專利名稱：石蒜微衛(wèi)星分子標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子標記技術(shù)，具體涉及一種石蒜微衛(wèi)星分子遺傳標記。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA又稱作短串連重復(fù)(Short Tandem R印eats，STRs)、簡單重復(fù)序列 (Simple Sequence Repeat, SSRs)、簡單序列長度多態(tài)性(SSLP)。是指基因組中以1 6 個核苷酸為單位串聯(lián)組成的核苷酸序列。.根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成，微衛(wèi)星DNA序列被分為3 種類型單一型，復(fù)合型(compound)和間斷型(interrupted)。例如單一型:ATATATATATATATATATATATAT復(fù)合型:ATATATCACACACACACACAC間斷型ATATATCA ATATATCA ATATATA微衛(wèi)星DNA作為一種分子標記具有以下特點廣泛分布于真核生物的基因組中， 據(jù)估計每6kb長度中就有1個微衛(wèi)星位點；核心序列的重復(fù)次數(shù)在個體間呈高度變異性，多 態(tài)性信息容量高呈共顯性，遵循盂德爾法則遺傳；選擇中性等等?；谝陨咸攸c，微衛(wèi)星DNA被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定 和種質(zhì)保存、數(shù)量性狀基因的分析、輔助育種、構(gòu)建指紋圖譜、遺傳多樣性及物種進化與親 緣關(guān)系等方面的研究。石蒜是石蒜科石蒜屬為多年生的草本花卉植物。石蒜屬植物不僅具有極高的觀賞 價值，還是一類重要的藥用植物。石蒜屬植物鱗莖有毒性，性甘溫，《閩東本草》載“本品內(nèi) 服可清熱、解毒、散結(jié)、消腫”。經(jīng)研究，石蒜屬鱗莖含有石蒜堿，石蒜胺堿、石蒜倫堿、加蘭他 敏、多花水仙堿、偽石蒜堿、類石蒜堿、二氫石蒜堿、雪花蓮胺堿、石蒜酊、石蒜醇等十多種生 物堿。石蒜藥理作用主要有如下幾個方面(1)作用于心血管系統(tǒng)；(2)作用于神經(jīng)系 統(tǒng)；(3)細胞毒作用；(4)抗癌抗腫瘤作用；(5)抗炎、抗菌抗病毒作用。我國天然藥物研究 人員從20世紀50年代開始石蒜科生物堿的研究和藥物開發(fā)。1964年10月，新藥氫溴酸加 蘭他敏通過臨床鑒定，現(xiàn)已收入中國藥典(二部)中。后來又研發(fā)出二氫加蘭他敏，主要用 于治療小兒麻痹后遺癥和外傷性截癱等病癥，其毒性比加蘭他敏小，該藥是我國具有創(chuàng)新 性的膽堿酯酶抑制劑；1983年，抗腫瘤新藥氧化石蒜堿(石蒜堿內(nèi)銨鹽)通過臨床鑒定，用 于多種腫瘤的治療而毒副作用較低。石蒜中提出藥物——加蘭他敏的藥效作用已獲得了世 界神經(jīng)病學會的認可。2002年該藥已獲準在美國、加拿大上市，先前已在21個國家，含大多 數(shù)的歐洲主要市場獲得了批準和上市。石蒜鱗莖含有淀粉40%，可加工成漿糊和漿沙，或制 成石蒜粉，用于建筑涂料；也可利用石蒜試制酒精，如果工藝成熟后運用到生產(chǎn)中，將在一 定程度上減少對糧食的利用；提取的植物膠可代替阿拉伯膠；石蒜堿等毒性較大，將其提 取制成高效殺蟲、殺菌的低濃度生物農(nóng)藥，可用于防治農(nóng)作物害蟲，且不會產(chǎn)生環(huán)境污染。石蒜的分子標記研究起步很晚，目前報道的只是RAPD分子標記，ISSR分子標記， 微衛(wèi)星標記尚未見報道。但RAPD分子標記穩(wěn)定性，重復(fù)性差，ISSR分子標記通常為顯性標記，不能區(qū)分純和基因型和雜合基因型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題分離克隆石蒜的微衛(wèi)星DNA分子標記，建立石蒜微衛(wèi)星 DNA技術(shù)體系并用這些分子標記研究石蒜遺傳多樣性保護，石蒜屬植物種間和居群間的變 異和進化關(guān)系以及進行石蒜品種鑒定。實現(xiàn)上述發(fā)明的技術(shù)方案包括石蒜微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建；含微衛(wèi)星序 列陽性克隆的篩選及測序，得到33個含有微衛(wèi)星重復(fù)序列的克隆；篩選得到10個多態(tài)性 MWil^IllM^^l^id Lyra-1> Lyra-2> Lyra-3> Lyra-4> Lyra-5> Lyra-6> Lyra-7> Lyra-8> Lyra-9、Lyra-10 ；Lyra-I 為 328 個核苷酸，Lyra-2 為 469 個核苷酸，Lyra-3 為 439 個核苷 酸，Lyra-4為538個核苷酸，Lyra-5為432個核苷酸，Lyra-6為422個核苷酸，Lyra-7為 547個核苷酸，Lyra-8為400個核苷酸，Lyra-9為410個核苷酸，Lyra-IO為416個核苷酸。


