一種將多個外源基因同時克隆到微生物基因組的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種將多個外源基因同時克隆到微生物基因組的方法，是將多個外源基因先導入多個雙向基因表達載體，再將多個雙向基因表達載體同時導入宿主微生物。每個雙向基因表達載體均包括雙向終止子和雙向啟動子；除第一個雙向基因表達載體和最后一個雙向基因表達載體外，其他每個雙向基因表達載體雙向終止子的3’末端和下一個雙向基因表達載體雙向終止子的5’末端具有相同的同源臂，第一個雙向基因表達載體雙向終止子的5’末端及最后一個雙向基因表達載體雙向終止子的3’末端均可以與宿主微生物的基因組發(fā)生同源重組。通過該方法，建立了一種將整個基因表達過程，包括表達設計、克隆設計、宿主細胞改造等過程有機地組合起來的新技術。
【專利說明】-種將多個外源基因同時克隆到微生物基因組的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種將多個外源基因同時克隆到微生物基因組的 方法。

【背景技術】
[0002] 微生物DNA的改造，包括目標基因的敲除與過表達是基因工程領域的核心內容。 一個或兩個基因在目標微生物中的表達通過現(xiàn)有技術不難實現(xiàn)，然而，多基因（兩個以上） 的表達依據(jù)現(xiàn)有技術尚存在許多難題，如克隆周期長、工作量大、成功率低、基因表達數(shù)量 上限低等。尤其是真核生物的基因表達，一般每個基因都需要單獨的啟動子與終止子，使得 一個基因表達就需要進行3次克隆，若進行多基因表達，如6個基因表達，就需要進行18次 基因克隆，這種情況對于使用傳統(tǒng)方法來說很難實現(xiàn)且極為費時。
[0003] 目前，一些新興的克隆技術，如Gateway重組技術、Gibson組裝技術和Golden gate技術等雖然能夠在一定程度上提高克隆的效率，但其在應用上也各自存在一定的短板 或限制。更為重要的是，這些新方法只是針對基因克隆這一個技術環(huán)節(jié)，在序列設計、表達 設計以及轉化宿主細胞等方面并未提供任何幫助。因此，需要一種新技術將整個基因表達 過程，包括表達設計、克隆設計、宿主細胞改造等過程有機地組合起來，實現(xiàn)多基因的快速、 高效表達，同時能夠降低操作入門門檻，減少培訓學習時間，降低操作成本。
[0004] 目前許多涉及基因表達的專利技術或工具載體（質粒）能夠實現(xiàn)一到兩個基因的 快速表達。但是這些專利中的載體一般是發(fā)明人構建好的帶有固定啟動子或其它轉錄元 件，只能以固定的強度進行目標基因的表達。而當前基因工程改造工作中經常需要多基因 的協(xié)調配合，即需要各基因表達強度依據(jù)設計者意愿產生差別，這是現(xiàn)有工具載體或技術 難以實現(xiàn)的，而本技術將解決這一難題。
[0005] 另外，芹菜素具有抗腫瘤、改善心腦供血、抗炎癥、降血壓、抗焦慮、抗菌抗病毒以 及抗氧化等生理功能。釀酒酵母自身不能產生芹菜素，轉化芹菜素合成基因（PAL、C4H、4CL、 CHSXHI及FSII)后即可由苯丙氨酸合成芹菜素。因此，需要一種能夠將芹菜素合成基因 快速導入釀酒酵母的方法。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術的不足之處，提供一種將多個外源基因同時克隆到 微生物基因組，實現(xiàn)多基因表達及微生物基因改造的方法。
[0007] 本發(fā)明提供了一種將多個外源基因同時克隆到微生物基因組的方法，包括如下步 驟：將多個外源基因先導入多個雙向基因表達載體，再將多個雙向基因表達載體同時導入 宿主微生物，得到表達多個外源基因的重組微生物；
[0008] 所述每個雙向基因表達載體均包括一個雙向終止子和一個雙向啟動子；每個雙向 基因表達載體導入兩個外源基因；
[0009] 除第一個雙向基因表達載體和最后一個雙向基因表達載體外，其他每個雙向基因 表達載體的3'末端和下一個雙向基因表達載體的5'末端具有相同的同源臂，所述第一個 雙向基因表達載體的5'末端具有同源臂甲，所述最后一個雙向基因表達載體的3'末端具 有同源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以與宿主微生物的基因組發(fā)生同源重組。 [0010] 進一步，所述宿主微生物為酵母；優(yōu)選為釀酒酵母，更優(yōu)選為釀酒酵母W303。
