專(zhuān)利名稱(chēng)：一種磁珠與發(fā)光體共標(biāo)記以檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)相關(guān)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒，特別涉及一種磁珠與發(fā)光體共標(biāo)記以檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒。
背景技術(shù)：
遺傳性耳聾是通過(guò)遺傳由父母?jìng)鹘o其子女。不論父母方中的單方或者雙方是耳聾患者還是健康攜帶者，耳聾基因都會(huì)通過(guò)父母向子女遺傳。這種疾病通過(guò)常染色體顯性、常染色體隱性、X-連鎖隱性，或者線粒體遺傳等方式遺傳給下一代。大約0.的孩子生來(lái)具有深度耳聾，超過(guò)50%的語(yǔ)前耳聾患兒屬于遺傳因素致聾，通過(guò)對(duì)基因突變的識(shí)別不僅可用于遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷和新生兒聽(tīng)力篩查，還可以幫助和提醒醫(yī)生慎重使用特定種類(lèi)的抗生素以避免造成攜帶基因突變的患者聽(tīng)力損傷甚至致聾。近幾年微陣列芯片技術(shù)的發(fā)展使得高通量地并行分析成千上萬(wàn)的分子相互作用成為可能。DNA微陣列芯片方法已被廣泛使用，包括基因表達(dá)分析、突變分型、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)，對(duì)藥物開(kāi)發(fā)、疾病診斷和司法鑒定起到重要作用 (Heller, Ann Rev Biomed Eng (2002) 4 :129-153 ；Stoughton, Ann Rev Biochem(2005) 74 53-82 ；Hoheisel, Nat Rev Genet (2006) 7 :200-210) 固定于微陣列芯片的特定核苷酸探針，充當(dāng)解碼工具，通過(guò)空間上不同的位置把溶液中并行反應(yīng)產(chǎn)生的多個(gè)靶標(biāo)分子加以區(qū)別(Zhu et al.，Antimicrob Agents Chemother (2007) 51 :3707-3713)。這些探針甚至可以是通用探針，比如通用芯片上經(jīng)過(guò)設(shè)計(jì)與人工合成的人造標(biāo)簽(Tag)序列或者相互補(bǔ)的 歹Ij (Gerrey et al. ， J Mol Biol (1999) 292 :251-262 ；Li et al. ， Hum Mutat (2008) 29 306-314)。微陣列芯片方法與多重PCR結(jié)合在一起，可用于檢測(cè)SNP與基因突變，包括堿基刪除、插入、以及長(zhǎng)片段缺失，適用于常規(guī)的遺傳和診斷實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。與此同時(shí)，蛋白芯片和化學(xué)芯片也已經(jīng)發(fā)展成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域兩個(gè)重要的工具(Xu and Lam, J Biomed Biotechnol (2003) 5 :257-266)。特定的蛋白質(zhì)、抗體、小分子化合物、多肽及碳水化合物都可以固定在固體表面形成微陣列芯片，類(lèi)似于DNA微陣列芯片。這些分子的微陣列芯片可以用于分析單一的分子組成或者復(fù)雜的分子組成。待檢樣本和固定在微陣列芯片表面的探針之間的相互作用可以通過(guò)多種方法加以檢測(cè)。通常情況下，微陣列芯片的檢測(cè)方法有基于熒光、化學(xué)發(fā)光或酶連標(biāo)記的光學(xué)檢測(cè)方法，基于酶標(biāo)記、二茂鐵標(biāo)記或其他電活性標(biāo)記的電化學(xué)檢測(cè)方法，以及基于表面等離子共振技術(shù)或微天平分析技術(shù)的無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)方法(Sassolas et al. ,Chem Rev(2008) 108 109-139)。當(dāng)然，磁珠標(biāo)記方法也被采用，其結(jié)果可以用基于電荷耦合器件(CCD)的相機(jī)、 攝像機(jī)或低倍顯微鏡進(jìn)行成像分析(Guo et al.，J Anal Sci (2007)23 :1_4 ；Li et al.， supra ；Shlyapnikov et al.，Anal BiochemQOlO) 399 :125-131)，而且交叉反應(yīng)和非特異性吸附能通過(guò)磁場(chǎng)或流體來(lái)快速地加以消除(Mulvaney et al. ,Anal Biochem(2009) 392 139-144)。理論上，上述發(fā)光方法與磁珠方法是可以進(jìn)一步結(jié)合的，即將兩者的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行組合，應(yīng)該能提高芯片檢測(cè)平臺(tái)的靈敏度和特異性，這對(duì)基因突變檢測(cè)尤其臨床相關(guān)的檢測(cè)
8非常有意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種磁珠與發(fā)光體共標(biāo)記以檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒。本發(fā)明提供了輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組I，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21自5’末端第 23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列23所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。所述引物組I的(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組I的(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5’末端第4位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供了輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑I，由所述引物組I和探針組I組成；所述探針組I為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組II，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M自5’末端第 23至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5，末端第23至40位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列26所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列沈所示的DNA。所述引物組II的(a)或(b)中，序列表的序列沈所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組II的(a)或(b)中，所述序列表的序列沈所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑II，由所述引物組II和探針組II組成； 所述探針組II為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA ；
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(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組III，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27自5’末端第 25至42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列觀自5，末端第M至40位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列四所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列觀所示的DNA和序列表的序列四所示的DNA。所述引物組III的(a)或(b)中，序列表的序列四所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組III的(a)或(b)中，所述序列表的序列四所示的DNA自5’末端第 6位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑III，由所述引物組III和探針組III組成；所述探針組III為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組IV，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30自5’末端第 25至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5，末端第25至43位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列32所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA。所述引物組IV的(a)或(b)中，序列表的序列32所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組IV的(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自5’末端第6位
10核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑IV，由所述引物組IV和探針組IV組成； 所述探針組IV為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組V，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33自5’末端第 25至47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5，末端第M至43位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列35所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列；34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA。所述引物組V的(a)或(b)中，序列表的序列35所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組V的(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自5’末端第6位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑V，由所述引物組V和探針組V組成；所述探針組V為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組VI，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36自5’末端第 23至45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5，末端第23至43位核苷酸所示的DNA
11CN 102453761 A說(shuō)明書(shū)5/26 頁(yè)
和序列表的序列38所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA。所述引物組VI的(a)或(b)中，序列表的序列38所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組VI的(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自5’末端第5位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑VI，由所述引物組VI和探針組VI組成； 所述探針組VI為如下(a)或(b)或(c) (a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組VII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39自5’末端第 24至46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5，末端第M至45位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列41所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA。所述引物組VII的(a)或(b)中，序列表的序列41所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組VII的(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA自5’末端第 4位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑VII，由所述引物組VII和探針組VII組成；所述探針組VII為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ； (c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組VIII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42自5’末端第 23至43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5，末端第23至44位核苷酸所示的DNA 和序列表的序列44所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA。所述引物組VIII的(a)或(b)中，序列表的序列44所示DNA的5’末端可連接有生物素。所述引物組VIII的(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA自5’末端第 4位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑VIII，由所述引物組VIII和探針組 VIII組成；所述探針組VIII為如下(a)或(b)或(C)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA;(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的 5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。以上任一所述引物組或其組合或任一所述試劑或其組合均可用于制備輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒。本發(fā)明提供的輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒，為如下任意一種(一 )所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由所述的引物組I、所述的引物組II、所述的引物組III、所述的引物組IV、所述的引物組V、所述的引物組VI、所述的引物組VII和所述的引物組VIII組成；( 二)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由所述的試劑I、所述的試劑 II、所述的試劑III、所述的試劑IV、述的試劑V、所述的試劑VI、所述的試劑VII和所述的試劑VIII組成；(三)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由如下組分中的一種或幾種組成所述的引物組I、所述的引物組II、所述的引物組III、所述的引物組IV、所述的引物組V、所述的引物組VI、所述的引物組VII和所述的引物組VIII ；(四)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由如下組分中的一種或幾種組成所述的試劑I、所述的試劑II、所述的試劑III、所述的試劑IV、所述的試劑V、所述的試劑VI、所述的試劑VII和所述的試劑VIII。
