專利名稱：甘藍型油菜BnCP51啟動子及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甘藍型油菜BnCP51基因啟動子(命名為PMP51，以下相同)，同時還涉及一種甘藍型油菜BnCP51啟動子的制備方法。本發(fā)明還涉及含有該啟動子或其實質(zhì)同源核苷酸序列的載體和涉及利用該啟動子在油菜及其它植物基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物基因啟動子是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)、含有順式作用元件的一段DNA序列，決定著下游基因轉(zhuǎn)錄的特異性、方向和效率，是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制和表達模式中最關(guān)鍵 的因子。此外，外源基因在植物細胞中表達是植物基因工程研究的關(guān)鍵，而外源基因的表達首先取決于其轉(zhuǎn)錄的啟動，在某種程度上，啟動子決定了基因表達的時空順序以及表達強度。因此，發(fā)掘和研究新型啟動子對于基因表達調(diào)控機制研究和轉(zhuǎn)基因研究具有非常重要的科學(xué)意義。通過對多種植物基因啟動子區(qū)的分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)功能蛋白基因的啟動子都具有共同的結(jié)構(gòu)模式，一般由啟動子核心元件和上游元件組成。位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-20—30bp處的TATA box為啟動子核心元件，是富含有AT的保守序列區(qū)，與DNA雙鏈的解鏈有關(guān)，并決定轉(zhuǎn)錄起始點的選擇，是絕大多數(shù)植物啟動子正確表達所必需的。TATAbox上游的保守序列稱為啟動子上游元件，包括上游_75bp處的CAAT box和-80—110bp附近的GC box等一般上游啟動子元件及其他特殊的上游元件，如茉莉酸類物質(zhì)應(yīng)答元件(JRE)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)等元件(張春曉等，植物基因啟動子研究進展。遺傳學(xué)報，2004，31(12) :1455-1464 ;路靜等，高等植物啟動子及其應(yīng)用研究進展。自然科學(xué)進展，2004，14(8) :856-862)。CAAT box是比較保守的序列，與RNA聚合酶的識別和結(jié)合有關(guān)，對基因轉(zhuǎn)錄有較強的激活作用。然而有些基因無此框，如禾谷類作物的貯藏蛋白基因中無CAAT框而被CATC框代替。GC box的保守序列是5 ‘GGGCGG3’，可有多個拷貝，并能以任何方向存在而不影響其功能(路靜，趙華燕，何奕昆，宋艷茹，高等植物啟動子及其應(yīng)用研究進展。自然科學(xué)進展，2004，14 (8) =856-862 ;夏江東，陳在全，吳渝生，季鵬章，高等植物啟動子功能和結(jié)構(gòu)研究進展。云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2006，21 (I) :7-14)。只要具有了這些保守的結(jié)構(gòu)框，那么就可以具有相應(yīng)的啟動下游基因表達的功能。根據(jù)植物啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為組成型啟動子、組織特異型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。組成型啟動子驅(qū)動的外源基因在轉(zhuǎn)基因植株的所有發(fā)育時期和組織中穩(wěn)定表達。對許多雙子葉植物的轉(zhuǎn)化，通常都使用來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子或來自細菌的胭脂氨酸合成酶nos啟動子的質(zhì)粒載體，而在單子葉植物轉(zhuǎn)化中最常用的是含有水稻肌動蛋白Act啟動子，玉米泛素Ubi啟動子及35S啟動子的質(zhì)粒載體(關(guān)麗英等，轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的有效表達及其安全評價。首都師范大學(xué)學(xué)報，2002，23 (2)52-56)。但是很多時候外源基因在受體植物中的持續(xù)高效表達不僅造成生物體內(nèi)能源的浪費，而且在所有組織中的表達有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉(zhuǎn)基因安全問題(JiaS-R. Environment and food biosafty assessment of transgenic plants. Advancedof Bioengineer. 