圖1 :Lyra-l位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE2 Lyra-2位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE3 Lyra-3位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE4 Lyra-4位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE5 Lyra-5位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE6 Lyra-6位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE7 Lyra-7位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE8 =Lyra-S位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE圖
圖9 Lyra-9位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE10 =Lyra-IO位點的特異性引物擴增21個石蒜的DNA的銀染PAGE圖具體實施方法實施例1 1、石蒜微衛(wèi)星DNA富集文庫的構(gòu)建1. 1基因組的提取與酶切用 Doyle J介紹的 CTAB法(Doyle J. DNA protocols for ρlants-CTAB total DNA isolation A. In Hewitt GM, JohnstonA(eds. ), Molecular Techniques in Taxonomy [M] · Berlin =Springer, 1991,283-293)提取石蒜基因組。用限制性內(nèi)切酶Sau3AI (購 自TaKaRa公司)酶切基因組。酶切產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外光下切下 300bp-900bp的DNA片段并用膠回收試劑盒(購自上海生工)純化回收。1. 2 加接頭將純化回收的膠回收產(chǎn)物加入接頭LA (5，-GGCCAGAGACCCCAAGCTTCG-3，)， LB (5，-P04-GATCCGAAGCTTGGGGTCTCTGGCC-3，)，在T4連接酶(購于Promega公司)作用下16°C水浴連接過夜。1.3PCR檢測接頭連接
以LA為引物，以1. 2工序制的連接產(chǎn)物為模板進行PCR，(50 μ 1反應(yīng)體系如下 25 μ ITaqGreen (購于Promega公司)，5μ 1引物LA，5y 1連接產(chǎn)物，加水補至50 μ 1。PCR 反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性50秒，56°C退火1分鐘，72°C延伸2分鐘，變性 至退化三個步驟重復(fù)25次。最后72°C充分延伸10分鐘。)PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(購于 Axygen公司)進行純化。1. 4磁珠富集將1.3所制純化產(chǎn)物與雜交探針(CT) 15在701下雜交一個半小時。將雜交液加 入已平衡好的磁珠，室溫放置30分鐘。將離心管依次用6XSSC，2XSSC，IXSSC于60°C下 洗兩次，最后用0. 1 X SSC室溫下洗一次。加入TE緩沖液，在PCR機上95°C變性15分鐘，收
集上清。1. 5PCR 富集以磁珠富集產(chǎn)物為模板，LA為引物進行PCR擴增，25μ1反應(yīng)體系如下 TaqGreen 12. 5 μ 1, LA 1. 5 μ 1，富集后的DNA2. 5 μ 1，加水補至25 μ 1。PCR反應(yīng)程序如下 94°C預(yù)變性3分鐘，94°C變性35秒，60°C退火35秒，72°C延伸1分鐘，變性至退火三個步驟 重復(fù)25次。最后72°C充分延伸12分鐘。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒進行純化。1. 6感受態(tài)細胞的制備將ImL過夜培養(yǎng)的E. coli DH_5a培養(yǎng)液接于50mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培 養(yǎng)12小時至對數(shù)生長期(OD6tltl^O. 3-0.6)時取出。將菌液于4°C離心10分鐘，棄上清，加 入ImLO. lmol/L預(yù)冷的Cacl2重新懸浮細胞用槍頭輕輕打勻。4°C離心10分鐘。棄上清， 加入預(yù)冷甘油/Cacl2混合物重新懸浮菌體，用槍頭打勻，-80°C保存。1.7 倒平板將LB固體培養(yǎng)基完全融化，冷卻至50°C左右，配成LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培養(yǎng) 基(比例為LB固體培養(yǎng)基IOOmL ；Amp青霉素100 μ 1 ；20%異丙基一 β -D 一硫代半乳糖 昔(IPTG) 7ul ；20% 5-嗅-4 一氯一 3-吲哚一 β -D 一半乳糖昔(X-Gal) 40 μ 1)混合均勻 后倒入一只培養(yǎng)皿里，待培養(yǎng)基凝固后放入37°C烘箱，晾干水蒸氣。1. 8連接轉(zhuǎn)化取1. 5工序所制的PCR富集后的純化產(chǎn)物加入PMD19-T載體(購自TaKaRa公司) 于16°C水浴連接2小時，制成連接產(chǎn)物。取出感受態(tài)細胞，冰上復(fù)蘇至液態(tài)，加入上述連接產(chǎn)物，混勻。冰浴30分鐘后放入 42°C水浴鍋，熱激90秒，立即放入冰中冰浴2分鐘，加入新鮮的LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng) 1-1. 5小時。取70u 1培養(yǎng)液涂布于LB/Amp/X-Gal/IPTG培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。