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所述試劑盒具體包括基片、所述試劑組合物和顆粒；所述試劑組合物中的探針組固定于所述基片上，形成微陣列芯片；所述基片的材質(zhì)為硅、玻璃、塑料、水凝膠、硝酸纖維或尼龍；所述顆粒為微球或磁性微球。所述微陣列芯片上還可排列有陽(yáng)性對(duì)照MC、陽(yáng)性對(duì)照PC、陰性對(duì)照NC和陽(yáng)性對(duì)照 QC ；所述陽(yáng)性對(duì)照MC為序列表的序列17所示的DNA或在序列表的序列17所示DNA的5’ 末端連接特異片段得到的DNA ；所述陽(yáng)性對(duì)照PC為序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述陰性對(duì)照NC為序列表的序列19所示的DNA或在序列表的序列19所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的 DNA ；所述陽(yáng)性對(duì)照QC為序列表的序列20所示的DNA或在序列表的序列20所示DNA的5， 末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA， 且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的 DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。所述試劑盒還可包括序列表的序列46所示的DNA和如下DNA (A)或(B)(A)序列表的序列45自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA ；(B)序列表的序列45所示的DNA。所述顆粒具體可為鏈霉親和素包被的顆粒；序列表的序列46所示DNA的5’末端可連接有生物素，自5’末端第8位核苷酸可標(biāo)記有熒光素Cy3 ；序列表的序列17所示DNA 的3，末端可連接有生物素；序列表的序列20所示DNA的3，末端可連接熒光素HEX。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟a)將發(fā)光體標(biāo)記的靶標(biāo)分子耦聯(lián)到顆粒上；b)將此靶標(biāo)分子與固定在微陣列芯片上的探針?lè)肿酉嘟Y(jié)合；c)檢測(cè)靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的相互作用，這里所指的靶標(biāo)分子包括多核苷酸，特定的蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。任何合適的發(fā)光體都可以在本發(fā)明中使用，比如熒光團(tuán)、磷光團(tuán)、或者發(fā)色團(tuán)。熒光團(tuán)可以是量子點(diǎn)、蛋白質(zhì)(如綠色熒光蛋白)，或小分子熒光染料。而小分子熒光染料可以選擇氧雜蒽衍生物(熒光素，羅丹明，俄勒R綠，曙紅組成的小組，得克薩斯紅等)，青色素衍生物(青色素，吲哚碳花青，羰花青，部花青等)，萘衍生物(丹磺酰和普羅丹等)，香豆素衍生物，二唑衍生物，芘衍生物(級(jí)聯(lián)藍(lán)色等)，惡嗪衍生物(尼羅河紅色，藍(lán)色尼羅河，甲酚紫，惡嗪170等)，吖啶衍生物(二氨基吖啶，吖啶橙，吖啶黃等)，次甲基衍生物(金胺， 結(jié)晶紫，孔雀石綠等)，CF染料，Alexa染料，四吡咯衍生物(卟吩，膽紅素等)，級(jí)聯(lián)黃色，天藍(lán)色乙，吖啶橙，DAPI，Hoechst 33258，吡羅昔康，奎寧。磷光團(tuán)可以選擇過(guò)渡金屬化合物或各類(lèi)稀土化合物。發(fā)色團(tuán)可以選擇視網(wǎng)膜染料，食品著色劑，織物染料(偶氮化合物)， 番茄紅素，胡蘿卜素，花青素，葉綠素，血紅蛋白，血藍(lán)蛋白，礦物(孔雀石，紫水晶等)。 靶標(biāo)分子能直接或間接地被發(fā)光體標(biāo)記，這里間接是指靶標(biāo)分子與發(fā)光體之間有分子進(jìn)行鏈接。對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行某種合適的處理過(guò)程中，可以將發(fā)光體引入，標(biāo)記到靶標(biāo)分子上。任何合適的顆粒都可以在本發(fā)明中使用，每個(gè)顆粒上可結(jié)合至少一個(gè)靶標(biāo)分子。 所述顆?？蔀槲㈩w粒或磁性微球。所述顆粒的直徑可為0.1微米至10微米。所述顆?？杀粯?biāo)記基團(tuán)或其它功能性基團(tuán)的一種或幾種修飾，例如熒光分子，銀染試劑，化學(xué)發(fā)光試劑， 電化學(xué)試劑，納米粒子，量子點(diǎn)等。所述功能性基團(tuán)可為化學(xué)功能團(tuán)，如多核苷酸(poly-dT
14或poly-dA)、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽、碳水化合物、醛基，羥基，羧基，酯鍵，氨基，磺酸基或者巰基。所述功能性基團(tuán)還可為鏈霉親和素、中性鏈親和素、親和素。除了被發(fā)光體所標(biāo)記外，所述靶標(biāo)分子可以進(jìn)一步被修飾。修飾基團(tuán)可為化學(xué)功能團(tuán)、功能性基團(tuán)、多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽或碳水化合物。所述化學(xué)功能團(tuán)可為醛基、羥基、羧基、酯鍵、氨基、磺酸基、或巰基等。所述功能性基團(tuán)可為鏈霉親和素、中性鏈親和素或親和素等。所述多核苷酸可為poly-dT或poly-dA。所述靶標(biāo)分子可通過(guò)其上的修飾基團(tuán)與所述顆粒上的功能性基團(tuán)之間的相互作用耦聯(lián)到顆粒上。如鏈霉親和素與生物素之間的相互作用，中性鏈親和素與生物素之間的相互作用，親和素與生物素之間的相互作用，或者poly-dT/poly-dA之間的相互作用等。所述多核苷酸(靶標(biāo)分子)可為雙鏈或單鏈。單鏈多核苷酸靶標(biāo)至少存在部分序列與固定于微陣列芯片上的探針?lè)肿又辽俨糠中蛄惺峭耆蚧緣A基互補(bǔ)配對(duì)。當(dāng)然，單鏈多核苷酸靶標(biāo)序列與固定于微陣列芯片上的探針?lè)肿右部梢酝耆パa(bǔ)配對(duì)。所述多核苷酸(靶標(biāo)分子)可進(jìn)行體外操作，這可能會(huì)產(chǎn)生單鏈或雙鏈多核苷酸片段。所述體外操作可為物理方式，如激光、超聲、加熱、微波、壓電、電泳、介電泳、固相吸附、過(guò)濾或流體力等。所述體外操作還可為酶切、PCR擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄PCR、等位基因特異性PCR(ASPCR)、單堿基延伸(SBE法)、等位基因特異性引物延伸(ASPE)、限制性酶切、鏈置換擴(kuò)增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)、連接酶反應(yīng)(LCR)、基于核酸序列擴(kuò)增(NASBA)JI 物延伸、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、自主序列復(fù)制(3SR)、使用Q-Beta復(fù)制酶、切口平移或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等。所述雙鏈多核苷酸靶標(biāo)可以通過(guò)任何合適的方法變性為單鏈，例如化學(xué)反應(yīng)、酶反應(yīng)、或物理方式(比如加熱)，或者組合幾種方法。所述化學(xué)反應(yīng)方法可為使用尿素、甲酰胺、甲醇、乙醇和氫氧化鈉中的一種或幾種。所述酶反應(yīng)方法具體可為使用核酸外切酶和尿嘧啶-N-糖苷酶(UNG)。雙鏈多核苷酸靶標(biāo)還可以加熱到30°C _95°C中合適溫度進(jìn)行熱變性。所述微陣列芯片上可至少包括兩條探針。所述微陣列芯片上可包含多條寡核苷酸探針。所述微陣列芯片上的探針?lè)肿涌赡苁嵌嗪塑账?，蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽或者碳水化合物。獲得的單鏈靶標(biāo)多核苷酸可能包括人工設(shè)計(jì)和優(yōu)化的多核苷酸序列例如標(biāo)簽序列，還可包含通用標(biāo)簽陣列。這些標(biāo)簽序列與通用標(biāo)簽陣列上的寡核苷酸探針序列上互補(bǔ)配對(duì)或基本互補(bǔ)配對(duì)。不同標(biāo)簽序列的Tm值之間的差異被設(shè)計(jì)在任何合適的范圍內(nèi)，如不超過(guò)5°C。一些實(shí)例中，標(biāo)簽序列相互之間沒(méi)有交叉反應(yīng)。某些應(yīng)用中，標(biāo)簽序列與物種的基因組DNA之間的同源性很低。特別某些應(yīng)用中，標(biāo)簽序列內(nèi)沒(méi)有發(fā)卡結(jié)構(gòu)。某些應(yīng)用中，標(biāo)簽序列是單鏈寡核苷酸或者被修飾的類(lèi)似物。另外一些應(yīng)用中，標(biāo)簽序列可以是鎖核酸(LNA)，編碼核酸(ZNA)或肽核酸(PNA)。另一些應(yīng)用中，標(biāo)簽序列通過(guò)體外操作方式被引入到靶標(biāo)多核苷酸中。微陣列芯片可以由任意合適的技術(shù)方法制成。某些應(yīng)用中，制成微陣列芯片技術(shù)方法包括用針點(diǎn)樣，利用預(yù)制的掩膜板光刻合成，利用動(dòng)態(tài)微鏡光刻合成，噴墨印刷，微印章技術(shù)，電化學(xué)方法和微電極陣列方法。制備微陣列芯片的基地材料包括硅，玻璃，塑料，水凝膠，瓊脂糖，硝酸纖維和尼龍。固定于微陣列芯片上的探針?lè)肿影ǘ嗪塑账幔鞍锥嚯?，抗體，小分子化合物， 多肽和碳水化合物。探針?lè)肿涌梢酝ㄟ^(guò)任何合適的方法結(jié)合到芯片上，例如原位合成，非特異性吸附，特異性結(jié)合，非特異性的化學(xué)連接，或者化學(xué)選擇性連接。探針?lè)肿优c微陣列芯片之間的結(jié)合可能是共價(jià)結(jié)合或者物理吸附。微陣列芯片的基底材料可以是任何合適的材料，比如硅，玻璃，塑料，水凝膠，瓊脂糖，硝酸纖維和尼龍。微陣列芯片上的探針點(diǎn)可以是任何合適的尺寸。某些應(yīng)用中，這些探針點(diǎn)直徑上從約10微米到5000微米。另一些應(yīng)用中， 這些探針為單鏈寡核苷酸或者被修飾的類(lèi)似物。另外一些應(yīng)用中，寡核苷酸探針可以是鎖核酸(LNA)，編碼核酸(ZNA)或肽核酸(PNA)。靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的結(jié)合可能是非共價(jià)鍵，共價(jià)可逆或共價(jià)鍵不可逆。包括磁力，介電力之類(lèi)的外力可用于操縱顆?；蛘呶⑶?，以提高雜交效率和效果。 雜交結(jié)果可以用任何合適的方式進(jìn)行檢測(cè)，比如用微陣列芯片掃描儀，常規(guī)的圖像捕獲設(shè)備或者肉眼。某些應(yīng)用中，微陣列芯片掃描儀通過(guò)熒光標(biāo)記，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或酶實(shí)現(xiàn)光學(xué)檢測(cè)。另一些應(yīng)用中，微陣列芯片掃描儀通過(guò)酶、二茂鐵標(biāo)記或其他電活性標(biāo)記實(shí)現(xiàn)電化學(xué)檢測(cè)。還有一些應(yīng)用中，微陣列芯片掃描儀通過(guò)表面等離子共振，磁力，巨磁阻效應(yīng)或微天平技術(shù)實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記檢測(cè)。另一些應(yīng)用中，常規(guī)的圖像捕獲設(shè)備是平板掃描儀，照相/攝像機(jī)，或便攜式設(shè)備。一些應(yīng)用中，檢測(cè)結(jié)果是由照相/攝像機(jī)紀(jì)錄，無(wú)論是否加裝鏡頭、放大鏡或者顯微鏡。其他一些應(yīng)用中，檢測(cè)結(jié)果是由帶有照相/攝像功能的便攜式設(shè)備記錄，例如手機(jī)、筆記本，同樣無(wú)論是否加裝鏡頭、放大鏡或顯微鏡。本發(fā)明可用于任何適當(dāng)?shù)挠猛?。一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)遺傳信息的方法， 該方法包括a)將發(fā)光體標(biāo)記的靶標(biāo)分子耦聯(lián)到顆粒上；b)將靶標(biāo)分子與固定在微陣列芯片上的探針?lè)肿酉嘟Y(jié)合；和C)檢測(cè)靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的相互作用，這里所指的靶標(biāo)分子包含了遺傳信息，是多核苷酸，特定的蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽或者碳水化合物。另一方面，本發(fā)明提供一種檢測(cè)遺傳信息的方法，它包括a)將發(fā)光體標(biāo)記的雙鏈靶標(biāo)分子耦聯(lián)到顆粒上；b)將顆粒上的靶標(biāo)分子變成單鏈；C)將單鏈靶標(biāo)分子與固定在微陣列芯片上的探針?lè)肿酉嘟Y(jié)合，d)檢測(cè)靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的相互作用，這里所指的靶標(biāo)分子包含了遺傳信息，是多核苷酸。