1997,17:37-42 ；Morris S H, Adley C.C. Irish public perceptionsand attitudes to modern biotechnology an overview with a focus on GM foods.Trends in Biotechnology. 2001,19 :43-48)。因此,誘導(dǎo)型啟動子和組織特異性啟動子的研究和應(yīng)用日益受到育種工作者的重視。在轉(zhuǎn)基因植物中鑒定的誘導(dǎo)型啟動子主要包括非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動子，生物脅迫誘導(dǎo)型啟動子和激素誘導(dǎo)型啟動子等(聶麗娜等，植物基因啟動子的克隆及其功能研究進展。植物遺傳資源學(xué)報，2008，9(3) =385-391) 0但是誘導(dǎo)型啟動子的應(yīng)用也具有一定限制，對受體植物進行的外在條件處理，如熱激，激素處理等可能引起生物體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)而不利于植株的正常生長。此外，化學(xué)調(diào)控系統(tǒng)中用作誘導(dǎo)物的甲基脫氫皮質(zhì)醇(dex, dexamethasone)、雌二醇(estradiol)和四環(huán)素(tetracycline)都對生態(tài)環(huán)境有害，不宜用于生產(chǎn)實踐。使用植物體內(nèi)本身的組織特異性啟動子就可以避免這種問題，顯然，外源基因的組織特異性表達必將有效提高轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性。(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術(shù)通報，2007，(4)21-24)。近些年來，關(guān)于組織特異性啟動子研究取得了很大的進步，這些組織特異性啟動子主要包括葉片、韌皮部、維管束和根等器官特異表達啟動子和花粉、花器官、果實、種子等 生殖器官特異表達啟動子(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術(shù)通報，2007，(4) 21-24)。如Ariizumi等分離了 LTP12，XTH3和PGA4的啟動子并轉(zhuǎn)化擬南芥，GUS染色表明這3個啟動子為花藥特異表達啟動子，且在不同的時期表達存在差異(Ariizumiet al, Comparative study of promoter activity of three anther-specific genesencoding lipid transfer protein, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase andpolygalacturonase in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Cell Report. 2002,21:90-96)。在芝麻中克隆得到微粒體油酸脫氫酶基因(FAD2)的啟動子，預(yù)測分析顯示此啟動子中的E-box和G-box元件與三酰甘油的生物合成有關(guān)。通過轉(zhuǎn)化擬南芥后檢測⑶S基因表達,結(jié)果顯示該啟動子在種子中特異表達(Mi Jung Kim etal. Seed-specificexpression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled bycombinatorial properties between negative cis-regulatory elements in theSeFAD2 promoter and enhancers in the 5' -UTR intron. Molecular Genetics andGenomics. 2006,276 :351-368)。耿安奇等從白菜型油菜、甘藍型油菜、菜苔、甘藍中分離了 4個啟動子并轉(zhuǎn)化煙草，GUS染色分析其為花器官特異表達的啟動子(Geng etal.Expression analysis of four flower-specific promoters of Brassica spp. inthe heterogeneous host tobacco. African Journal of Biotechnology. 2009,8(20)5193-5200)。此外，Mariani等將煙草花藥絨氈層特異表達基因啟動子TA29與核酸酶基因Barnase、RnaseTl融合后轉(zhuǎn)化植物,核酸酶基因在花藥中特異表達,并破壞絨租層,獲得雄性不育煙草和油菜(Mariani C. etal. Induction of male sterility in plants by achimaeric ribonuclease gene. Nature, 1990, 347 :737-741)。目前 TA29 啟動子已在煙草、玉米、油菜、擬南芥、水稻等植物上應(yīng)用并獲得成功(宋揚等，植物組織特異性啟動子研究。生物技術(shù)通報，2007，(4) :21-24)。由此可見，即使不同的植物之間的體內(nèi)環(huán)境不同以及基因間存在互作差異，即使是與擬南芥性質(zhì)差異較大的植物，只要具有保守的核心啟動區(qū)域和相應(yīng)保守的調(diào)控元件，就可以在其他不同植物中發(fā)揮啟動下游基因表達的生物學(xué)功能。