2、陽性克隆的篩選將平板上的白色單菌落分別放入事先裝有LB/Amp培養(yǎng)基的EP管中。37°C振蕩培 養(yǎng)至菌液渾濁。15ul PCR 反應(yīng)體系包括Taq 酶 0. 075U (購自 TaKaRa 公司)，IOX Buffer 1. 5ul， dNTPO. 2uM，mg2+l. 5uM，引物 0. 4uM(LA，primer-c (CT15))，水。反應(yīng)程序94°C預(yù)變性 3 分鐘， 94°C變性50秒，56°C退火35秒，72°C延伸1分鐘，變性至延伸三個步驟重復(fù)30次。最后 72°C充分延伸12分鐘，1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3、陽性克隆測序及引物設(shè)計陽性克隆送生物公司測序，共得到33條含有微衛(wèi)星DNA的序列。根據(jù)微衛(wèi)星DNA兩側(cè)的序列，利用軟件primerprimer5設(shè)計引物，如表1所示。實施例2 2. 1篩選有多態(tài)性的引物用1. 1的CTAB法提取石蒜基因組。用設(shè)計的引物(表1)擴增基因組。反應(yīng)程序 94 V預(yù)變性4分鐘，94 V變性45秒，退火30秒(退火溫度見表1)，72 °C延伸35秒，變性至退 火三個步驟重復(fù)35次。最后72°C充分延伸8分鐘。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物 用PAGE電泳進行檢測，共得到10個多態(tài)性的微衛(wèi)星標記；Lyra-I為328個核苷酸，Lyra_2 為469個核苷酸，Lyra-3為439個核苷酸，Lyra-4為538個核苷酸，Lyra-5為432個核苷 酸，Lyra-6為422個核苷酸，Lyra-7為547個核苷酸，Lyra-8為400個核苷酸，Lyra-9為 410個核苷酸，Lyra-IO為416個核苷酸。2. 2結(jié)果分析使用CervuS3. 0軟件計算期望雜合度和觀察雜合度。使用Gen印op3. 4軟件計算 哈代一溫伯格以及連鎖不平衡的值，以此來描述10個石蒜微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點的特征。由附圖1-10看出，本發(fā)明的10個微衛(wèi)星序列的長度在供試的21個石蒜中都出現(xiàn) 了多樣性，由此可見，本發(fā)明的這10個微衛(wèi)星標記能用于研究石蒜的遺傳多樣性保護，石 蒜屬植物種間和居群間的變異和進化關(guān)系及石蒜品種的鑒定，具有重復(fù)性好的特點，是一 種可靠有效的分子標記。表1引物特性表位點 基序引物序列退火溫度ΓΟ
Lyra-I(CT) 1δLyra-IS5，TCTGTTCACCTTTACCCTCTC 3'57Lyra-IA5，CAGCCTCAACTCCAATCTCG 3Lyra-2(TC)35Lyra-2S5，CCATCGCCGCTACTATCAC 3'56Lyra-2A5，AAAGGAGAAGAGGGTATCAAC .3'Lyra-3(CT)24Lyra-3S5，CCAATGTTCACTACCACCCC 3'53Lyra-3A5，GAAGGTTTTGGTTTCAGGAT 3'Lyra-4(TC)31Lyra-4S5，CCTTGCTCACGACTCCTTTA 3'60Lyra-4A5'CCAATGCTGTTGCCACCTTC 3'Lyra-5(TC) 12C (CT)7Lyra-5S5，CCTTCTTTGGCTACTCACAT 3'59Lyra~5A5，CAGTCAGTCCATCCTCTTGC 3'Lyra~6’ (TC)19I.yra-6S5'CATCCCCTCCCCGAACTAT 3'59Lyra~6A5，GCTTCTCACCGCCGCTAAT 3Lyra-7(AG) 19Lyra-7S5，GGGTGATGAAATGAACTG 3'53Lyra-7A5，ACTCCTATTGCCACCCTC 3'Lyra-8(AG)7N(GA) 19Lyra_8S 5'CAGTCGCTAAACTAAGCCCTAT 3'59Lyra-8A5，CCCACAACTTGCCTTCCTCT 3'Lyra-9(GA) 24Lyra~9S5，AACTCCAACCACCCTTTA 3'54Lyra-9A5，ACTTGCCTTCCTCTTTCT .3'Lyra-10(CT)22Lyra-IOS5，TCGCTCAACTTACCTCTA 3'51Lyra-丄OA5，TGATTCCTCCATGCTTCT 3'表1中S表示5’端引物，A表示3’端引物。序列表<110>安徽師范大學<120>石蒜微衛(wèi)星分子標記<130>1<160>10<170>PatentIn version 3. 3