任何合適的遺傳信息都可以利用本方法進(jìn)行檢測(cè)。例如遺傳信息可以是基因突變，包括堿基替換，插入，刪除及多堿基替換。一些應(yīng)用中，遺傳信息具有單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。另一些應(yīng)用中，遺傳信息是基因。另外一些應(yīng)用中，遺傳信息是遺傳物質(zhì)，包括多核苷酸，蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。含有或疑似含有遺傳信息的靶標(biāo)多核苷酸可在檢測(cè)前擴(kuò)增放大，發(fā)光體標(biāo)記可以在此過(guò)程中直接引入，即產(chǎn)物將標(biāo)記上發(fā)光體。例如，ASPCR可用于擴(kuò)增放大遺傳信息。任何合適的引物都能用于擴(kuò)增放大含有或疑似含有遺傳信息的靶標(biāo)多核苷酸。一些應(yīng)用中， ASPCR至少包括兩條等位基因特異性引物和一條通用引物。另一些應(yīng)用中，等位基因特異性引物和通用引物的序列顯示在表2中，而通用引物中堿基已用熒光標(biāo)記，以“*”記號(hào)標(biāo)注。 另外的實(shí)例中，等位基因特異性引物終止于多核苷酸序列的SNP/突變位點(diǎn)處。另一些應(yīng)用中，等位基因特異性引物與野生型序列相比進(jìn)一步引入了人工錯(cuò)配。一些應(yīng)用中，等位基因特異性引物包含天然的核苷酸或類(lèi)似物。一些應(yīng)用中，等位基因特異性引物序列中包括一個(gè)標(biāo)簽序列。其他一些應(yīng)用中，ASPCR使用的DNA聚合酶沒(méi)有3’到5’的外切酶活性。另一方面，本發(fā)明的組成包括對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行發(fā)光體標(biāo)記，并將耦聯(lián)到顆粒上的靶標(biāo)分子和固定于微陣列芯片上的探針?lè)肿舆M(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，其中靶標(biāo)分子包括多核苷酸， 蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。一些應(yīng)用中，包含標(biāo)簽序列的寡核苷酸探針的序列如表1所示。另一些應(yīng)用中，通用標(biāo)簽陣列中至少包括表1中的兩條標(biāo)簽序列。另一些應(yīng)用中，通用標(biāo)簽陣列中至少包括表1中的四條標(biāo)簽序列。另一些應(yīng)用中，通用標(biāo)簽陣列中至少包括表1中的八條標(biāo)簽序列。 另一些應(yīng)用中，通用標(biāo)簽陣列包括表1中的所有標(biāo)簽序列。進(jìn)一步提供的引物序列如表2中所示，但不包含標(biāo)簽序列和5’生物素標(biāo)記的通用序列，而且引物序列不是全長(zhǎng)的cDNA或全長(zhǎng)的基因組DNA。一些應(yīng)用中，引物基本上包含表2中所示的序列，同樣不包含標(biāo)簽序列和5’生物素標(biāo)記的通用序列。另一些應(yīng)用中，弓丨物包含表2中所示的序列，同樣不包含標(biāo)簽序列和5’生物素標(biāo)記的通用序列。另一些應(yīng)用中，引物包含表2中所示的序列。這里提供了用于ASPCR擴(kuò)增遺傳信息的一組引物，該組引物包含兩條等位基因特異性引物和一條共同引物，具體的引物序列如在表2中所示。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一個(gè)用于檢測(cè)遺傳信息的試劑盒，該試劑盒包含通用標(biāo)簽陣列。該試劑盒包括一個(gè)說(shuō)明手冊(cè)。一些實(shí)例中，該試劑盒中的引物包含表2中所示序列，但不包含標(biāo)簽序列和5’生物素標(biāo)記的通用序列，而且引物序列不是全長(zhǎng)的cDNA或全長(zhǎng)的基因組DNA。另一些實(shí)例中，該試劑盒包含了一組用于ASPCR擴(kuò)增遺傳信息的引物，該組引物包含兩條等位基因特異性引物和一條共同引物，具體的引物序列如在表2中所示。另一方面，本發(fā)明提供一個(gè)檢測(cè)分子相互作用的試劑盒，含有發(fā)光體，顆粒，微陣列芯片，和固定于微陣列芯片上的探針?lè)肿印１景l(fā)明提出了一種基于微陣列芯片的方法，用于分析分子間相互作用，包括多核苷酸，蛋白多肽，抗體，小分子化合物，多肽和碳水化合物。該方法包括將發(fā)光體標(biāo)記的靶標(biāo)分子耦聯(lián)到顆粒上，然后與固定于微陣列芯片上的探針?lè)肿酉嘟Y(jié)合。尤其是與核酸片段相關(guān)的遺傳分析可以實(shí)施。特定的基因，單核苷酸多態(tài)性或基因突變，如堿基刪除，插入和多堿基替換，都可以鑒定。本發(fā)明提供的引物組、試劑組以及試劑盒可以用于遺傳性耳聾的篩查，實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)、提早預(yù)防以及產(chǎn)前指導(dǎo)，具有重大的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)意義。


圖1為用本發(fā)明的方法(該發(fā)明集成了發(fā)光體、顆粒與微陣列芯片)分析分子間相互作用的原理示意圖。圖2為三類(lèi)不同圖像獲取手段來(lái)檢測(cè)微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即明場(chǎng)下CXD器件(左圖)，熒光顯微鏡(中圖)，以及商用微陣列芯片掃描儀(右圖)。圖3為用本發(fā)明的方法(該發(fā)明集成了發(fā)光體、顆粒與微陣列芯片)檢測(cè)雙鏈靶標(biāo)多核苷酸的原理示意圖。圖4為一個(gè)與遺傳性耳聾相關(guān)的8個(gè)SNP/突變檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的通用標(biāo)簽陣列排布描述；QC和BC代表陽(yáng)性和陰性點(diǎn)樣質(zhì)控；PC和NC代表陽(yáng)性和陰性雜交質(zhì)控；MC是修飾在微球表面的基團(tuán)與靶標(biāo)分子結(jié)合的陽(yáng)性質(zhì)控。圖5為當(dāng)本發(fā)明使用通用標(biāo)簽陣列、發(fā)光體、微顆粒相結(jié)合，對(duì)遺傳性耳聾相關(guān)的 8個(gè)SNP/突變進(jìn)行檢測(cè)時(shí)靈敏度評(píng)估，使用的是對(duì)這8個(gè)SNP/突變?yōu)橐吧偷哪０?。圖6為當(dāng)本發(fā)明使用通用標(biāo)簽陣列和微顆粒或微珠相結(jié)合，對(duì)遺傳性耳聾相關(guān)的 8個(gè)SNP/突變進(jìn)行檢測(cè)時(shí)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明開(kāi)發(fā)了一種創(chuàng)新技術(shù)，該技術(shù)將微陣列芯片技術(shù)與顆粒以及發(fā)光體結(jié)合在一起，通過(guò)靶標(biāo)分子與探針?lè)肿拥慕Y(jié)合，最終實(shí)現(xiàn)解碼。一些應(yīng)用中，該技術(shù)將微陣列芯片技術(shù)與顆粒以及發(fā)光體結(jié)合在一起，通過(guò)富集靶標(biāo)多核苷酸，借助靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的雜交將顆粒耦聯(lián)到微陣列芯片上的探針點(diǎn)上，并最終實(shí)現(xiàn)解碼。一些應(yīng)用中，該技術(shù)將微陣列芯片技術(shù)與顆粒以及發(fā)光體結(jié)合在一起，通過(guò)富集雙鏈靶標(biāo)多核苷酸片斷，收獲單鏈靶標(biāo)多核苷酸片斷，借助靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的雜交將顆粒耦聯(lián)到微陣列芯片上的探針點(diǎn)上，并最終實(shí)現(xiàn)解碼。除了擁有很好特異性和很高靈敏度之外，借助顆粒與發(fā)光體聯(lián)合、或顆粒單獨(dú)顯示出來(lái)的結(jié)果，可以用合適的設(shè)備，甚至肉眼觀察檢測(cè)。以遺傳性耳聾相關(guān)的SNP/突變檢測(cè)為例，對(duì)該組合方法進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明該方法用于遺傳分析時(shí)具有特異性高，靈敏度高，性價(jià)比高的特點(diǎn)，這特別適合于臨床樣品的相關(guān)診斷和疾病相關(guān)遺傳檢測(cè)。本發(fā)明并不限于實(shí)施例的描述過(guò)程中特定的方法，儀器設(shè)備，溶液、或者器材，因?yàn)檫@種方法，設(shè)備，溶液或器材都是可變的。也需要強(qiáng)調(diào)的是，文中使用的術(shù)語(yǔ)只是為了描述特定的實(shí)例，不是為了限制本發(fā)明的范圍。除非文中另有定義或文中另有明確規(guī)定，文中所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通的技術(shù)人員的通常理解有相同的意思。雖然實(shí)踐中任何與文中描述的方法和材料相類(lèi)似的或等價(jià)的方法和材料都能被使用或者用于驗(yàn)證本發(fā)明，但目前使用了首選的方法和材料進(jìn)行描述本發(fā)明。文中所列的公開(kāi)出版物均是作為參考文獻(xiàn)進(jìn)行引用，用于提供和描述特定的材料和方法。文中談?wù)摰降某霭嫖镏皇菫榱私沂驹诒景l(fā)明的申請(qǐng)日之前的背景技術(shù)，這些背景技術(shù)不應(yīng)解釋為承認(rèn)在先發(fā)明揭示了本發(fā)明。A.本發(fā)明中涉及的定義如下術(shù)語(yǔ)“分子”指的是多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽或者碳水化合物。術(shù)語(yǔ)“發(fā)光體”指的是化合物中的能呈現(xiàn)發(fā)光性質(zhì)的原子或原子簇，包括熒光團(tuán)、 磷光團(tuán)和發(fā)色團(tuán)。術(shù)語(yǔ)“顆?！被颉拔㈩w粒”指的是粒徑在約0. 01微米至1000微米范圍內(nèi)的小顆粒。 一些實(shí)例中，“顆?！被颉拔㈩w粒”具有某些內(nèi)在屬性，比如磁性、熒光之類(lèi)特性，可用來(lái)鑒定顆?；蛘呶㈩w粒是否劃歸為一組。術(shù)語(yǔ)“微球”指的是粒徑在約0. 01微米至1000微米范圍內(nèi)的粒子，通常是球狀。一些實(shí)例中，微球上包含一種或多種識(shí)別標(biāo)簽，比如磁性、熒光之類(lèi)特性，這些標(biāo)簽隨著微球上的聚合物、玻璃、其它基質(zhì)或包被之類(lèi)成形而形成。術(shù)語(yǔ)“磁性微球”，指的是粒徑在約0.01微米至1000微米范圍內(nèi)的粒子，通常在微球的聚合物、玻璃、 基質(zhì)或者包被中包含一個(gè)或多個(gè)磁性區(qū)域。術(shù)語(yǔ)“微球”或“磁性微球”并不排除球體以外的其它形狀，其包含球狀、扁平狀等其它形狀的粒子。術(shù)語(yǔ)“微陣列芯片”指的是多核苷酸、多肽及化合物微陣列芯片。特定的多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽和碳水化合物都可以被固定在固相表面，形成微陣歹丨J芯片。本發(fā)明將微陣列芯片技術(shù)與顆粒以及發(fā)光體相結(jié)合，通過(guò)靶標(biāo)分子與探針?lè)肿又g的結(jié)合相互作用，最終實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)解碼。術(shù)語(yǔ)“結(jié)合”指的是兩個(gè)分子間的相互作用，結(jié)果是由于相互之間近距離接觸而形成穩(wěn)定的復(fù)合體。分子間的結(jié)合相互作用分為非共價(jià)鍵， 共價(jià)可逆或共價(jià)鍵不可逆三種類(lèi)型。能參與分子間的結(jié)合相互作用的分子包括多核苷酸、 多肽、脂類(lèi)、碳水化合物和小分子化合物，比如藥物中小分子化合物。能夠與其它分子形成穩(wěn)定復(fù)合體的多肽通常被稱(chēng)為“受體”，而與之相結(jié)合的分子被稱(chēng)為“配體”。多核苷酸可與自身或其它分子形成穩(wěn)定的復(fù)合體，例如DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，DNA-DNA復(fù)合體，DNA-RNA復(fù)合體。術(shù)語(yǔ)“多肽”文中指的是蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的片段或氨基酸多肽，可從自然界中分離， 通過(guò)重組技術(shù)生產(chǎn)或者化學(xué)方法合成。多肽可能包含一個(gè)或多個(gè)修飾，比如轉(zhuǎn)錄后修飾 (如糖基化修飾)或者其他修飾(如聚乙二醇修飾)。多肽中可能包含一個(gè)或多個(gè)非天然氨基酸(如一些側(cè)鏈有修飾的氨基酸)。本發(fā)明中所涉及的多肽通常包含至少10個(gè)氨基酸。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”文中可相互替代，指的是由核苷酸形成的任何長(zhǎng)度的聚合物，包含核糖核酸、脫氧核糖核酸以及類(lèi)似物或混合物之類(lèi)。該術(shù)語(yǔ)文中只指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。該術(shù)語(yǔ)文中包括三鏈、雙鏈和單鏈的脫氧核糖核酸(DNA)， 三鏈、雙鏈和單鏈的核糖核酸(RNA)。該術(shù)語(yǔ)中的多核苷酸可以未經(jīng)修飾，也可以進(jìn)行修飾， 例如烷基化，蓋帽。術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”及“核酸分子”也包含多聚脫氧核糖核酸(包含2-脫氧-D-核糖)，多聚核糖核酸(包含D-核糖)，包括轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)，核糖體RNA (rRNA)，轉(zhuǎn)錄初級(jí)產(chǎn)物(hRNA)和信使RNA (mRNA)，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)剪接，包含任何類(lèi)型的多核苷酸，其N(xiāo)端或C端為嘌呤或嘧啶，包含任何擁有類(lèi)似核苷酸相連形成骨架的聚合物，例如酰胺類(lèi)聚合物(比如肽核酸(PNA))，嗎啉聚合物(可從Anti-Virals，Corvallis, Neugene等公司購(gòu)買(mǎi))，以及其他合成的序列特異性核酸聚合物，這些聚合物包含堿基可像 DNA或者RNA那樣實(shí)現(xiàn)堿基配對(duì)和堿基堆積。因而這些術(shù)語(yǔ)文中包含3’-脫氧-2’，5’-的 DNA,寡核苷酸N3’到P5’磷酰胺酯，2’ -0-烷基取代的RNA，DNA與RNA之間的形成的雜合體，PNA與DNA或者RNA之間形成的雜合體，也包含已知種類(lèi)的修飾，例如標(biāo)記，烷基化，蓋帽，一個(gè)或者多個(gè)核苷酸被類(lèi)似物替代，核苷酸之間的修飾，例如不帶電的連接(舉例如甲基磷酸，磷酸三脂，磷酰胺，氨基甲酸酯等)，帶負(fù)電的連接(舉例如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等等)，帶正電的連接(舉例如氨烷基亞磷酸脂，氨烷基磷酸三酯)，那些帶有修飾件的聚合物，這類(lèi)修飾件包括蛋白質(zhì)(舉例如酶(如核酸酶)，毒素，抗體，信號(hào)肽，多聚L-賴氨酸等等)，那些帶有嵌插集團(tuán)的聚合物，這些嵌插集團(tuán)如吖啶，補(bǔ)骨脂素等，那些帶有鰲合物的聚合物，這些鰲合物如金屬，放射性金屬，硼，氧化性金屬等等，那些帶有烷化集團(tuán)的聚合物，那些帶有修飾連接的聚合物，例如α異位核酸，還有未作修飾的多核苷酸或寡核苷酸。