近年來，對啟動子的功能研究，大量文獻報道采用的方法通常是先用生物信息學(xué)初步預(yù)測和分析啟動子序列后，再將啟動子片段與報告基因融合構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥、煙草、水稻等的離體培養(yǎng)細胞或植物體，再通過檢測報告基因在轉(zhuǎn)基因個體中的表達情況分析啟動子的功能并加以利用。大量的文獻報道顯示其他植物的啟動子轉(zhuǎn)化到上述植物中均可正常的行使其生物功能，如在芝麻中克隆的微粒體油酸脫氫酶基因(FAD2)的啟動子，此啟動子中的E-box和G-box元件與三酰甘油的生物合成有關(guān)。在轉(zhuǎn)基因擬南芥和其他轉(zhuǎn)基因植物中也顯示出了種子特異性的表達(Mi Jung Kim, HeejaKim, Mi Chung Suh.Seed-specific expression of sesame microsomal oleic aciddesaturase is controlled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2promoter and enhancers in the 5' -UTR intron.Molecular Genetics and Genomics. 2006, 276 (4) :351-368)。從玉米中克隆的 ZmGLUl基因啟動子，連接GUS報告基因后轉(zhuǎn)化至煙草中，檢測分析結(jié)果玉米的ZmGLUl啟動子驅(qū)動了 GUS 基因在煙草根部高效表達(Riliang Gu, Li Zhao, Guoying Wang. Isolation ofa maize beta—glucosidase gene promoter and characterization of its activityin transgenic tobacco. Plant Cell Reports. 2006,25(11) :1157-1165)。從馬鈴薯中分離的一個與乙醇脫氫酶非常相似的TDF511 (tran- script derived fragment)基因Stgan的啟動子。構(gòu)建Stgan啟動子-GUS融合表達載體轉(zhuǎn)化煙草，⑶S組織化學(xué)染色顯示該啟動子驅(qū)動基因在煙草莖結(jié)節(jié)處特異表達，可能參與塊莖形成過程(Trindade L M, etal. Isolation and functional characterization of a stolon specific promoter frompotato (Solanum tuberosum L.). Gene, 2003, 303 :77-84.)。以上這些報道都是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在不同的植物間進行啟動子功能分析的例子，這些實例表明利用模式植物擬南芥、煙草等作為載體，通過轉(zhuǎn)基因植株的表達分析證實來自于其他植物的啟動子的功能是被廣泛認可和接受的。
油菜作為中國主要的油料作物，在長江流域廣泛種植，對國計民生具有重要影響。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟，轉(zhuǎn)基因油菜必然會面臨轉(zhuǎn)基因安全風(fēng)險的輿論。用在油菜種子中完全不表達的啟動子來啟動目的基因的表達是解決這個問題的一個可行方法，既達到既提高油菜各方面品質(zhì)，又不引起食用油安全風(fēng)險的目的。因此，本發(fā)明開發(fā)了一個甘藍型油菜內(nèi)源啟動子。熒光定量PCR檢測表明該啟動子驅(qū)動的內(nèi)源基因在甘藍型油菜的根、莖、葉、角果中不表達，僅在花蕾中高量表達。通過檢測報告基因⑶S的表達特征證明啟動子驅(qū)動的基因在根、莖、葉片、角果中不表達，在花蕾中高量表達。我們的結(jié)果預(yù)示著該基因的啟動子在轉(zhuǎn)基因植物中具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的是提供了一種甘藍型油菜Pmp51啟動子，其優(yōu)點在于二個方面首先，來源于油菜內(nèi)源的組織特異性啟動子能夠精確定位所調(diào)控的基因，驅(qū)動目的基因在轉(zhuǎn)基因油菜的特定組織或時期表達，避免造成植物自身能源和物質(zhì)的浪費。其次，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達效率，限制其表達部位。因此，該啟動子可應(yīng)用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全轉(zhuǎn)基因研究。本發(fā)明的第二個目的是提供了一種甘藍型油菜Pmp51啟動子的制備方法。該方法以對甘藍型油菜基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得甘藍型油菜Pmp51序列。其優(yōu)點在于操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定可靠。