<210>1<211>328<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>1gatcagacct tactgcaagg atggaatttt gaggggtcga tatacaaaat gtctgtcttc 60tcaacttaaa ctctcaaaac tctctctctc tctctctcat ctctctttcc cgctcttttc 120tctctccatc tctgttcacc tttaccctct cactctctct ctctctctct ctctctctct 180ctctactctc aagacagctc aagatggctg cggagacaag ggtctaagag cttgagatgt 240tgggttcgtg gtgaagtggt cggggaaggt cggcgtggga gctcgagatt ggagttgagg 300ctgtggggct gagctgggac tgaaggat 328<210>2<211>469<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>2gatcaagatt tgtttcatgc taatttaacc ctaaaaccca agatctacct agccctagat 60gctgtcgccg accctttctt atgcccatcg ccgctactat caccataatc ccccttgctg 120tgtgcatgcc cctcccttct ttttctcctc atcttctctc tctctctctc tctctctttc 180tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctcccctcc attatcttct 240ctctcttctg tccttgcgtc gcaccccttt gcgtcgccga tctgtagttg ataccctctt 300ctcctttgcc ttcgatcgct tcctaccccc aaagattgag gctgctacca taaaacccta 360ggttcccctc gatctttatg cacgtgcact tgtgcacccc cttcatggaa atcccgatgc 420ccccttcatg caagtttcga tgccctttca tgtcactccc gctctaagt 469<210>3
<211>439<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>3aatcagacac cccacggatc caaacattgt tccagagcct tctcccccaa tgttcactac 60caccccagct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctccct 120ctccccctcc aaccctagta gcttaagctt caaggtggtc aggccaggct cgaacagcag 180cagaagctct ctctctctct ctctctcacc cttcttgctg aatttagaac agcttaagga 240agtctgccca tataaagctg ccacattatc caccgagtac tcctgaaacc aaaaccttca 300tttcaaaaca ttattagact gagaatatca tcaattataa gattcagtgg tctacatatg 360ttttgaaaca atcttttatt tctttcgccc cgcaaaccgt aagcacaggc caaaacacat 420gtatcatatctgcccctct 439<210>4<211>538<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>4gatcatcttc 60tctcatatca 120ctatctctct 180tcatatctca 240ggcttcaact 300cttggaggtt 360gagctcaagc 420
11
cccaagccttttttctcgagtccttgctcacgactcctttactctttctc
ctctctcttaccattttctctcagctcgatctctctctctctctctttct
ctctctctctctctctctctctctctctctcttccgcacgctctcttctc
ctgtgaacttactctcttactcctctctcctcaccattctttgctctcac
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gagctcatagggactttgagatgaaggtggcaacagcattgggggtgctc
tgaggatggtatgaggtggtggagcttcgagagatgaagttgaaggagga
gatgggtcag aactatgctg gtggagttca tcaaagttgg gttcaagctc gactgtgaga 480aaaactcgat aaggaagaag ctcgagttgg ggtagtgagt tgcagacgaa ttcgactt 538<210>5<211>432<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>5gatcatcatc gtgtttgcta gttatttgcc agtccttata tagaagaatg acagggaaga 60aagagtttcg actttcgagt ttatggttac tcttaccttc tttggctact cacatgcttg 120tcactttctt tgtatacagc ctacactgat actctctagc catttctcag ggtacaatct 180ctctctctct ctctctctct ccctctctct ctctctcatt ttggaacatt ttgttaaact 240ttttagtagc tcgccctctt attttataac ttttgttaaa attttaagta gcatcttttg 300gagaagagcg tagtagcttt gacgggatcc ttgcgatttt tacgcttggt caatagcgtt 360atgcaagagg atggactgac tgtgaggcta gcaggataac tcgatatgat