值得注意的是，術(shù)語(yǔ)“核苷”和“核苷酸”文中不僅包含已知的嘌呤和嘧啶，而且包含已被修飾的雜環(huán)堿基。這些修飾包括甲基化嘌呤或嘧啶，?；堰驶蜞奏ぃ蚱渌s環(huán)化。被修飾核苷或核苷酸還包括對(duì)對(duì)糖結(jié)構(gòu)的修飾，例如糖結(jié)構(gòu)上的一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素，脂肪基團(tuán)所取代，或被醚，氨基之類(lèi)功能化。術(shù)語(yǔ)“核苷酸單元”認(rèn)為是包含了核苷和核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核酸探針”和“探針”文中可相互替代，指的是由文中已定義的多核苷酸組成的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含一段核酸序列，可與對(duì)應(yīng)的靶標(biāo)特異性地結(jié)合。探針的多核苷酸區(qū)域可由DNA、RNA或合成的核苷類(lèi)似物組成。術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)或配對(duì)”文中指的是兩段核酸序列同源性大于等于50%。最好兩段核酸序列同源性不低于 60%，70%，80%，90%，95%，96%，97%，98%，99%或 100%?！盎パa(bǔ)或配對(duì)”也意味著兩段核酸序列可在低、中或高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下進(jìn)行雜交。序列同源性的比例可通過(guò)與相應(yīng)的參照序列比對(duì)加以計(jì)算。術(shù)語(yǔ)“實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)或配對(duì)”文中指的是兩段核酸序列同源性大于等于90%。最好兩段核酸序列同源性不低于95 %，96 %，97 %，98 %，99 %或100 %?！皩?shí)質(zhì)上互補(bǔ)或配對(duì)”也意味著兩段核酸序列可在高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下進(jìn)行雜交。序列同源性的比例可通過(guò)與相應(yīng)的參照序列比對(duì)加以計(jì)算?？偟亩?，雜合體的穩(wěn)定性是離子濃度和溫度的函數(shù)。通常情況下，雜交反應(yīng)在較低嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下進(jìn)行，而隨后的清洗是在較高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件下進(jìn)行。中等嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交條件允許核酸分子，例如探針，結(jié)合到互補(bǔ)的核酸分子上。已雜交的核酸分子通常有不低于 60 %的序列同源性，包括不低于70 %，75 %，80 %，85 %，90 %或95 %的序列同源性。中等嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交相當(dāng)于在由50%甲酰胺，5x Denhardt' s溶液，5x SSPE，0. 2% SDS組成的雜交液中進(jìn)行42°C雜交反應(yīng)，隨后在由0. 2x SSPE，0. 2% SDS組成的清洗液中進(jìn)行42°C清洗。 高嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交相當(dāng)于在由50%甲酰胺，5x Denhardt' s溶液，5x SSPE,0. 2% SDS組成的雜交液中進(jìn)行42°C雜交反應(yīng)，隨后在由0. Ix SSPE，0. 1% SDS組成的清洗液中進(jìn)行65°C清洗。低嚴(yán)謹(jǐn)性的雜交相當(dāng)于在由10%甲酰胺，5xDenhardt，S溶液，6x SSPE，0. 2% SDS組成的雜交液中進(jìn)行22V雜交反應(yīng)，隨后在由Ix SSPE，0. 2% SDS組成的清洗液中進(jìn)行37°C清洗。50x Denhardt' s溶液由1 % Ficoll，1 %聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白 (BSA)組成。20x SSPE由3M氯化鈉，0. 2M磷酸二氫鈉和0. 025M EDTA組成。另外，RNA或DNA能在特定的雜交條件下與其相應(yīng)的互補(bǔ)鏈進(jìn)行雜交，產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上的互補(bǔ)性。通常情況下，鏈長(zhǎng)在14到25的多核苷酸至少有65%互補(bǔ)性，最好至少75%互補(bǔ)性，至少90%互補(bǔ)性更佳，特異性雜交就能實(shí)現(xiàn)。術(shù)語(yǔ)“同源的”、“實(shí)質(zhì)上同源的”和“實(shí)質(zhì)上同源性”文中指的是氨基酸序列與相應(yīng)的參考序列相比，至少有50 %，60 %，70 %，80 %或90 %的一致性。序列同源性的比例可通過(guò)與相應(yīng)的參照序列比對(duì)加以計(jì)算。術(shù)語(yǔ)“多重”或者“多重檢測(cè)”文中指的是利用多種捕獲探針同時(shí)檢測(cè)多種靶標(biāo)序列的方法或其它分析方法。所用的每種捕獲探針具有特定的檢測(cè)特征，例如熒光特性(比如激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)、發(fā)射強(qiáng)度、半峰寬(FWHM)或熒光壽命)。當(dāng)然，本發(fā)明在文中描述的方面和實(shí)例包括“由……組成的”或“基本上由……組成的”方面和實(shí)例。
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本發(fā)明的任何其它內(nèi)涵、優(yōu)點(diǎn)和特征將通過(guò)后續(xù)的說(shuō)明及相應(yīng)附圖加以闡述說(shuō)明。B.發(fā)光體“發(fā)光體”指的是化合物中的能呈現(xiàn)發(fā)光性質(zhì)的原子或原子簇，存在無(wú)機(jī)和無(wú)機(jī)兩種類(lèi)型，包括熒光團(tuán)、磷光團(tuán)和發(fā)色團(tuán)。熒光團(tuán)可以是量子點(diǎn)、蛋白質(zhì)(如綠色熒光蛋白)， 或小分子熒光染料。而小分子熒光染料可以選擇氧雜蒽衍生物(熒光素，羅丹明，俄勒岡綠，曙紅組成的小組，得克薩斯紅等)，青色素衍生物(青色素，吲哚碳花青，羰花青，部花青等)，萘衍生物(丹磺酰和普羅丹等)，香豆素衍生物，二唑衍生物，芘衍生物(級(jí)聯(lián)藍(lán)色等)，惡嗪衍生物(尼羅河紅色，藍(lán)色尼羅河，甲酚紫，惡嗪170等)，吖啶衍生物(二氨基吖唆，吖啶橙，吖啶黃等)，次甲基衍生物(金胺，結(jié)晶紫，孔雀石綠等)，CF染料，Alexa染料， 四吡咯衍生物(卟吩，膽紅素等)，級(jí)聯(lián)黃色，天藍(lán)色乙，吖啶橙，DAPI，H0echst 33258，吡羅昔康，奎寧。磷光團(tuán)可以選擇過(guò)渡金屬化合物或各類(lèi)稀土化合物。發(fā)色團(tuán)可以選擇視網(wǎng)膜染料，食品著色劑，織物染料(偶氮化合物)，番茄紅素，胡蘿卜素，花青素，葉綠素，血紅蛋白，血藍(lán)蛋白，礦物(孔雀石，紫水晶等)。靶標(biāo)分子能直接或間接地被發(fā)光體標(biāo)記，這里間接是指靶標(biāo)分子與發(fā)光體之間有分子進(jìn)行鏈接。對(duì)靶標(biāo)分子進(jìn)行某種合適的處理過(guò)程中，可以將發(fā)光體弓I入，標(biāo)記到靶標(biāo)分子上。C.微陣列芯片作為一種高通量的檢測(cè)技術(shù)，微陣列芯片技術(shù)能同時(shí)對(duì)成千上萬(wàn)的分子間相互作用進(jìn)行分析，已對(duì)生物、醫(yī)學(xué)和新藥開(kāi)發(fā)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。DNA微陣列芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、突變分型、單核苷酸多態(tài)性(SNP)和短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)。多肽微陣列芯片和化學(xué)微陣列芯片已經(jīng)發(fā)展成為蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域兩個(gè)重要的工具?；瘜W(xué)微陣列芯片，作為一種組合庫(kù)，也能用于先導(dǎo)化合物的鑒定，并優(yōu)化這些先導(dǎo)化合物。在生物反恐領(lǐng)域，開(kāi)發(fā)能監(jiān)測(cè)環(huán)境中的多種生物戰(zhàn)劑或化學(xué)戰(zhàn)劑的微陣列芯片將引起執(zhí)法機(jī)構(gòu)的極大興趣。本發(fā)明的一些實(shí)例提供了一種分析分子間相互作用的方法。本發(fā)明的一些實(shí)例提供了一種多重分析靶標(biāo)多核苷酸的方法。本發(fā)明技術(shù)上提高了基于微陣列芯片的檢測(cè)方法的特異性和靈敏度，同時(shí)降低了應(yīng)用于基因檢測(cè)時(shí)的成本。圖1描述了將微陣列芯片與顆粒以及發(fā)光體集成在一起，用于分析分子間的相互作用的原理。用于分析的靶標(biāo)分子包括多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽和碳水化合物。微陣列芯片是一項(xiàng)復(fù)雜的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。它能用于分析多種靶標(biāo)分子，包括多核苷酸、蛋白多肽、抗體、小分子化合物、多肽和碳水化合物。微陣列芯片可通過(guò)多種技術(shù)來(lái)制作，包括使用尖頭針點(diǎn)樣技術(shù)，基于預(yù)制掩模版光刻技術(shù)，基于動(dòng)態(tài)微鏡裝置光刻技術(shù)，噴墨點(diǎn)樣技術(shù)，微接觸印章技術(shù)和微電極陣列上電化學(xué)技術(shù)。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的微陣列芯片技術(shù)而言，探針?lè)肿油ㄟ^(guò)表面工程方法被固定在芯片基底材料的表面上，這些基底材料包括玻璃、硅、塑料、水凝膠、瓊脂糖、硝酸纖維和尼龍。DNA微陣列芯片是把DNA寡聚核苷酸探針的微尺度點(diǎn)排成陣列構(gòu)成。探針是基因上的一個(gè)短片斷或其他DNA片斷，能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與互補(bǔ)的多核苷酸樣品即靶標(biāo)進(jìn)行雜交。溶液中的靶標(biāo)分子的檢測(cè)及定量可通過(guò)檢測(cè)已雜交到微陣列芯片上的熒光、銀染或者化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的靶標(biāo)分子來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于微陣列芯片上包含成千上萬(wàn)條探針，一次微陣列芯片實(shí)驗(yàn)?zāi)懿⑿型瓿啥鄠€(gè)遺傳檢測(cè)。圖2為三類(lèi)不同圖像獲取手段來(lái)檢測(cè)同一微陣列實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即明場(chǎng)下C⑶器件 (左圖)，熒光顯微鏡(中圖)，以及商用微陣列芯片掃描儀(右圖)。表明本發(fā)明對(duì)可見(jiàn)光檢測(cè)和熒光掃描檢測(cè)都適用。文中所用的微陣列芯片上可包含兩條或多條針對(duì)同一個(gè)靶標(biāo)多核苷酸的探針。一些微陣列芯片的實(shí)例中，探針重復(fù)出現(xiàn)了多次，可能是2次，3次，4次，5次，6次，7次或者更多次。一些實(shí)例中，微陣列芯片上可包含兩條或多條針對(duì)同一個(gè)靶標(biāo)多核苷酸的不同探針。 這些不同的探針可結(jié)合到同一個(gè)靶標(biāo)多核苷酸的不同區(qū)域，無(wú)論區(qū)域之間是否有重疊。任何能確定靶標(biāo)多核苷酸水平的探針都可用于微陣列芯片。一些實(shí)例中，探針是寡核苷酸。當(dāng)然檢測(cè)靶標(biāo)多核苷酸時(shí)，序列上的一定程度的變異是可以接受的。因而寡核苷酸序列或其互補(bǔ)序列可與相應(yīng)的靶標(biāo)多核苷酸序列上輕微的差別。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，這種序列上的差異不會(huì)嚴(yán)重影響寡核苷酸探針確定靶標(biāo)多核苷酸水平的能力。使用標(biāo)準(zhǔn)方法比對(duì)時(shí)，這些寡核苷酸序列上的變異具有較高的同源性。與靶標(biāo)多核苷酸序列相比，本發(fā)明中所包含的寡核苷酸序列同源性至少為40 %，也可能至少50 %，60 %，70 %， 80^,90^,95%或更高的同源性。一些實(shí)例中，寡核苷酸探針包含兩部分，其中一部分用于檢測(cè)靶標(biāo)多核苷酸。探針的另一部分另作他用，例如用于固定寡核苷酸探針到基底材料上。 另一些實(shí)例中，探針的另一部分包含非特異序列，比如poly-T或poly-dT，可用于增加探針上互補(bǔ)序列部分與基底材料表面之間的距離。文中所述的寡核苷酸探針包括DNA、RNA、PNA、ZNA、LNA，及他們的組合，或其修飾之后的形式。該寡核苷酸探針也包括被修飾的寡核苷酸骨架。一些實(shí)例中，寡核苷酸探針至少包含連續(xù)的9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)或者更多個(gè)與全長(zhǎng)或部分靶標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)或者相同的核苷酸序列。