本發(fā)明的第三個目的是提供了一種含有植物高效表達啟動子的重組載體，其含有所述的啟動子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉(zhuǎn)化，所帶有的標記基因GUS表達強度高，容易檢測。通過這個載體轉(zhuǎn)化擬南芥可以獲得GUS基因在植物中高效表達的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明第四個目的是提供了一種甘藍型油菜Pmp51啟動子在花藥、花粉粒中的應(yīng)用。在該啟動子的驅(qū)動下，目的基因主要在植株的花藥中精細表達，在其它部位不表達。這一具有組織特異性表達的啟動子在植物創(chuàng)建不育系、人工創(chuàng)建種質(zhì)資源等基因工程和轉(zhuǎn)基因安全(食用、花粉漂流)中具有良好的應(yīng)用價值。為了完成上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案為了獲得本發(fā)明，發(fā)明人對油菜發(fā)育過程中的相關(guān)基因進行了深入和全面的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一種新的啟動子。該啟動子驅(qū)動的內(nèi)源基因在植物的花藥中高效表達。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，上述目的可以通過提供一種啟動子來實現(xiàn)，所述啟動子能夠特異性驅(qū)動下游基因在植物中高效表達，所述啟動子含有SEQ ID No. I核苷酸序列或與SEQ ID No. I實質(zhì)上同源的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供含有所述啟動子的核苷酸序列的重組載體來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述重組載體轉(zhuǎn)化的微生物來實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，上述目的可以通過提供用所述微生物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物來實現(xiàn)。I 一種甘藍型油菜啟動子Pmp51的制備方法，其步驟是I. I Pencp51驅(qū)動的內(nèi)源基因的表達模式本發(fā)明所用油菜為甘藍型油菜(Brassica napus L.)。供試材料播種于大田，正常
田間管理。從大田生長條件下生長的油菜植株上取根、莖、葉、花蕾，角果。每種材料至少取三個重復(fù)，每個重復(fù)至少一株，取樣后用錫箔紙包裹，迅速放置于液氮速凍中，_80°C保存。利用Trirol提取試劑盒(購自TaKaRa公司)的按照試劑盒的要求進行RNA的提取。熒光定量PCR儀為IQ5 (美國伯樂公司)，采用油菜Actin作為內(nèi)標基因(登錄號 AFl11812)，Actin 基因引物為 5 ' CTGGAATTGCTGACCGTATGAG3 '和 5 ' ATCTGTTGGAAAGTGCTGAGGG 3 '。Pmp51 驅(qū)動的內(nèi)源基因 BnCP51 引物為5' AGGACTCAAGGTGCTGTGACTCCTAT3'和 5' CTGAGAGAGACACTAAATTCCCTGTTT3'。熒光定量PCR反應(yīng)每組實驗均完成三個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)至少做三次技術(shù)重復(fù)。分別檢測Pmp51驅(qū)動的內(nèi)源基因在油菜組織(根、莖、葉、花、角果)中的表達。用比較Ct法(Λ Λ Ct)計算基因的相對表達量。通過2_Λ ΔΕ 估算目的基因的相對表達量和系統(tǒng)誤差(Kenneth J Livak. Thomas D Schmittgen. 2001,Analysis of RelativeGene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-Δ Δ CTMethod.METHODS 25,402-408)。在計算相對表達量時，以根的樣本為參照，即將其值轉(zhuǎn)換成I (標準值)，其它樣品再與其比較，獲得相對表達值。