入擬南芥花中，用塑料膜覆蓋1天，保持濕潤。然后將處理過的擬南芥植株放于2225°C的光照條件下使其正常生長。收獲種子，干燥條件下保存待用。四、基因表達(dá)檢測(cè)1、轉(zhuǎn)基因擬南芥中⑶S、LUC的表達(dá)分析選取步驟三中10個(gè)不同株系的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子，于1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)并生長，分別取子葉期幼苗、兩片真葉的幼苗以及花序進(jìn)行GUS染色分析，GUS染色方法參見JeffersonRA,KavanaghΤΑ,BevanMW(1987)GUSfusions:b_glucuronidaseasasensitiveandveratilegenefusionmakerinhigherplants.EMBOJ6:3901_7，分析結(jié)果如圖2，轉(zhuǎn)基因植株中⑶S基因得到表達(dá)。選取⑶S基因有表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥，通過葉片噴灑底物的方法進(jìn)行LUC發(fā)光分析，結(jié)果并沒有如期觀察到熒光。鑒于我們選擇的LUC發(fā)光分析方法對(duì)于檢測(cè)葉片以外組織表達(dá)的LUC不靈敏，我們?cè)诓襟E二中將pM0A34-G/L-BI⑶B2中BI⑶B2序列調(diào)轉(zhuǎn)方向，構(gòu)建成PM0A34-G/L-BI⑶B2(反向)載體。將該植物表達(dá)載體通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105的介導(dǎo)轉(zhuǎn)入擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株后，進(jìn)行⑶S染色分析，分析結(jié)果如圖3，轉(zhuǎn)基因植株中GUS基因得到表達(dá)。權(quán)利要求1.一種DNA片段，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)或4):1)序列表中序列1的第1-319位所示的核苷酸序列；2)序列表中序列1所示的核苷酸序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與所述1)或2)的核苷酸序列雜交且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列；4)與所述1)或2)的核苷酸序列具有65%以上的同源性且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。2.如權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于所述核苷酸序列3)是與所述1)的核苷酸序列具有90%以上的同源性且具有啟動(dòng)子活性的核苷酸序列。3.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA片段的重組載體。4.如權(quán)利要求3所述的重組載體，其特征在于所述重組載體是權(quán)利要求1或2所述的DNA片段插入載體pM0A34-G/L的多克隆位點(diǎn)制成的重組載體；所述載體PM0A34-G/L是將GUS基因和LUC基因分別插入pM0A34載體的多克隆位點(diǎn)得到的載體。5.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA片段的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。6.含有權(quán)利要求1或2所述的DNA片段的重組菌。7.權(quán)利要求1或2所述的DNA片段在作為啟動(dòng)子中的應(yīng)用。8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述啟動(dòng)子是雙向啟動(dòng)子。9.如權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是權(quán)利要求1或2所述的DNA片段在驅(qū)動(dòng)目的基因在植物體內(nèi)表達(dá)中的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選為擬南芥。全文摘要本發(fā)明公開了一種植物雙向啟動(dòng)子BIGDB2。該啟動(dòng)子的核苷酸序列是序列表中序列1所示的核苷酸序列。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的BIGDB2插入載體pMOA34-G/L中的GUS和LUC之間后，BIGDB2能啟動(dòng)GUS表達(dá)；將BIGDB2反向插入pMOA34-G/L中的GUS和LUC之間后同樣能啟動(dòng)GUS表達(dá)，說明BIGDB2在擬南芥中具有雙向啟動(dòng)功能。文檔編號(hào)C12N15/63GK102453718SQ201010521550公開日2012年5月16日申請(qǐng)日期2010年10月27日優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日發(fā)明者夏然,謝旗申請(qǐng)人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所