一條寡核苷酸探針可能包含兩段或更多段互補(bǔ)序列。一些實(shí)例中，寡核苷酸探針的5’或3’末端有活性基團(tuán)，比如氨基，用于將該探針連接到基底材料上。一些實(shí)例中，探針是寡核苷酸。寡核苷酸探針可通過(guò)多種方式連接到微陣列芯片的基底材料上。這些方式包括但不限于已列出來(lái)的方式(1)基于光刻技術(shù)的原位合成，例如Affymetrix公司生產(chǎn)的高密度寡核苷酸陣列；(2)在玻璃、硅、尼龍或硝酸纖維上進(jìn)行中低密度的點(diǎn)樣或者印制；C3)屏蔽選擇性合成；(4)在尼龍或硝酸纖維形成的雜交膜上打點(diǎn)雜交。寡核苷酸也可通過(guò)液相非共價(jià)鍵地固定到基底材料上，可利用微孔、微管道或毛細(xì)管等結(jié)構(gòu)形成液相環(huán)境。眾所周知，許多技術(shù)都可用來(lái)把多核苷酸耦聯(lián)到固體載體上，比如玻璃基片。一種方法是將堿基的修飾物或類(lèi)似物插入到進(jìn)行擴(kuò)增的多核苷酸中，這些堿基的修飾物或類(lèi)似物包含能耦聯(lián)到固體載體上的基團(tuán)，比如氨基，氨基的衍生物，或者帶正電荷的基團(tuán)。 該擴(kuò)增產(chǎn)物加到固體載體比如玻璃基片上。由于該固體載體上包被了醛基或其他的活性基團(tuán)，使其可與擴(kuò)增產(chǎn)物上的活性基團(tuán)形成共價(jià)鍵，使得擴(kuò)增產(chǎn)物共價(jià)鏈接到固體載體上。擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)成的微陣列芯片可通過(guò)使用Biodot點(diǎn)樣儀(BioDot，Inc. Irvine, CA)和醛基玻片(CEL Associates, Houston, TX)制成。擴(kuò)增產(chǎn)物能被點(diǎn)在醛基玻片上并按照文獻(xiàn)上公布的流程進(jìn)行后續(xù)處理(Schena et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (1995)，93 :10614-10619)。微陣列芯片可通過(guò)機(jī)械手點(diǎn)樣印制到玻璃，尼龍(Ramsay，G.，Nature Biotechnol. (1998), 16 :40-44)，聚丙烯(Matson, et al.，Anal Biochem. (1995), 224 (1) 110-116)，硅(Marshall and Hodgson,Nature Biotechnol. (1998)，16 :27-31)等固體載體上。制作微陣列芯片的其他方法包括電場(chǎng)下精確控制微量吸管(Marshall，and Hodgson, Nature Biotechnol. (1998)，16 :27-31)，多核苷酸直接點(diǎn)樣到帶正電荷的固體載體上。本發(fā)明方法可通過(guò)復(fù)雜的排布格式加以實(shí)施。這種復(fù)雜的分析方法可利用2，3，4， 5，10，15，20，25，50，100，200，500，1000或更多條捕獲探針，同時(shí)分析來(lái)自多個(gè)不同的靶標(biāo)多核苷酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。一些實(shí)例中，這種復(fù)雜的分析方法用來(lái)分析沒(méi)有進(jìn)行擴(kuò)增放大的靶標(biāo)多核苷酸序列。適合復(fù)雜分析的方法，例如這里討論的方法，允許從更小的樣品中獲取更多的信息。這種對(duì)更小樣品的需求增加了研究人員為驗(yàn)證新方法或簡(jiǎn)化獲取數(shù)據(jù)而從人群中獲取更多個(gè)體的樣品的能力，當(dāng)然更小的微創(chuàng)技術(shù)也是必要的。當(dāng)不同的固體載體在復(fù)雜的分析方法中作為捕獲探針耦聯(lián)體的一部分而存在時(shí)， 這些不同的固體載體就可以通過(guò)編碼加以區(qū)分。任何編碼方案都可以使用。從方便角度看， 編碼方案可利用一種或多種不同的熒光集團(tuán)，例如熒光半導(dǎo)體納米晶體。高密度的光譜編碼方案也可以使用。一種或多種不同光譜編碼的捕獲探針耦聯(lián)體可以構(gòu)建出來(lái)。每種捕獲探針耦聯(lián)體上都包含一種或多種不同的捕獲探針，其被耦聯(lián)到固體載體上，而該固體載體通過(guò)一個(gè)或者多個(gè)熒光半導(dǎo)體納米晶體或熒光納米顆粒獲得特定的光譜編碼。這些不同的耦聯(lián)體可混合在一起分析，而不同的耦聯(lián)體可對(duì)應(yīng)不同的試驗(yàn)，那么不同的試驗(yàn)也可在耦聯(lián)體混合的狀態(tài)下完成。每個(gè)耦聯(lián)體因其所具有的光譜特性可進(jìn)行掃描分析，通過(guò)對(duì)其光譜特性的解碼可鑒定出該耦聯(lián)體中的固體載體和固定于其上的捕獲探針。由于半導(dǎo)體納米晶體，熒光納米顆粒及其組合數(shù)目眾多且可通過(guò)光譜特性加以區(qū)分，于是大量的捕獲探針及相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物就可同時(shí)進(jìn)行分析研究。D.粒子本發(fā)明將顆粒，微顆?；蛘呶⒅椋詈檬谴胖閼?yīng)用于基于微陣列芯片的分析中。顆?；蛘咧樽涌赏ㄟ^(guò)各種不同的聚合物進(jìn)行制備。這些聚合物包括但并不限于聚苯乙烯，交聯(lián)聚苯乙烯，聚丙烯酸，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸/聚羥基乙酸共聚物，聚酸酐，聚甲基丙烯酸甲酯，乙烯/醋酸乙烯酯共聚物，聚硅氧烷，聚硅，乳膠，葡聚糖聚合物和環(huán)氧樹(shù)脂?？梢岳斫?，這些聚合物在溶脹和孔隙方面具有不同的特性。顆?；蛘咧樽恿皆诩s10納米到 1毫米范圍內(nèi)，粒徑在100納米到10微米范圍會(huì)更好。當(dāng)這些顆粒懸浮在溶液中可通過(guò)常規(guī)的液體方面的技術(shù)對(duì)其加以操縱。術(shù)語(yǔ)“顆?！保爸樽印?，“球”，“微顆粒”，“微珠”和“微球”文中可相互替代。本發(fā)明中的微球可帶有檢測(cè)特性，這種檢測(cè)特性包括磁性，熒光，光吸收，反射，散射等。磁性顆粒適宜的化學(xué)成分可能是鐵磁材料，包括稀土比如含有鐵-鈷，鐵-鉬， 釤-鈷，釹-鐵-硼之類(lèi)的材料。其他的磁性材料，例如氧化鐵0^304)之類(lèi)的超順磁性材料也被使用。這些首選的磁性材料包括鐵-鈷材料都很容易被磁化，具有較強(qiáng)的磁化強(qiáng)度 (約1.7特斯拉)，且不易被腐蝕。由于顆粒的使用，昂貴的檢測(cè)儀器對(duì)結(jié)果檢測(cè)而言不是必需的。當(dāng)微陣列芯片上探針點(diǎn)的尺寸超過(guò)0. 03毫米時(shí)，結(jié)合到探針點(diǎn)上顆?？捎萌庋壑苯佑^察分析。另一種方
23式，當(dāng)探針點(diǎn)的尺寸在0. 01毫米到5毫米范圍時(shí)，其對(duì)應(yīng)的結(jié)果可用普通的相機(jī)/攝像機(jī)拍攝成像，或者通過(guò)一個(gè)適當(dāng)放大倍率的顯微鏡來(lái)觀察。當(dāng)然如果顆粒被修飾，比如用熒光，化學(xué)發(fā)光和酶標(biāo)記進(jìn)行修飾，那么相對(duì)應(yīng)的檢測(cè)方法就可用于結(jié)果檢測(cè)。例如用酶，二茂鐵或其他的電活性標(biāo)記對(duì)顆粒進(jìn)行修飾，就可用電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)，也可以基于表面等離子共振或者微天平技術(shù)進(jìn)行無(wú)標(biāo)記檢測(cè)。有可能的話，商用的熒光微陣列芯片掃描儀可用于檢測(cè)熒光標(biāo)記的顆?；蛘邘в凶陨頍晒獾念w粒。E.靶標(biāo)多核苷酸核酸靶序列(或“靶標(biāo)多核苷酸”)可以是單鏈，雙鏈，或多條鏈，也可以是線性或圓形。一般單鏈的靶標(biāo)多核苷酸，包括基因，rRNA基因，tRNA基因，hnRNA，小RNA，單鏈RNA 病毒基因組和單鏈DNA或類(lèi)病毒。這些多核苷酸可能包含內(nèi)部互補(bǔ)序列和重要的二級(jí)結(jié)構(gòu)。一般雙鏈的靶標(biāo)多核苷酸，包括基因組DNA，線粒體DNA，葉綠體DNA，雙鏈RNA或雙鏈 DNA病毒的基因組，質(zhì)粒，噬菌體，shRNA (小發(fā)夾RNA或短發(fā)夾RNA)，與siRNA (小干擾RNA)。 靶標(biāo)多核苷酸可以直接合成或從生物材料提取。靶標(biāo)多核苷酸可以純化，以消除或者減少不必需組成部分或進(jìn)行濃縮，這樣也有利于多核苷酸擴(kuò)增。相反，如果靶標(biāo)多核苷酸濃度過(guò)大，可先稀釋。經(jīng)過(guò)樣品采集和可選的核酸提取和純化，該靶標(biāo)多核苷酸或其部分組分，可以經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)操作過(guò)程。這些操作過(guò)程可以包括體外轉(zhuǎn)錄，標(biāo)記，片段化，擴(kuò)增和其他反應(yīng)。處理前，mRNA可先用逆轉(zhuǎn)錄酶和引物反轉(zhuǎn)錄成cDNA。核酸擴(kuò)增方法增加了序列拷貝數(shù)，同時(shí)可通過(guò)帶標(biāo)記的引物或帶標(biāo)記核苷酸的引入，將產(chǎn)物多核苷酸進(jìn)行標(biāo)記。有諸多擴(kuò)增方法可用，包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，自持續(xù)序列復(fù)制(3SR)，基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，滾環(huán)復(fù)制(RCA)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)， Q-Beta復(fù)制酶擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄，缺口翻譯擴(kuò)增，等等。特別指出，擴(kuò)增過(guò)程可同步進(jìn)行標(biāo)記。目前的檢測(cè)設(shè)備和方法可以適用檢測(cè)任何類(lèi)型的核苷酸。這些核苷酸，AMP, GMP, CMP，UMP，ADP，⑶P，CDP，UDP，ATP，GTP，CTP，UTP，dAMP, dGMP, dCMP, dTMP, dADP, dGDP, dCDP, dTDP, dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP。某些形式中，核酸靶序列并沒(méi)有對(duì)序列進(jìn)行直接標(biāo)記。如果對(duì)核酸靶序列進(jìn)行直接標(biāo)記，或者將帶標(biāo)記的核酸靶序列引入，這個(gè)標(biāo)記是不應(yīng)該干擾的捕獲探針結(jié)合能力以及檢測(cè)相關(guān)報(bào)告基團(tuán)。如果是單鏈靶標(biāo)多核苷酸，第一輪擴(kuò)增形成了含有引物并與靶標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的延伸物。如果靶標(biāo)多核苷酸是單鏈RNA，先使用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成DNA，再進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。用于PCR擴(kuò)增的引物必須能與模板進(jìn)行互補(bǔ)雜交，反復(fù)以3’進(jìn)行延伸，產(chǎn)生相應(yīng)長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物。靶標(biāo)多核苷酸經(jīng)由引物和聚合酶來(lái)擴(kuò)增，可以復(fù)制靶標(biāo)多核苷酸的全長(zhǎng)或其中一部分。任何有聚合酶活性的酶類(lèi)，都可能被用來(lái)復(fù)制的靶標(biāo)多核苷酸，包括DNA聚合酶，RNA 聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶，具有多重活性聚合酶。聚合酶耐熱或耐高溫。另外，酶的混合物也可采用。這些酶包括DNA聚合酶，比如DNA聚合酶I，Klenow片段，T4酶，T7酶，Tub酶，Taq酶， Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli酶，GB-DDNA聚合酶；RNA聚合酶，比如大腸桿菌， SP6，T3以及T7RNA聚合酶；反轉(zhuǎn)錄酶，如AMV，M_MuLV，MMLV，核糖核酸酶H減去MMLV，HIV-I 和RAV2逆轉(zhuǎn)錄酶。這些酶都可以在市場(chǎng)上找到。多重活性聚合酶，包括RAV2酶和Tli (外切)聚合酶。耐熱聚合酶，包括Tub酶，Taq酶，Tth酶，Pfx酶，Pfu酶，Tsp酶，Tfl酶，Tli 酶和GB-DDNA聚合酶。選擇適宜的反應(yīng)條件進(jìn)行多核苷酸擴(kuò)增，包括pH值，緩沖液，離子強(qiáng)度，存在一種或更多種的鹽離子，反應(yīng)物濃度和輔因子的濃度，如核苷酸，鎂或其他金屬離子，可選佐齊U，溫度，擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)的熱循環(huán)程序，并可能部分取決于使用的聚合酶以及樣品本身的性質(zhì)。佐劑包括甲酰胺(通常約2-10%)，甘油(通常約5-10%)，和DMSO(通常約 0.9-10%)。一些技巧可用于擴(kuò)增過(guò)程，以最大限度地減少假陽(yáng)性或錯(cuò)誤結(jié)果。這些技巧， 包括“降落”P(pán)CR技術(shù)，熱啟動(dòng)技術(shù)，嵌套引物，或設(shè)計(jì)PCR引物使其一旦有引物二聚體就造成莖環(huán)結(jié)構(gòu)以防止擴(kuò)增。也有加速聚合酶鏈反應(yīng)的技巧，例如，離心式PCR能促使更強(qiáng)的液體對(duì)流，還可以包括快速紅外線加熱和樣品冷卻?？刹捎靡粋€(gè)或多個(gè)循環(huán)，用以擴(kuò)增。使其中一個(gè)引物過(guò)量，可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中這條引物的延伸物過(guò)量，而此延伸物最好正是待檢測(cè)的目標(biāo)。多種不同的引物可用于擴(kuò)增樣本內(nèi)的不同區(qū)域的特定多核苷酸。此法可多重同步進(jìn)行，即多個(gè)不同的檢測(cè)可以同時(shí)運(yùn)行，使用不同的引物來(lái)針對(duì)不同的檢測(cè)區(qū)域；這些檢測(cè)區(qū)域可以是互不相關(guān)的靶標(biāo)片段，來(lái)自不同的等位基因，不同的等位基因亞型，或者染色體重排。這意味著允許在一個(gè)樣本(例如，cDNA文庫(kù)中的特定基因)對(duì)多個(gè)靶標(biāo)多核苷酸進(jìn)行定量。通過(guò)一種獨(dú)特的捕獲序列或一個(gè)獨(dú)特的標(biāo)記，可以對(duì)樣品中不同的多核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行區(qū)分。