I. 2同源序列法克隆Pmp51序列I. 2. I油菜啟動子PBnCP51的引物序列根據(jù)油菜全基因組測序獲得的BnCP51基因上游2kb序列設(shè)計I對引物進行PCR擴增，采用的引物為 PBnCP51S 5 ' -(KpnI)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3 '和PBnCP51A 5/ -(XbaI)GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-S'。I. 2. 2油菜啟動子PBnCP51的制備利用SDS裂解法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取油菜葉片基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增， 步驟是提取基因組DNA 25μ 1，以此為模板進行擴增，反應(yīng)體系為50μ 1，分別添加IOXExTaq buffer 5 μ l，dNTP 4μ 1，5，引物 I μ 1，3，引物 I μ I,ExTaq O. 5 μ 1，DNA 模版 I μ I 約lOOng，ddH20 37. 5 μ I。根據(jù)油菜全基因組測序獲得的BnCP51基因上游2kb序列設(shè)計PCR所用引物為 PBnCP51S 5/ -(KpnI)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3 '和 PBnCP51A 5' -(XbaI)GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-S'。擴增產(chǎn)物大小為 1960bp，PCR 反應(yīng)程序為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，59°C I分鐘，72°C 2分鐘，33個循環(huán)，72°C 10分鐘，16°C 3小時，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0% (瓊脂糖凝膠/TE溶液質(zhì)量體積比，以下相同)瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同)純化回收后，連接到PMD18-T載體(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，熱激法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細胞(購自大連寶生物工程有限公司，以下相同)，涂布于含有氨芐青霉素50 μ g/mL(質(zhì)量體積比，以下相同)的LB固體培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，8克瓊脂依次溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升。分裝于500毫升三角瓶中，121 °C，6. 859 X 104Pa下高壓消毒20分鐘。分裝到培養(yǎng)皿中，4°C冷藏備用，以下相同)平板上，37°C培養(yǎng)過夜，挑選白斑6個，采用M13引物5 ‘TGTAAAACGACGGCCAGT3’和5 ‘CAGGAAACAGCTATGACC3’，做菌落PCR檢測。菌落PCR具體方法(以下相同)是用滅菌的牙簽挑取少量菌斑做模版，反應(yīng)體系為IOyL內(nèi)含10XTaq buffer (含MgCl2) I μ 1，
I.5mmol/L dNTP (10mmol/L) I μ L，5，引物(10 μ mol/L) 0. 5 μ I，3，弓丨物(10 μ mol/L) O. 5 μ 1，Taq (5U/μ 1)0. 5 μ I, ddH20 6·5μ1。反應(yīng)條件為 94°C 5 分鐘，94°C I 分鐘，55°C I 分鐘，72°C 2分鐘30秒，33個循環(huán)，72°C 10分鐘，擴增大小為1960bp，I. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測大小正確后。將PCR檢測大小正確的菌斑接種到含氨芐青霉素50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基(配方如下分別稱取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化鈉，溶解于蒸餾水中，定容于1000毫升，121 °C，6. 859X 104Pa下高壓消毒20分鐘，以下相同)，37°C下200r/min振蕩培養(yǎng)過夜，小量堿法(J.薩姆布魯克.D. W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)提取質(zhì)粒，I. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA大小正確后(為1960bp)，采用Kpn I/Xba I酶(2種酶購自TaKaRa公司，以下相同)切對質(zhì)粒進行雙酶切(以下相同)，酶切體系(以下相同)為10 μ 1，包含質(zhì)粒 DNA5y I, Kpn I 0. 5 μ I, Xba I O. 5 μ I, ddH20 4 μ 1，37°C過夜，I. 0% (前面已述)瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測正確的陽性重組克隆命名為pMD18-PMP51 (將目的片段Pmp51連入PMD18-T載體構(gòu)建而成，以下相同)，將pMD18-PBneP51送上海英駿公司進行測序，分析結(jié)果，得到PBnCP51全長序列，命名Pmp51。I. 3啟動子序列生物信息學(xué)分析將所克隆的BnCP51上游序列用啟動子核心元件和上游順式作用元件用啟動子預(yù)測軟件 http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter· html 和 PLACE(Higo et al.，Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)database (J). Nucleic AcidsResearch. 1999,27 :297 300. http://www. dna. affrc. go. jp/PLACE)進行預(yù)測。結(jié)果表明所克隆的啟動子序列含有TATA box核心啟動子序列，CAAT等上游啟動子元件和花特異表達兀件如 P0LLEN1LELAT52 (Bate N, Twell D. Functional architecture of a latepollen promoter pollen-specific transcription is developmentalIy regulatedby multiple stage-specific and codependent activator elements. Plant MolecularBiology. 1998,37,859-869.)和 GTGANTG10(Rogers HJ et al. Functional analysis ofcis-regulatory elements within the promoter of the tobacco late pollen geneglO. Plant Molecular Biology. 2001，45，577-585.)(圖 3)。 2 一種甘藍型油菜啟動子Pmp51在轉(zhuǎn)基因植株的花藥中的應(yīng)用，其步驟是2. I Pmp51植物表達載體的構(gòu)建和根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105 (購于上海滬尚生物科技有限公司，以下相同)的轉(zhuǎn)化構(gòu)建的重組載體是將質(zhì)粒pBI121 (購自TaKaRa公司，以下相同)上的35S啟動子用技術(shù)方案I中克隆得到Pmp51片段替換而來。為完成此目的，首先用Xbal/Kpn 1(前面已述)雙酶切克隆載體pMD18-PBnCP51的啟動子片段，同時用Xba Ι/Κρη I酶切pBI121 (Chen,P. Y. , Wang, C. K. , Soong, S. C. To, Κ. Y. Complete sequence of the binary vector pBI121and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants. Mol.Breed. 11,287-293)質(zhì)粒。酶切體系(前面已述)為10 μ I酶切反應(yīng)在37度培養(yǎng)箱中進行，約4-6個小時之后，用1.0% (前面已述)瓊脂糖膠電泳檢測。將克隆載體PMDIS-Pmp51酶切下的小片段(大小為1960bp，和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(約1400bp)用DNA凝膠回收試劑盒(前面已述)回收。按pMD18-PBnCP51酶切下的小片段和pBI121(前面已述)酶切下的大片段(150ng小失片段50ng大片段)=3:1的比例(摩爾濃度比)混合樣品，加入T4 DNA連接酶I μ 1，10X反應(yīng)緩沖液I μ 1，無菌的ddH20補充體積至10 μ L，16°C連接過夜。熱激法(前面已述)轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細胞(前面述)后，在含有卡那霉素(50yg/mL)的固體LB培養(yǎng)基(前面述)平板上篩選，挑取白色菌斑做菌落PCR (前面述)，提取質(zhì)粒(前面已述)，經(jīng)酶切驗證大小正確(酶切小片段為1960bp)的重組質(zhì)粒命名為ρΒΙ-ΡΜΡ51。為了確保載體中啟動子的序列信息，利用凍融法(J.薩姆布魯克.D.W.