tagacaaagg 420cggagaacaa gt432<210>6<211>422<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>6gatcaattgg ctaggacttg taaaatgaat tttagaattg tcctctttag tccctaaacc 60ttcgtgcgtc cgctacgcca ttaaattgtt tagaaatcct ctaccaaaac ccaacatccc 120ctccccgaac tatgccgcca ccgaaaaacc aaccaactcc tctagccagc ggcaagcccc 180cctcctttgt tgtcgtcgaa ggcggcaccc ccttgtcgtc tctctctctc tctctctctc 240tctccctaaa cctattttcc ttttctttct ttagttttgg tttggtccat gagttcacat 300ctctctctct ctctctcaaa gcagcaaatc caactccatt ctcatctctc tctctctctc 360
tctctctctc tctctctctc tcatccaacg agtaaattag cggcggtgag aagcgaaaca 420at
422<210>7<211>547<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>7gatcagagat tagtataacg attccatcta aataatgaac caaaatgatt aaatgtaaag 60tgggtgatga aatgaactgg ataaataaag gcttgaatat catcaacaag ggaaccctac 120taagactatt aaagcagctt aggaatttta agagagaaat gttactctaa gtcaatgcat 180tcaattctgt cagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ataataataa 240cagggcgacg aattatggtt agccggcgat gaactcaaca atgcgggagg ggaggggagg 300ggagggtggc aataggagta cctgttgaag aaaagagtgg gtattgagct taaacaacca 360ttgagatagt agagaaagag aaagggcaat tcgatctaaa gtcaatgggg tattgggcaa 420cggagcaaat attaagggtg cttttaaaca tcaagtgaat gtcaaggtag tttctagaca 480ttaggcctaa aagtaggatg gtttttggat aataccccat ttatgttatc aaattgctag 540tttggat 547<210>8<211>400<212>DNA<213> ^m (Lycoris radiata)<400>8gatcagccct atcaccacca ttagagctcg accttattaa tgaccattac tatggtgacc 60tctgaacctc atcaactcca accacccttt aaccattgca ctaagctcag tcgctaaact 120aagccctatc ttcaacatga actccaccac ctcaatggca gacctctctc attcttcaaa180gcttcaaacc cctaatccat gagcttgcac ttcccatcca tgatccatgc tgaagagaga 240gagagaggga gagggagagg gagagggaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 300gagaacttag tagtagagag aagaaaaatg aaatcaagtg agagagaaag aggaaggcaa 360gttgtgggtg cactttagct gagggcatga tggagaagat 400<210>9<211>410<212>DNA<213> 石蒜 (Lycoris radiata)<400>9gatcagccct atcaccacca ttagagctcg accttattaa tgaccattac tatggtgacc 60tctgaacctc atcaactcca accacccttt aaccattgca ctaagctcag tcgctaaact 120aagccttatc ttcaacatga actccaccac ctcaatggca gacctctctc attcttcaaa 180gcttcaaacc cctaatccat gagcttgcac ttcccatcca tgatccatgc tgaagagaga 240gggagaggga gagggagagg gagagggaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 300gagagagaga gagaacttag tagtagagag aagaaaaatg aaatcaagtg agagagaaag 360aggaaggcaa gttgtgggtg cactttagct gagggcatga tggagaagat 410<210>10<211>416<212>DNA<213> 石蒜 (Lycoris radiata)<400>10gatcaaagaa ataggaaaga gtacacctga attcaaactt