[0011] 所述多個外源基因為4CL、CHS、CHI、FSII、PAL、C4H基因，其基因序列依次如序列 表 SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11 所示。
[0012] 所述雙向基因表達載體有三個，第一雙向基因表達載體包括如序列表中SEQ ID N0:l所示的雙向終止子Tl(TPIl-PGIt)，及序列表中SEQIDN0:4所示的雙向啟動子 P1(TDH3-ADH1);第二雙向基因表達載體包括如序列表中SEQ ID N0:2所示的雙向終止子 T2(ADHlt-CYClt)，及序列表中SEQ ID N0:5所示的雙向啟動子P2(PGK1-TEF2);第三雙向 基因表達載體包括如序列表中SEQ ID勵:3所示的雙向終止子了3&?8八1-切0(：1)，及序列表 中SEQ ID勵:4所示的雙向啟動子？1〇1)!13-40!11)。
[0013] 其中，第一雙向基因表達載體的雙向終止子Tl (TPIl-PGIt)，如序列表SEQ ID NO: 1所示，自5'末端第1131位至1180位的核苷酸，與第二雙向基因表達載體的雙向終止 子T2 (ADHlt-CYClt)，如序列表SEQ ID NO: 2所示，自5'末端第1位至150位的核苷酸均為 同源臂L2。
[0014] 第二雙向基因表達載體的雙向終止子T2(ADHlt-CYClt)，如序列表SEQ ID N0:2 所示，自5'末端第627位至776位的核苷酸，與第三雙向基因表達載體的雙向終止子 T3(tFBAl-troCl)，如序列表SEQ ID N0:4所示，自5'末端第1位至150位的核苷酸均為同 源臂L3。
[0015] 所述第一雙向基因表達載體還包括所述4CL、CHS基因；所述第二雙向基因表達載 體還包括所述CHI、FSII基因；所述第三雙向基因表達載體還包括所述PAL、C4H基因。 [0016] 上述方法中，第一雙向基因表達載體、第二雙向基因表達載體、第三雙向基因表達 載體的制備包括以下步驟：
[0017] (1)、合成序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3所示的雙向終止 子 Tl (TPII-PGIt)、雙向終止子 T2 (ADHlt-CYClt)、雙向終止子 T3 (tFBAl-tPDCl)，分別由 1180、776、963個堿基組成；合成序列表中SEQ ID N0:4所示的雙向啟動子P1(TDH3-ADH1)、 序列表中SEQ ID NO: 5所示的雙向啟動子P2(PGK1-TEF2)，分別由1418、1312個堿基組成。
[0018] (2)、將雙向終止子Tl (TPII-PGIt)、雙向終止子T2 (ADHlt-CYClt)、雙向終止子 T3 (tFBAl-tPDCl)分別連接在pUC57-Kan質粒上，得到重組表達載體P-Tl (TPIl-PGIt)、 P-T2 (ADHlt-CYClt)、p-T3(tFBAl-tPDCl);將雙向啟動子 Pl (TDH3-ADH1)、雙向啟動 子P2 (PGK1-TEF2)連接到PMD18-T質粒上得到重組表達載體PMD-Pl (TDH3-ADH1)、 PMD-P2(PGK1-TEF2)。
[0019] (3)、合成序列表中 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID勵:11所示的4(^、0^、011、？511、？六1^、〇4!1基因，上述基因都來自于菊 科植物短葶飛蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz，其優(yōu)化后具有釀酒酵母偏愛密 碼子的基因序列，分別由1624、1199、718、1562、2136、2136個堿基組成。
[0020] (4)、以步驟⑵所得的重組表達載體P-Tl (TPIl-PGIt)、p-T3(tFBAl-tPDCl)及宿 主微生物釀酒酵母基因組為模板，構建同源臂甲LU同源臂乙L4,整合位點Sitel、Site2， 標記基因 HIS片段及重疊片段Sitel-His-Ll和Site2-L4。
[0021] (5)、構建第一雙向基因表達載體P-Tl (4CL-CHS)、第二雙向基因表達載體 P-T2 (CHI-FSII)和第三雙向基因表達載體p-T3(PAL-C4H);