拉塞爾著，黃培堂等譯分子克隆試驗指南(第三版)科學(xué)出版社，以下相同)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌ΕΗΑ105(前面已述)步驟如下I :取0. 2ml感受態(tài)農(nóng)桿菌，于冰中緩慢融化。2 :加入約2 μ g重組質(zhì)粒DNA，輕輕混勻，冰浴30min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C水浴5min，融化細胞。3 :加入800 μ I不含抗生素LB液體培養(yǎng)基(前面已述)，28°C輕搖培養(yǎng)4_5h。4 :12000rpm，30s，去上清，細胞重懸于0. 2ml LB液體培養(yǎng)基(前面已述)培養(yǎng)基。5 :將培養(yǎng)物均勻涂布在含 Ri f (50mg/L)，Str (50mg/L)和 Kan (50mg/L)的 LB 固體培養(yǎng)基(前面已述)瓊脂板上，28°C培養(yǎng)2天，待平板上出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子后挑菌檢測)將PBI-Pmp51轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105(購自大連寶生物生物制品有限公司，以下相同)，用卡那霉素(50 μ g/mL)和利福平(50 μ g/mL)雙抗性平板篩選，挑取菌斑，菌落PCR檢測驗證(前面已述)。2. 2 PBnCP51 的功能分析2. 2. I Pmp51植物表達載體PBI-Pmp5I在擬南芥中的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株篩選米用花序侵染法(ZhangX. R. et al. Agrobacterium-mediated transformationof Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006,1 :1-6,以下相同)進行擬南芥轉(zhuǎn)化。制備含有重組載體PBI-Pmp51的根癌農(nóng)桿菌EHA105(前面已述)菌液，在轉(zhuǎn)化前一天轉(zhuǎn)入含有卡那霉素50 μ g/ml、利福平50 μ g/ml的LB液體培養(yǎng)基((前面已述)中，28°C過夜培養(yǎng)。第二天，用紫外分光光度計(SPEK0L1300)于276nm納米波長下檢測菌液的吸光值，當(dāng)菌液的吸光值達到在I. 6-2. O之間時取出。室溫(20-25°C，以下相同) 以4000g離心lOmin，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%蔗糖溶液(蔗糖與蒸餾水的質(zhì)量體積比，以下相同)中。將渾濁的蔗糖溶液倒入一大培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)化前加入終濃度為0.02%(體積比)的Silwet 1-77(購自北京五洲元業(yè)科貿(mào)中心，以下相同)。混勻后把待轉(zhuǎn)化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，默數(shù)15秒，取出植株。轉(zhuǎn)化后的植株用一個黑色塑料袋包好，放在生長箱培養(yǎng)。第二天將塑料袋揭開，放在光強的地方培養(yǎng)。隔一周再做一次轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)一個月左右收獲種子，種子在培養(yǎng)箱或者日光下干燥3-5天。將轉(zhuǎn)化收獲的TO代種子用70% (體積比)酒精和0.1% (質(zhì)量比)的升汞分別表面消毒3分鐘和10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數(shù)次(5 7次)，然后均勻地吹打到含有濃度為50mg/L卡那霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基(MS大量元素母液100ml ；MS微量元素母液10ml ；MS有機母液10ml ；MS鐵鹽IOml ;肌醇IOml ;蔗糖30g ;用IM NaOH調(diào)PH至5. 8，12g瓊脂粉，定容至1L，高壓121度滅菌后備用。加入Sg瓊脂粉可配置成固體培養(yǎng)基。各種母液配方見表I)表面。4°C春化4-6天，放入恒溫培養(yǎng)箱(光周期16 (白天)/8 (黑暗)小時，溫度白天22°C，暗周期20°C )培養(yǎng)，篩選得到的轉(zhuǎn)化植株，稱Tl代轉(zhuǎn)化植株(以下相同)。根據(jù)表達載體上特有的卡那霉素抗性篩選陽性植株。葉片長到足夠大小時(3-4葉期)，取少許綠苗葉片，提取DNA，進行轉(zhuǎn)化材料的PCR陽性檢測(以下相同)。