擴(kuò)增的靶標(biāo)多核苷酸還可以進(jìn)行后續(xù)相關(guān)處理。例如，在某些情況下，可以對(duì)它進(jìn)行小片段化，減少環(huán)狀結(jié)構(gòu)形成和避免糾結(jié)多個(gè)捕獲探針，從而有利于與多核苷酸陣列雜交。核酸片段化的方法很多，只要能產(chǎn)生合適的片段大小均可采用，以物理的、化學(xué)的和酶的方法為常見(jiàn)。擴(kuò)增的靶標(biāo)多核苷酸可以耦合到顆粒上，通過(guò)直接連接，或多核苷酸/顆粒上的修飾功能基團(tuán)。在一些具體形式中，靶標(biāo)多核苷酸被修飾，如生物素化。在其他一些形式中，這些顆粒被修飾了功能基團(tuán)，如鏈霉親和素，中性親和素，以及親和素等。靶標(biāo)多核苷酸可以通過(guò)這種修飾基團(tuán)和顆粒上的功能基團(tuán)來(lái)耦聯(lián)。對(duì)于雙鏈靶標(biāo)多核苷酸，與顆粒耦合之后可以用變性方法來(lái)制備單鏈靶標(biāo)多核苷酸；變性的方法，比如化學(xué)反應(yīng)，酶或加熱，或兩者兼而有之。在一些具體形式中，化學(xué)變性方法采用尿素，甲酰胺，甲醇，乙醇，酶，或氫氧化鈉。在一些具體形式中，酶法采用核酸外切酶和尿嘧啶N-糖苷酶。在其他一些具體形式中，雙鏈靶核酸熱變性采用30-95 °C之間的合適溫度。對(duì)本發(fā)明的方法適合于對(duì)某一樣品中的多個(gè)靶標(biāo)多核苷酸進(jìn)行分析。多個(gè)靶標(biāo)多核苷酸可以經(jīng)由多個(gè)擴(kuò)增引物產(chǎn)生，或一套擴(kuò)增引物產(chǎn)生，這些都是針對(duì)特定的核酸擴(kuò)增靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增。樣品可以是一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，含有已知的靶標(biāo)多核苷酸或相關(guān)成分。樣品也可以是陰性對(duì)照，雖然并不期望含有靶標(biāo)多核苷酸，但實(shí)際也可能含有，以用于測(cè)試，便于確認(rèn)給定實(shí)驗(yàn)所用的試劑沒(méi)有靶標(biāo)多核苷酸，以及確認(rèn)給定的試驗(yàn)條件是否產(chǎn)生假陽(yáng)性，即無(wú)靶標(biāo)多核苷酸情況下還有陽(yáng)性信號(hào)。樣品可稀釋?zhuān)芙?，懸浮，提取或以其他方式處理，以獲得或純化靶標(biāo)多核苷酸，方便后續(xù)核酸擴(kuò)增或檢測(cè)。如果樣品含有細(xì)胞，這些細(xì)胞可以裂解或通透釋放細(xì)胞內(nèi)的多核苷酸。通透試劑也可用于裂解細(xì)胞，方便后續(xù)操作，比如聚合酶鏈反應(yīng)。
F.遺傳信息本專(zhuān)利所指基于微陣列的分析方法可適用于檢測(cè)任何遺傳信息。例如，遺傳信息可以是基因突變形式中的一種或幾種，包括堿基替換，插入，刪除，及插入刪除等。某一種具體的情況，此遺傳信息可以是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。某一種具體的情況，此遺傳信息可以是基因。某一種具體的情況，遺傳信息是基因產(chǎn)物，包括蛋白質(zhì)，抗體，小分子化合物，肽和碳水化合物。該靶標(biāo)等位基因可能存在單堿基替換，插入，或刪除，或多個(gè)基替換，插入，或刪除，或插入刪除。此外，核苷酸也可能有修飾，包括重排，添加，替換或改變的嘌呤或嘧啶堿基的氫鍵形成，能影響各自互補(bǔ)的嘌呤嘧啶或功能。由此產(chǎn)生的改性核苷酸可以與其他改性的核苷酸形成互補(bǔ)配對(duì)，而不是通常的A、T、C、G或U。這些改性應(yīng)該不影響核苷酸的功能。部分或全部多核苷酸殘基都可以根據(jù)需要進(jìn)行修改。線粒體DNA (mtDNA)在有絲分裂和減數(shù)分裂期間都要經(jīng)過(guò)復(fù)制分離，加之mtDNA突變率高，使得體細(xì)胞和生殖細(xì)胞中可以同時(shí)具有突變型和野生型mtDNA分子，稱(chēng)為異質(zhì)性 (heteroplasmy)。異質(zhì)性細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂后，隨機(jī)分配到兩個(gè)子代細(xì)胞，突變型和野生型mtDNA的比例發(fā)生改變，分別向純合突變型或純合野生型漂變，再經(jīng)過(guò)多次分裂后，細(xì)胞達(dá)到完全純合，稱(chēng)為均質(zhì)性(homoplasmy)。異質(zhì)性和復(fù)制分離現(xiàn)象表明，即使核基因組完全相同的個(gè)體，如一卵雙生，也可具有不同的細(xì)胞質(zhì)基因型，從而表型有所不同。典型的AT和GC堿基對(duì)之間由氫鍵來(lái)形成，即胸苷的N3-H及C4-0H和腺苷的m-OH 及C6-NH2分別形成氫鍵，胞苷的C2-0H，N3-NH2及C4-NH2和鳥(niǎo)苷的C2_NH2，N，-H及C6-0H 分別形成氫鍵。因此，舉例來(lái)說(shuō)，鳥(niǎo)苷可以被改性，形成異鳥(niǎo)苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖嘌呤)，將不能有效地與胞嘧啶形成典型的氫鍵。然而，胞嘧啶改性，形成異胞嘧啶 (1- β -D-呋喃核糖-2-氨基-4-氧嘧啶)，將不會(huì)有效地與鳥(niǎo)苷形成堿基對(duì)，而與異鳥(niǎo)苷則可以。多態(tài)性區(qū)域，這里定義為遺傳位點(diǎn)的一部分，至少包含一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。而遺傳位點(diǎn)是位于染色體上與基因，身體特征，表型性狀相關(guān)的位置。多態(tài)性位點(diǎn)是在人群中存在并至少有兩個(gè)替換性的序列位置。多態(tài)性區(qū)域此處定義指相對(duì)于多態(tài)性位點(diǎn)來(lái)說(shuō)的，即該區(qū)域可能是相鄰位點(diǎn)的5’端或位點(diǎn)的3’端，或者多態(tài)性區(qū)域可能包含多態(tài)性位點(diǎn)。多態(tài)性區(qū)域可以包括含有多態(tài)性位點(diǎn)的多核苷酸正義鏈和反義鏈，并且長(zhǎng)度可能約100至5000個(gè)堿基對(duì)。例如，多態(tài)性區(qū)域可能是基因調(diào)控區(qū)域的全部或部份，如啟動(dòng)子，5’非編碼區(qū)，3’ 非編碼區(qū)，內(nèi)含子，外顯子等。多態(tài)性或等位的變種，可以是基因組DNA，cDNA，mRNA或多肽， 其具有核苷酸或者氨基酸序列的多態(tài)性位點(diǎn)。多態(tài)性位點(diǎn)是序列變異所產(chǎn)生的位點(diǎn)，包括核苷酸替換(單核苷酸多態(tài)性或SNPs)，插入，刪除，插入刪除和微衛(wèi)星。多態(tài)性位點(diǎn)可能會(huì)也可能不會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)，蛋白結(jié)構(gòu)或蛋白功能的差異。單體型此處定義為在染色體對(duì)的一條染色體上遺傳多態(tài)性位點(diǎn)組合的表現(xiàn)類(lèi)型。 基因型則指多態(tài)性位點(diǎn)處的表現(xiàn)類(lèi)型。本領(lǐng)域人士應(yīng)該知道，與多態(tài)性區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸能夠在一定嚴(yán)謹(jǐn)條件下與多態(tài)性位點(diǎn)區(qū)域雜交，并進(jìn)行分析，如引物延伸的序列測(cè)定方法，限制性位點(diǎn)分析，核酸擴(kuò)增方法，基于連接酶的測(cè)序方法，基于不匹配的序列測(cè)定方法，基于基因芯片的序列測(cè)定方
YA J寸寸ο
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G.用于靶標(biāo)多核苷酸擴(kuò)增的寡核苷酸引物在某些方面，這個(gè)發(fā)明還體現(xiàn)在那些適用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或其他核酸擴(kuò)增方法寡核苷酸引物對(duì)上。運(yùn)用已有的知識(shí)并結(jié)合此處所學(xué)，普通本領(lǐng)域人士就能夠設(shè)計(jì)出合適的寡核苷酸引物對(duì)。運(yùn)用這一方法設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物對(duì)系列見(jiàn)表2，這些特異性寡核苷酸引物對(duì)適用于擴(kuò)增GJB2，SLC26A4和12S rRNA上多態(tài)性位點(diǎn)所在的多態(tài)性區(qū)域。其他適合擴(kuò)增GJB2，SL(^6A4和12S rRNA上多態(tài)性區(qū)域的寡核苷酸引物對(duì)，也可以運(yùn)用類(lèi)似方法設(shè)計(jì)出來(lái)并且可以避免多余的實(shí)驗(yàn)。另一些方面，一個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)應(yīng)于至少兩個(gè)等位基因特異性引物。其中一個(gè)等位基因特異性引物包含一段相同或互補(bǔ)的含有突變位點(diǎn)的突變型等位基因的目標(biāo)片段。等位基因特異性引物與模板結(jié)合可終止在突變位點(diǎn)的3’端。為了提高分辨靶基因上野生型和突變型等位基因的能力，在等位基因特異性引物中可以引入人工錯(cuò)配。人工錯(cuò)配可以是天然的堿基，也可以是核苷酸類(lèi)似物。該發(fā)明中的每個(gè)PCR弓丨物對(duì)可以用于任何PCR方法。 例如，該發(fā)明中的PCR引物被運(yùn)用在美國(guó)的專(zhuān)利第4683195，4683202，4965188，5656493， 5998143,6140054, WO 01/27327和WO 01/27329中涉及的方法，諸如此類(lèi)的還有很多。本發(fā)明中的PCR引物對(duì)也可用在進(jìn)行PCR反應(yīng)任何商用儀器，例如Applied Biosystems公司提供的GeneAmp 系統(tǒng)?，F(xiàn)有引物可包括任何合適的核酸類(lèi)型，例如DNA，RNA，PNA或其衍生物。另外，這些引物可以包括一段核苷酸序列或其互補(bǔ)鏈，具體的見(jiàn)表2所示。寡核苷酸引物可由任何適當(dāng)?shù)姆椒ê铣?。例如，引物可以化學(xué)合成，也可以從天然來(lái)源中分離得到，也可以用重組的方法生產(chǎn)，或者多種方法結(jié)合使用。合成寡核苷酸也可以通過(guò)三酯法制備(Matteucci et al.，J. Am. Chem. Soc.，3 :3185-3191 (1981))。另外，自動(dòng)合成可能是首選，例如，在一個(gè)Applied Biosynthesis DNA合成儀上使用氰乙基亞磷酰胺化學(xué)合成法。當(dāng)然，引物最好是化學(xué)合成的。在本發(fā)明中，適用于合成寡核苷酸引物的堿基可以從自然的核苷酸堿基中選擇， 如腺嘌呤，胞嘧啶，鳥(niǎo)嘌呤，尿嘧啶和胸腺嘧啶。它也可以從非自然或合成的核苷酸堿基中選擇，如如8-羰基鳥(niǎo)嘌呤，6-巰基鳥(niǎo)嘌呤，4-乙酰胞苷，5-(羧基羥乙基)尿苷，2’-氧化甲基胞苷，5-羧基甲氨基-甲基-2-硫嘧啶，5-羧基甲氨基尿苷，二氫尿嘧啶核苷，2’-氧化甲基假尿苷，β -D-半乳糖苷-7- (4，5-順式)-二羥-2-環(huán)戊烯，2’ -氧化甲基鳥(niǎo)苷，肌苷，腺苷-異戊烯腺苷，I"甲基腺苷，I"甲基假尿苷，I"甲基鳥(niǎo)苷，I"甲基肌苷，2，2- 二甲基鳥(niǎo)苷， 2-甲基腺苷，2-甲基鳥(niǎo)苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，腺苷-甲基腺苷，7-甲基鳥(niǎo)苷，5-甲基氨甲基尿苷，5-甲氧基氨甲基-2-硫尿苷，β -D-甘露糖基-7- (4，5-順式)-二羥-2-環(huán)戊烯，5-甲氧基羰甲基尿苷，5-甲氧基尿苷，2-甲硫基-Ν6-異戊烯腺苷，N- ((9-, β . -D-呋喃核糖-2-甲基硫嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸，N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基) N-甲基氨基甲酰)蘇氨酸，尿苷-5-氧乙酸甲酯，尿苷-5-氧乙酸，wybutoxosine，假尿苷， 7- (4，5-順式)-二羥-2-環(huán)戊烯，2-巰基胞苷，5-甲基-2-硫尿核苷，2-硫尿核苷，2-硫尿核苷，5-甲基尿苷，N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)氨基甲酰)蘇氨酸，2’ -氧化甲基-5-甲基尿苷，2’ -氧化甲基尿嘧啶核苷，wybutosine和3_(3_氨基_3_羧丙基)尿苷。同樣的，寡核苷酸的化學(xué)類(lèi)似物也可被利用(例如，寡核苷酸中的磷酸二酯鍵被修飾為磷酸甲酯，磷酸三酯，硫代磷酸酯，或氨基磷酸酯)。用3’端加帽”的方法可以保護(hù)寡核苷酸免受降解，因?yàn)樵?’端加帽后，3’端的磷酸二酯鍵被抗核酸酶的鍵取代Ghaw et al·，Nucleic Acids Res.，19 :747 (1991))。在這種方式中，磷酰胺，磷酸酯和磷酸甲基鍵都充分體現(xiàn)其功能。在磷酸骨干進(jìn)行更廣泛的修飾已被證明能夠增加穩(wěn)定性，同時(shí)增強(qiáng)親和力，及提高寡核苷酸細(xì)胞滲透力(Milligan et al.，J. Med. Chem.，36 1923 (1993))。許多不同化學(xué)方法的運(yùn)用可使整個(gè)磷酸骨架被新的鍵所取代。骨架類(lèi)似物有很多，例如磷硫酰，二硫代磷酸酯，磷酸甲酯，氨基磷酸酯，硼烷磷酸酯，磷酸三酯，甲酰醛縮醇，3’ -巰基甲酰醛縮醇，5’ -巰基甲酰醛縮醇，5’ -硫醚，碳酸鹽，5’ -N氨基甲酸酯，硫酸，磺酸，氨基磺酸，磺胺類(lèi)，砜，亞硫酸鈉，亞砜，硫化物，羥胺，亞甲基等。磷硫酰和磷酸甲酯修飾是常見(jiàn)的寡核苷酸修飾，因?yàn)樗鼈儜?yīng)用于自動(dòng)寡核苷酸的合成過(guò)程中。寡核苷酸可能是一個(gè)肽核酸， 如 Milligan 描述的那樣(Milligan et al.，J. Med. Chem.，36 1923 (1993))。唯一的要求是，寡核苷酸引物序列應(yīng)具有至少部分能與目標(biāo)序列互補(bǔ)的一段序列。靶標(biāo)多核苷酸可能是雙鏈，也可能是單鏈。在一些具體事例中，單鏈靶標(biāo)多核苷酸的至少部分與固定在微陣列上的寡核苷酸探針完全或大體上互補(bǔ)。在其他事例中，單鏈靶標(biāo)多核苷酸與固定在微陣列上的寡核苷酸探針是完全互補(bǔ)的。圖3是發(fā)明示意圖，是基于微陣列方法結(jié)合微粒以及發(fā)光體，用于檢測(cè)靶標(biāo)雙鏈多核苷酸。利用PCR、RT-PCR或其他相關(guān)方法，可將多核苷酸分子轉(zhuǎn)換成生物素、地高辛等標(biāo)記的多核苷酸片段，容易與顆粒表面基團(tuán)耦聯(lián)。