ctccgttata tgtaataaat 60cgctcaactt acctctacag agattctctc aaacaaaatc tcgatctttt cctctggatc 120tccaatggtt gcccttgatc tcccttgtaa aactctctct ctctctctct ctctctctct 180ctctctctct ctctcttcct ttcttgattt ttcttgagac tatatcttaa ctagggttga aaatcccttt tataaacctt aaacacgtaa ccagacatcc accgttggat tagaagcatg gaggaatcaa aaccatcgaa aatgggtccc aaacgtgcaa gttcgacccg aacccgtgaa actgatctgc gactagtcgc ttagtagatg cgaccggccg cccgccggtc gctcgt 41權(quán)利要求
一種石蒜微衛(wèi)星DNA分子標記，其特征在于，所述微衛(wèi)星標記的標號分別為Lyra 1、Lyra 2、Lyra 3、Lyra 4、Lyra 5、Lyra 6、Lyra 7、Lyra 8、Lyra 9、Lyra 10，其核苷酸序列分別為Lyra 1gatcagacct tactgcaagg atggaatttt gaggggtcga tatacaaaat gtctgtcttc 60tcaacttaaa ctctcaaaac tctctctctc tctctctcat ctctctttcc cgctcttttc 120tctctccatc tctgttcacc tttaccctct cactctctct ctctctctct ctctctctct 180ctctactctc aagacagctc aagatggctg cggagacaag ggtctaagag cttgagatgt 240tgggttcgtg gtgaagtggt cggggaaggt cggcgtggga gctcgagatt ggagttgagg 300ctgtggggct gagctgggac tgaaggat 328Lyra 2gatcaagatt tgtttcatgc taatttaacc ctaaaaccca agatctacct agccctagat 60gctgtcgccg accctttctt atgcccatcg ccgctactat caccataatc ccccttgctg 120tgtgcatgcc cctcccttct ttttctcctc atcttctctc tctctctctc tctctctttc 180tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctcccctcc attatcttct 240ctctcttctg tccttgcgtc gcaccccttt gcgtcgccga tctgtagttg ataccctctt 300ctcctttgcc ttcgatcgct tcctaccccc aaagattgag gctgctacca taaaacccta 360ggttcccctc gatctttatg cacgtgcact tgtgcacccc cttcatggaa atcccgatgc 420ccccttcatg caagtttcga tgccctttca tgtcactccc gctctaagt 469Lyra 3aatcagacac cccacggatc caaacattgt tccagagcct tctcccccaa tgttcactac 60caccccagct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctccct 120ctccccctcc aaccctagta gcttaagctt caaggtggtc aggccaggct cgaacagcag 180cagaagctct ctctctctct ctctctcacc cttcttgctg aatttagaac agcttaagga 240agtctgccca tataaagctg ccacattatc caccgagtac tcctgaaacc aaaaccttca 300tttcaaaaca ttattagact gagaatatca tcaattataa gattcagtgg tctacatatg 360ttttgaaaca atcttttatt tctttcgccc cgcaaaccgt aagcacaggc caaaacacat 420gtatcatatc tgcccctct 439Lyra 4gatcatcttc cccaagcctt ttttctcgag tccttgctca cgactccttt actctttctc 60tctcatatca ctctctctta ccattttctc tcagctcgat ctctctctct ctctctttct 120ctatctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct cttccgcacg ctctcttctc 180tcatatctca ctgtgaactt actctcttac tcctctctcc tcaccattct ttgctctcac 240ggcttcaact actcctcctt tctctcgcat acattctcac ttcatgggtt tgatggcaag 300cttggaggtt gagctcatag ggactttgag atgaaggtgg caacagcatt gggggtgctc 360gagctcaagc tgaggatggt atgaggtggt