引物為NPT IIF :5‘GATGGATTGCACGCAGGT3’和NPTIIR 5‘TCAGAAGAACTCGTCAAG3’，反應(yīng)體系為 10 μ I 內(nèi)含模板DNA模板 I μ L (約 100ng), IOXTaq^1打61"(含]\%(12)14 1，1.511111101/1 dNTP (10mmol/L) I μ 1，5’ 引物(10 μ mol/L) 0. 5 μ 1，3，引物(10ymol/L)0· 5μ 1，Taq(5U/y 1)0. 5μ 1，ddH20 5. 5 μ L· 反應(yīng)條件為 94°C 5 分鐘，94°C 30秒，55°C 30秒，72°C I分鐘，32個循環(huán)，72°C 10分鐘，擴增大小為800bp。結(jié)果表明獲得了轉(zhuǎn)基因陽性植株(含有檢測目的片段的植株稱陽性植株，以下相同)。表I MS培養(yǎng)基母液配方
權(quán)利要求
1.一種分離的啟動子Pmp51，其序列為SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.含有權(quán)利要求I所述的啟動子的重組載體ρΒΙ-Λμβ。
3.權(quán)利要求I所述的一種甘藍型油菜啟動子/的制備方法，其步驟是 (O油菜啟動子的引物序列 根據(jù)油菜全基因組測序獲得的他^°況基因上游2kb序列設(shè)計I對引物進行PCR擴增，擴增獲得油菜況的5’上游啟動子序列，所用引物為PBnCP51S:5 ' -(Kpn I)CGGGGTACCGGTAAAATCTCTTGTAGCCCGT-3’ 和PBnCP51A :5' - (XbaI) GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3 '； (2)油菜啟動子Pmp51的制備 根據(jù)油菜全基因組測序獲得的況的5’上游2kb序列設(shè)計所用的引物PBnCP51S 5' -(Kpn I)CGGGGTACCGGTAAMTCTCTTGTAGCCCGT-3’和PBnCP51A :5' - (Xba I) GACATCTAGATTTTTTGTTTGTTTTGGGGAA-3，利用SDS裂解法提取油菜葉片基因組DNA，以此為模板進行PCR擴增，步驟是提取油菜基因組DNA 25 μ 1，以此為模板進行擴增，反應(yīng)體系為50 μ I,分別添加 IOXEx Taq buffer 5 μ 1，dNTP 4 μ 1，5’ 引物 I μ 1，3’ 引物 I μ 1，ExTaqO.5 μ 1，DNA 模版 I μ I 約 IOOng, ddH20 37. 5 μ 1，擴增產(chǎn)物大小為 1960 bp, PCR 反應(yīng)程序為94°C 5分鐘，94°C I分鐘，59°C I分鐘，72°C 2分鐘，33個循環(huán)，72°C 10分鐘，16°C3小時，PCR產(chǎn)物經(jīng)I. 0%質(zhì)量體積比瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒純化回收后，連接到pMD18-T載體，熱激法轉(zhuǎn)化gold菌株的感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，PCR檢測陽性和酶切驗證后測序，得到目的基因上游2kb側(cè)翼序列，經(jīng)過生物信息學(xué)分析此序列為feCFW的啟動子全長序列，命名為PBnCP5i。
4.權(quán)利要求I中所述的一種分離的啟動子在擬南芥花藥中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求I中所述的一種分離的啟動子在擬南芥花粉粒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘藍型油菜BnCP51啟動子及制備方法和應(yīng)用。其步驟 A、根據(jù)油菜全基因組測序獲得的BnCP51基因上游2kb序列設(shè)計引物進行PCR，獲得油菜BnCP51的5’上游啟動子序列；B、根據(jù)油菜全基因組測序獲得的BnCP51的5’上游2kb序列設(shè)計引物，提取油菜葉片基因組DNA，進行PCR擴增，純化回收后，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，PCR檢測陽性和酶切驗證后測序，得到目的基因上游2kb側(cè)翼序列，為PBnCP51。PBnCP51在油菜花藥、花粉粒中高效表達，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達效率，可用于植物的基因工程研究和籽用油菜安全轉(zhuǎn)基因研究。
文檔編號C12N15/113GK102634516SQ20121009034
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月30日
發(fā)明者劉婷婷, 劉勝毅, 劉越英, 李振波, 董彩華, 陽永學(xué), 黃軍艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所