通過(guò)耦聯(lián)，溶液中的多核苷酸片段能得到富集。對(duì)雙鏈多核苷酸片段，它們可以通過(guò)變性成為單鏈多核苷酸。通過(guò)靶標(biāo)-探針雜交反應(yīng)，顆粒能耦合到特定微陣列表面，它們本身或者對(duì)其進(jìn)一步修飾，能方便地通過(guò)非昂貴的檢測(cè)設(shè)備或商用芯片掃描儀的來(lái)讀取結(jié)果。特定的基因，基因突變，如刪除，插入，和插入刪除等，能因此得到檢測(cè)。此發(fā)明允許任何方法來(lái)檢測(cè)多核苷酸，這里更特指檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)。例如，等位基因特異性引物方法，引物延伸方法，基于連接酶的序列測(cè)定方法，基于不匹配的序列測(cè)定方法，或基于微陣列的序列測(cè)定方法。另外，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)，單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)(SSCP)，變性梯度(DGGE)凝膠電泳，變性高效液相色譜(DHPLC) ,TaqMan PCR等，都可以使用。等位基因特異性引物用于檢測(cè)基因突變，分兩種策略，一種是采用等位基因特異性探針陣列，另一種是采用通用標(biāo)簽微陣列。等位基因特異性PCR(ASPCR)也被稱(chēng)作擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)(ARMQ或PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)方法，具有很高的突變位點(diǎn)分辨能力。ASPCR適合已知多態(tài)性位點(diǎn)的基因序列分析，采用的DNA聚合酶沒(méi)有3’ -5’外切酶活性，如果3’端特異性引物與模板不匹配，此引物不能延伸從而導(dǎo)致PCR反應(yīng)被阻止。利用多重PCR技術(shù)，可以同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，然后用DNA芯片進(jìn)行區(qū)分。多重PCR擴(kuò)增可以在單個(gè)管子或不同的管子中進(jìn)行。采用通用陣列技術(shù)，標(biāo)簽序列結(jié)合在引物上，其PCR產(chǎn)物可以方便地與標(biāo)簽探針雜交。微陣列在這里只是作為一個(gè)解碼工具。標(biāo)簽序列(Tag)是人工設(shè)計(jì)的并加以嚴(yán)格篩選，他們有相應(yīng)的互補(bǔ)序列，即cTag等。每個(gè)標(biāo)簽序列及其互補(bǔ)標(biāo)簽序列的組合對(duì)應(yīng)等位基因上的一個(gè)基因突變位點(diǎn)。不同標(biāo)簽序列之間的Tm值不大于5°C，并且標(biāo)簽序列相互之間或者與引物之間無(wú)交叉雜交，與物種基因組DNA同源性很低，并且沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)?；蚧蚧蛐褪歉鶕?jù)雜交信號(hào)以及微陣列上標(biāo)簽探針的位置來(lái)確定的。
圖4為通用標(biāo)簽陣列的一個(gè)具體例子，與遺傳性耳聾相關(guān)的8個(gè)SNP/突變檢測(cè)相對(duì)應(yīng)，其布局包括16種標(biāo)簽，并且每種標(biāo)簽水平重復(fù)5次。組成通用標(biāo)簽探針陣列的標(biāo)簽核苷酸序列如表1所示。在一些變化形式中，每個(gè)標(biāo)簽探針進(jìn)行5，-氨基修飾，其中5 ’端還含有15聚胸苷的連接序列。QC和BC分別代表微陣列制作效果的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。PC和NC 分別代表微陣列雜交過(guò)程的陽(yáng)性和陰性對(duì)照。MC代表顆粒表面修飾基團(tuán)與靶標(biāo)多核苷酸耦聯(lián)的陽(yáng)性對(duì)照。這些考慮確保檢測(cè)過(guò)程中的每個(gè)步驟以及最終結(jié)果是正確無(wú)誤的。當(dāng)然， 針對(duì)特定的應(yīng)用，人們可以使用更多或更少標(biāo)簽序列，以及水平復(fù)制的次數(shù)或不復(fù)制。這些標(biāo)簽序列是由生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)的。標(biāo)簽探針序列與靶標(biāo)基因生物物種沒(méi)有同源性。例如，如果靶標(biāo)來(lái)源是人類(lèi)，標(biāo)簽序列可以來(lái)自細(xì)菌序列。這種標(biāo)簽序列可以是單鏈寡核苷酸或肽核酸。本發(fā)明所指的通用標(biāo)簽微陣列與普通芯片是不同的。對(duì)于常見(jiàn)的基因微陣列，探針序列可能是基因特異性的寡核苷酸或多態(tài)性位點(diǎn)特異性寡核苷酸，這樣對(duì)不同的靶基因或多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)需要不同的探針類(lèi)型。然而，通用標(biāo)簽微陣列是由專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的標(biāo)簽序列探針組成的，因此他們并不與基因特異性引物或等位基因特異性寡核苷酸直接相關(guān)。該標(biāo)簽序列可以作為同一物種基因突變或不同物種的基因突變的代碼。利用此通用的陣列格式，可用于檢測(cè)任何基因或基因型，即檢測(cè)過(guò)程變成類(lèi)似于解碼過(guò)程。H.試劑盒本發(fā)明也提供一種試劑盒，用于檢測(cè)分子相互作用，包含發(fā)光體，顆粒，微陣列和芯片上固定的探針?lè)肿印Ｔ谀承┓矫?，發(fā)明的試劑盒含有通用探針序列微陣列。對(duì)檢測(cè)多態(tài)性位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的試劑盒包括一套等位基因特異性擴(kuò)增引物和熒光標(biāo)記的下游共用引物，如表2所示。本發(fā)明的試劑盒還可能包括例如聚合劑(比如耐高溫的核酸聚合酶)， 等等。本發(fā)明的試劑盒還可能包括用于核苷酸鏈延伸的試劑，諸如dATP，dTTP，dGTP，dCTP， dITP，及它們的類(lèi)似物，只要能在耐熱性核酸聚合酶催化下作為基質(zhì)加入到核酸延伸鏈中即可。更具體的來(lái)說(shuō)，試劑盒包括至少一對(duì)的寡核苷酸引物，聚合劑，鏈延伸用的核苷酸。本發(fā)明的試劑盒還可以包括緩沖液，容器，微孔板，使用說(shuō)明書(shū)等。下面的實(shí)施例是用來(lái)解釋本發(fā)明，而不是對(duì)發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例1、應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)遺傳性耳聾以下以檢測(cè)遺傳性耳聾相關(guān)的8個(gè)SNP/突變的試劑盒為例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體闡述。一、微陣列芯片通用標(biāo)簽陣列是由16個(gè)標(biāo)簽探針組成的矩陣，能與多重PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交反應(yīng)， 另外還有用于質(zhì)控微陣列制作效果的陽(yáng)性對(duì)照OiC)和陰性對(duì)照(BC)，質(zhì)控微陣列雜交過(guò)程的陽(yáng)性對(duì)照(PC)和陰性對(duì)照(NC)，以及質(zhì)控顆粒表面鏈霉親和素與生物素化靶標(biāo)多核苷酸耦聯(lián)的陽(yáng)性對(duì)照(MC)。陽(yáng)性對(duì)照OiC)是一種一端標(biāo)記HEX熒光、另一端氨基修飾的寡核苷酸探針，用于監(jiān)察微陣列點(diǎn)制和陣列上固定的效果。陰性對(duì)照(BC)僅是陣列點(diǎn)制緩沖液，用于監(jiān)測(cè)交叉污染的可能性。陰性對(duì)照(NC)是一種氨基修飾的寡核苷酸探針，理論上不會(huì)與溶液中的任何分子進(jìn)行雜交，用于監(jiān)測(cè)非特異性雜交的可能性。PC是一種氨基修飾的寡核苷酸探針，能與看家基因PCR產(chǎn)物雜交，用于監(jiān)測(cè)PCR和雜交效果。MC是一種氨基修飾的生物素化寡核苷酸探針，能結(jié)合鏈霉親和素涂層的顆粒，用于監(jiān)測(cè)鏈霉親和素與生物素化DNA片段的結(jié)合能力。通用標(biāo)簽陣列的探針依格式進(jìn)行設(shè)計(jì)NH2-TTTTTTTTTTTTTTT-TagX，其中X是一個(gè) 1到16的序數(shù)。探針5’端有氨基修飾，接著是15聚胸苷(dTM)，再接著分別為表1所列 Tagl到Tagl6的序列。標(biāo)簽探針中Tagl到Tagl6的核苷酸序列與擴(kuò)增引物中的Tagl到 TaglB的其核苷酸序列一一對(duì)應(yīng)相同。通用標(biāo)簽陣列上的探針見(jiàn)表1。表1通用標(biāo)簽陣列上的探針
權(quán)利要求
1.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒，為如下⑴或⑵或⑶或⑷或(5)(1)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由權(quán)利要求6所述的引物組I、權(quán)利要求9所述的引物組II、權(quán)利要求12所述的引物組III、權(quán)利要求15所述的引物組IV、權(quán)利要求18所述的引物組V、權(quán)利要求21所述的引物組VI、權(quán)利要求M所述的引物組VII 和權(quán)利要求27所述的引物組VIII組成；(2)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由權(quán)利要求7所述的引物組I、權(quán)利要求10所述的引物組II、權(quán)利要求13所述的引物組III、權(quán)利要求16所述的引物組IV、權(quán)利要求19所述的引物組V、權(quán)利要求22所述的引物組VI、權(quán)利要求25所述的引物組VII 和權(quán)利要求洲所述的引物組VIII組成；(3)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由權(quán)利要求8所述的試劑I、權(quán)利要求11所述的試劑II、權(quán)利要求14所述的試劑III、權(quán)利要求17所述的試劑IV、權(quán)利要求 20所述的試劑V、權(quán)利要求23所述的試劑VI、權(quán)利要求沈所述的試劑VII和權(quán)利要求四所述的試劑VIII組成；(4)所述試劑盒包括引物組合物；所述引物組合物由如下組分中的一種或幾種組成 權(quán)利要求6或7所述的引物組I、權(quán)利要求9或10所述的引物組II、權(quán)利要求12或13所述的引物組III、權(quán)利要求15或16所述的引物組IV、權(quán)利要求18或19所述的引物組V、權(quán)利要求21或22所述的引物組VI、權(quán)利要求M或25所述的引物組VII和權(quán)利要求27或 28所述的引物組VIII ；(5)所述試劑盒包括試劑組合物；所述試劑組合物由如下組分中的一種或幾種組成 權(quán)利要求8所述的試劑I、權(quán)利要求11所述的試劑II、權(quán)利要求14所述的試劑III、權(quán)利要求17所述的試劑IV、權(quán)利要求20所述的試劑V、權(quán)利要求23所述的試劑VI、權(quán)利要求沈所述的試劑VII和權(quán)利要求四所述的試劑VIII。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括基片、所述試劑組合物和顆粒；所述試劑組合物中的探針組固定于所述基片上，形成微陣列芯片；所述基片的材質(zhì)為硅、玻璃、塑料、水凝膠、硝酸纖維或尼龍；所述顆粒為微球或磁性微球。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述微陣列芯片上還排列有陽(yáng)性對(duì)照MC、 陽(yáng)性對(duì)照PC、陰性對(duì)照NC和陽(yáng)性對(duì)照QC ；所述陽(yáng)性對(duì)照MC為序列表的序列17所示的DNA 或在序列表的序列17所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA ；所述陽(yáng)性對(duì)照PC為序列表的序列18所示的DNA或在序列表的序列18所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述陰性對(duì)照NC為序列表的序列19所示的DNA或在序列表的序列19所示DNA 的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述陽(yáng)性對(duì)照QC為序列表的序列20所示的DNA 或在序列表的序列20所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為 5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括序列表的序列46所示的DNA和如下DNA (A)或(B)(A)序列表的序列45自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA；(B)序列表的序列45所示的DNA。
5.如權(quán)利要求2至5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述顆粒為鏈霉親和素包被的顆粒；序列表的序列46所示DNA的5’末端連接有生物素，自5’末端第8位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3 ；序列表的序列17所示DNA的3’末端連接有生物素；序列表的序列20所示 DNA的3，末端連接熒光素HEX。
6.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組I，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21自5’末端第23至 42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列22自5，末端第23至41位核苷酸所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列21所示的DNA、序列表的序列22所示的DNA和序列表的序列23所示的DNA。
7.如權(quán)利要求6所述的引物組I，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列23所示DNA的5’末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列23所示的DNA自5’ 末端第4位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