[0022] 將雙向終止子Tl (TPIl-PGIt)、雙向啟動子Pl (TDH3-ADH1)和4CL、CHS基因連接 構成第一雙向基因表達載體P-Tl (4CL-CHS);
[0023] 將雙向終止子T2 (ADHlt-CYClt)、雙向啟動子P2(PGK1-TEF2)和CHI、FSII基因連 接構成第二雙向基因表達載體P-T2 (CHI-FSII);
[0024] 將雙向終止子T3(tFBAl-tPDCl)、雙向啟動子P1(TDH3-ADH1)和PAL、C4H基因連 接構成第三雙向基因表達載體P-T3 (PAL-C4H)。
[0025] 進一步，所述三個雙向基因表達載體同時導入宿主微生物釀酒酵母《303,得到重 組微生物命名為重組釀酒酵母W303-1。
[0026] 所述重組釀酒酵母W303-1為表達核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:6-ll所示的 DNA片段的重組釀酒酵母。
[0027] 本發(fā)明提供了一種在微生物體內將多個外源基因一步整合到基因組上的方法，通 過同源重組的原理，利用雙向基因表達載體，將所需要的多個基因表達載體同時導入宿主 細胞中，建立了一種將整個基因表達過程，包括表達設計、克隆設計、宿主細胞改造等過程 有機地組合起來的新技術，實現(xiàn)了多基因的快速、高效表達，避免了多次轉化及載體構建所 帶來的麻煩。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖 1 為 PUC57-Kan 質粒。
[0029] 圖2為重組表達載體P-Tl (TPIl-PGIt)質粒。
[0030] 圖3為重組表達載體ρ-Τ2 (ADHlt-CYClt)質粒。
[0031] 圖4為重組表達載體ρ-Τ3 (tFBAl-tPDCl)質粒。
[0032] 圖 5 為 PMDl8-T 質粒。
[0033] 圖6為重組表達載體PMD-Pl (TDH3-ADH1)質粒。
[0034] 圖7為重組表達載體PMD-P2 (PGK1-TEF2)質粒。
[0035] 圖8為實施例4中同源臂LI、L4,整合位點Sitel、Site2,標記基因 HIS片段PCR 擴增后的瓊脂糖凝膠電泳純化的結果。
[0036] 圖9為實施例5中重疊片段Sitel-His-Ll和Site2_L4PCR擴增后的瓊脂糖凝膠 電泳結果。
[0037] 圖10為實施例6中引入酶切位點PCR擴增后PAL、C4H基因 PCR擴增后的瓊脂糖 凝膠電泳結果。
[0038] 圖11為實施例6中引入酶切位點PCR擴增4CL、CHS、CHI、FSII基因的瓊脂糖凝 膠電泳結果。
[0039] 圖12為實施例6中引入酶切位點PCR擴增后雙向終止子基因 Tl (TPIl-PGIt)、 T2 (ADHlt-CYClt)、T3 (tFBAl-tPDCl)的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0040] 圖13為實施例6中引入酶切位點PCR擴增后雙向啟動子基因 Pl (TDH3-ADH1)、 P2 (PGK1-TEF2)的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0041] 圖14為實施例6中大腸桿菌PCR擴增4CL、CHS基因的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0042] 圖15為實施例6中大腸桿菌PCR擴增CHI、FSII基因的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0043] 圖16為實施例6中大腸桿菌PCR擴增PAL、C4H基因的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0044] 圖 17 為實施例 6 中擴大培養(yǎng)后 P-Tl (4CL-CHS)、p-T2 (CHI-FSII)、p-T3 (PAL-C4H) 的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0045] 圖18為實施例7中PCR擴增后Tl (4CL-CHS)、T2 (CHI-FSII)的瓊脂糖凝膠電泳結 果。
[0046] 圖19為實施例7中PCR擴增后Τ3 (PAL-C4H)的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0047] 圖20為實施例9中重組釀酒酵母W303-1基因組PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳結果。

【具體實施方式】
[0048] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0049] 實施例1雙向終止子、雙向啟動子的合成
[0050] (1)雙向終止子的合成
[0051] 合成序列表中SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID Ν0:3所示的雙向終止子 Tl (ΤΡΙ I-PGIt)、雙向終止子 Τ2 (ADHlt-CYClt)、雙向終止子 Τ3 (tFBAl-tPDCl)，分別由 1180、776、963個堿基組成。其中，第一雙向基因表達載體的雙向終止子Tl(TPIl-PGIt)In 序列表SEQ ID NO: 1所示，自5'末端第1031位至1180位的核苷酸，與第二雙向基因表達 載體的雙向終止子T2 (ADHlt-CYClt)，如序列表SEQ ID NO: 2所示，自5'末端第1位至150 位的核苷酸均為同源臂L2。第二雙向基因表達載體的雙向終止子T2 (ADHlt-CYClt)，如序 列表SEQ ID NO:2所示，自5'末端第627位至776位的核苷酸，與第三雙向基因表達載體 的雙向終止子T3(tFBAl-troCl)，如序列表SEQ ID N0:4所示，自5'末端第1位至150位的 核苷酸為均同源臂L3。
[0052] (2)雙向啟動子的合成
[0053] 合成序列表中SEQ ID NO:4所示的雙向啟動子Pl (TDH3-ADH1)、序列表中SEQ ID NO: 5所示的雙向啟動子P2 (PGK1-TEF2)，分別由1418、1312個堿基組成。
[0054] 實施例 2 構建 P-Tl(TPIl-PGIt)質粒、ρ-Τ2 (ADHlt-CYClt)質粒、 p-T3(tFBAl-tPDCl)質粒、PMD-Pl (TDH3-ADH1)質粒、PMD-P2(PGK1-TEF2)質粒
[0055] 將雙向終止子Tl (TPIl-PGIt)、雙向終止子T2 (ADHlt-CYClt)、雙向終止子 T3 (tFBAl-tPDCl)分別連接在pUC57-Kan質粒（如圖1所示）上，得到重組表達載體 P-Tl (TPI I-PGIt)(如圖 2 所示）、ρ-Τ2 (ADHlt-CYClt)(如圖 3 所示）、ρ-Τ3 (tFBAl-troCl) (如圖4所示）。將雙向啟動子Pl (TDH3-ADH1)、雙向啟動子P2 (PGK1-TEF2)連接到 PMD18-T質粒（如圖5所示）上得到重組表達載體PMD-Pl (TDH3-ADH1)(如圖6所示）、 PMD-P2 (PGK1-TEF2)(如圖 7 所示）。
[0056] 實施例3目的基因的合成
[0057]合成序列表中 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11所示的4(^、〇^、〇11、？511、？41^、04!1基因，上述基因都來自于菊科植 物短葶飛蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand-Mazz，其優(yōu)化后具有釀酒酵母偏愛密碼子 的基因序列，分別由1624、1199、718、1562、2136、2136個堿基組成。
[0058] 實施例4同源臂LI、L4,整合位點Sitel、Site2,標記基因 HIS片段的構建
[0059] ⑴引物設計：
[0060] LI -Fo: 5 ' -TCCCTCCACCAAAGGTGTTCTTATGTAGCCCCGGTCCGTTTGTTCTAT-3 '
[0061] LI -Ro: 5 ' -CTCGAGAGGCAATTTTAGAGGGGACTTC-3 '
[0062] L4-Fo: 5，-CCAGACGATACAGAGGCTAAGA-3，；
[0063] L4-Ro: 5 ' -CCACTTTTGTTGGGGACGATTAGGTTCCAACTGCTCTTACTGT-3 '
[0064] Sitel-Fo:5, -GTCGGTCGACTGTGCACAAAGGCCATAATAT-3，
[0065] Sitel-Ro:5' -TCGGAAGAGGTTTTGTCATCCGAAGGCATGAGTTATGGTTGCACA-3'