8.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑I，由權(quán)利要求6或7所述引物組I和探針組I組成；所述探針組I為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列1所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列2所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
9.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組II，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M自5’末端第23至 42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列25自5，末端第23至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列26所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列M所示的DNA、序列表的序列25所示的DNA和序列表的序列沈所示的DNA。
10.如權(quán)利要求9所述的引物組II，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列沈所示DNA的5’末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列沈所示的DNA自 5’末端第6位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
11.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑II，由權(quán)利要求9或10所述引物組II和探針組II組成；所述探針組II為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列3所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列4所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
12.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組III，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27自5’末端第25至 42位核苷酸所示的DNA、序列表的序列觀自5，末端第M至40位核苷酸所示的DNA和序列表的序列四所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列27所示的DNA、序列表的序列觀所示的DNA和序列表的序列四所示的DNA。
13.如權(quán)利要求12所述的引物組III，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列 29所示DNA的5’末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列四所示的DNA 自5’末端第6位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
14.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑III，由權(quán)利要求12或13所述引物組III和探針組 III組成；所述探針組III為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列5所示DNA和序列表的序列6所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列5所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列6所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
15.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組IV，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30自5’末端第25至 43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列31自5，末端第25至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列30所示的DNA、序列表的序列31所示的DNA和序列表的序列32所示的DNA。
16.如權(quán)利要求15所述的引物組IV，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列32 所示DNA的5’末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列32所示的DNA自 5’末端第6位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
17.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑IV，由權(quán)利要求15或16所述引物組IV和探針組IV 組成；所述探針組IV為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列7所示DNA和序列表的序列8所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列7所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列8所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
18.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組V，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33自5’末端第25至 47位核苷酸所示的DNA、序列表的序列34自5，末端第M至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列33所示的DNA、序列表的序列；34所示的DNA和序列表的序列35所示的DNA。
19.如權(quán)利要求18所述的引物組V，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列35 所示DNA的5’末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列35所示的DNA自 5’末端第6位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
20.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑V，由權(quán)利要求18或19所述引物組V和探針組V組成； 所述探針組V為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列9所示DNA和序列表的序列10所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列9所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列10所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
21.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組VI，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36自5’末端第23至 45位核苷酸所示的DNA、序列表的序列37自5，末端第23至43位核苷酸所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列36所示的DNA、序列表的序列37所示的DNA和序列表的序列38所示的DNA。
22.如權(quán)利要求21所述的引物組VI，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列38 所示DNA的5’末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列38所示的DNA自 5’末端第5位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
23.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑VI，由權(quán)利要求21或22所述引物組VI和探針組VI 組成；所述探針組VI為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列11所示DNA和序列表的序列12所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列11所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列12所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
24.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組VII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39自5’末端第24至 46位核苷酸所示的DNA、序列表的序列40自5，末端第M至45位核苷酸所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列39所示的DNA、序列表的序列40所示的DNA和序列表的序列41所示的DNA。
25.如權(quán)利要求M所述的引物組VII，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列 41所示DNA的5，末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列41所示的DNA 自5’末端第4位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
26.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑VII，由權(quán)利要求M或25所述引物組VII和探針組 VII組成；所述探針組VII為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列13所示DNA和序列表的序列14所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列13所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列14所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
27.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的引物組VIII，為如下(a)或(b)(a)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42自5’末端第23至 43位核苷酸所示的DNA、序列表的序列43自5，末端第23至44位核苷酸所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA ；(b)由如下三種核苷酸序列的DNA組成的引物組序列表的序列42所示的DNA、序列表的序列43所示的DNA和序列表的序列44所示的DNA。
28.如權(quán)利要求27所述的引物組VIII，其特征在于所述(a)或(b)中，序列表的序列 44所示DNA的5，末端連接有生物素；所述(a)或(b)中，所述序列表的序列44所示的DNA 自5’末端第4位核苷酸標(biāo)記有熒光素Cy3。
29.輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑VIII，由權(quán)利要求27或28所述引物組VIII和探針組 VIII組成；所述探針組VIII為如下(a)或(b)或(c)(a)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組序列表的序列15所示DNA和序列表的序列16所示DNA ；(b)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA ；(c)由如下兩種核苷酸序列的DNA組成的探針組在序列表的序列15所示DNA的5’末端連接特異片段得到的DNA和在序列表的序列16所示DNA的5’末端連接所述特異片段得到的DNA ；所述特異片段為5-30個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基；所述特異片段優(yōu)選為15個(gè)脫氧核糖核苷酸T組成的DNA，且5’末端第一位核苷酸修飾有氨基。
30.權(quán)利要求6至四中任一所述引物組或試劑在制備輔助檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種磁珠與發(fā)光體共標(biāo)記以檢測(cè)遺傳性耳聾的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括針對(duì)GJB2(Cx26)基因、SLC26A4(PDS)基因和12S rRNA(MTRNR1)基因上的八個(gè)遺傳性耳聾的基因位點(diǎn)的引物組合物和探針組合物，可用于準(zhǔn)確判斷相關(guān)位點(diǎn)為野生型、純合突變型或者雜合突變型，以實(shí)現(xiàn)遺傳性耳聾分子診斷。該引物組合物包含一些經(jīng)發(fā)光體標(biāo)記的引物。應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒可以通過(guò)熒光顯微鏡、微陣列激光掃描儀、價(jià)廉的設(shè)備或者肉眼觀察進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明提供的引物組、試劑組以及試劑盒可以用于遺傳性耳聾的臨床輔助診斷及篩查，實(shí)現(xiàn)遺傳性耳聾的早期發(fā)現(xiàn)、提早預(yù)防以及產(chǎn)前指導(dǎo)，具有重大的商業(yè)價(jià)值和社會(huì)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102453761SQ20101052768
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者程京, 蔣迪, 邢婉麗, 項(xiàng)光新, 高華方 申請(qǐng)人:博奧生物有限公司, 清華大學(xué)