[0066] Site2-Fo: 5，-TACAGTAAGAGCAGTTGGAACCTAATCGTCCCCAACAAAAGTGGGCT-3'
[0067] Site2-Ro: 5，-AAAGCTGGCTCCCCTTAGACAAATACGCTA-3'
[0068] HI S-Fo: 5，-AACCATAACTCATGCCTTCGGATGACAAAACCTCTTCCGATAAAAACA-3 '
[0069] HI S-Ro: 5，-TAGAACAAACGGACCGGGGCTACATAAGAACACCTTTGGTGGAGGGA-3，
[0070] (2) PCR 反應體系：
[0071]

【權利要求】
1. 一種將多個外源基因同時克隆到微生物基因組的方法，其特征在于：將多個外源基 因先導入多個雙向基因表達載體，再將多個雙向基因表達載體同時導入宿主微生物，得到 表達多個外源基因的重組微生物； 所述每個雙向基因表達載體均包括一個雙向終止子和一個雙向啟動子；每個雙向基因 表達載體導入兩個外源基因； 除第一個雙向基因表達載體和最后一個雙向基因表達載體外，其他每個雙向基因表達 載體的3'末端和下一個雙向基因表達載體的5'末端具有相同的同源臂，所述第一個雙向 基因表達載體的5'末端具有同源臂甲，所述最后一個雙向基因表達載體的3'末端具有同 源臂乙，所述同源臂甲和所述同源臂乙均可以與宿主微生物的基因組發(fā)生同源重組。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述宿主微生物為酵母；優(yōu)選為釀酒酵母， 更優(yōu)選為釀酒酵母W303。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于：所述雙向基因表達載體有三個，第一雙向基 因表達載體包括如序列表中SEQ ID N0:1所示的雙向終止子T1，及序列表中SEQ ID N0:4 所示的雙向啟動子PI ;第二雙向基因表達載體包括如序列表中SEQ ID N0:2所示的雙向終 止子T2,及序列表中SEQ ID N0:5所示的雙向啟動子P2;第三雙向基因表達載體包括如序 列表中SEQ ID N0:3所示的雙向終止子T3,及序列表中SEQ ID N0:4所示的雙向啟動子P1。
4. 如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于：所述多個外源基因為4CL、CHS、 〇11、？511、？41、〇411基因，其基因序列依次如序列表5￡0 10勵:6、5￡0 10勵:7、5￡0 10 N0:8、SEQIDN0:9、SEQIDN0:10、SEQIDN0:lim*。
5. -種DNA片段，其核苷酸序列為序列表中SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、 SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5的任一項的全部或部分。
6. 攜帶并表達核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5的任一項所述DNA片段的重組表達載體。
7. 所述權利要求6所述的重組表達載體，其特征在于： 所述重組表達載體是由序列表中SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所述 DNA片段連接在pUC57-Kan質粒上得到的； 或者，所述重組表達載體是由序列表中SEQ ID NO:4或SEQ ID NO: 5所述DNA片段連 接在PMD18-T質粒上得到的。
8. 如權利要求3中所述方法中得到的第一雙向基因表達載體或第二雙向基因表達載 體或第三雙向基因表達載體。
9. 如權利要求1-4中任一項所述方法得到的重組微生物。
【文檔編號】C12N15/81GK104404077SQ201410621447
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月6日 優(yōu)先權日:2014年11月6日
【發(fā)明者】江會鋒, 阮江星, 丁文濤, 許則灘, 馬永碩, 盧麗娜, 董揚, 馬延和 申請人:中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所