ggagcttcga gagatgaagt tgaaggagga 420gatgggtcag aactatgctg gtggagttca tcaaagttgg gttcaagctc gactgtgaga 480aaaactcgat aaggaagaag ctcgagttgg ggtagtgagt tgcagacgaa ttcgactt538Lyra 5gatcatcatc gtgtttgcta gttatttgcc agtccttata tagaagaatg acagggaaga 60aagagtttcg actttcgagt ttatggttac tcttaccttc tttggctact cacatgcttg 120tcactttctt tgtatacagc ctacactgat actctctagc catttctcag ggtacaatct 180ctctctctct ctctctctct ccctctctct ctctctcatt ttggaacatt ttgttaaact 240ttttagtagc tcgccctctt attttataac ttttgttaaa attttaagta gcatcttttg 300gagaagagcg tagtagcttt gacgggatcc ttgcgatttt tacgcttggt caatagcgtt 360atgcaagagg atggactgac tgtgaggcta gcaggataac tcgatatgat tagacaaagg 420cggagaacaa gt 432Lyra 6gatcaattgg ctaggacttg taaaatgaat tttagaattg tcctctttag tccctaaacc 60ttcgtgcgtc cgctacgcca ttaaattgtt tagaaatcct ctaccaaaac ccaacatccc 120ctccccgaac tatgccgcca ccgaaaaacc aaccaactcc tctagccagc ggcaagcccc 180cctcctttgt tgtcgtcgaa ggcggcaccc ccttgtcgtc tctctctctc tctctctctc 240tctccctaaa cctattttcc ttttctttct ttagttttgg tttggtccat gagttcacat 300ctctctctct ctctctcaaa gcagcaaatc caactccatt ctcatctctc tctctctctc 360tctctctctc tctctctctc tcatccaacg agtaaattag cggcggtgag aagcgaaaca 420at 422Lyra 7gatcagagat tagtataacg attccatcta aataatgaac caaaatgatt aaatgtaaag60tgggtgatga aatgaactgg ataaataaag gcttgaatat catcaacaag ggaaccctac120taagactatt aaagcagctt aggaatttta agagagaaat gttactctaa gtcaatgcat180tcaattctgt cagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga ataataataa240cagggcgacg aattatggtt agccggcgat gaactcaaca atgcgggagg ggaggggagg300ggagggtggc aataggagta cctgttgaag aaaagagtgg gtattgagct taaacaacca360ttgagatagt agagaaagag aaagggcaat tcgatctaaa gtcaatgggg tattgggcaa420cggagcaaat attaagggtg cttttaaaca tcaagtgaat gtcaaggtag tttctagaca480ttaggcctaa aagtaggatg gtttttggat aataccccat ttatgttatc aaattgctag540tttggat 547Lyra 8gatcagccct atcaccacca ttagagctcg accttattaa tgaccattac tatggtgacc60tctgaacctc atcaactcca accacccttt aaccattgca ctaagctcag tcgctaaact120aagccctatc 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180ctctctctct ctctcttcct ttcttgattt ttcttgagac tatatcttaa ctagggttga 240aaatcccttt tataaacctt aaacacgtaa ccagacatcc accgttggat tagaagcatg 300gaggaatcaa aaccatcgaa aatgggtccc aaacgtgcaa gttcgacccg aacccgtgaa 360actgatctgc gactagtcgc ttagtagatg cgaccggccg cccgccggtc gctcgt 416。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的石蒜微衛(wèi)星標記，其特征在于所述的Lyra-1、Lyra-2, Lyra-3，Lyra~4， Lyra-5， Lyra-6， Lyra-7，Lyra-8， Lyra~9， Lyra-10 上個位點的引物序列為Lyra-IS TCT GTT CAC CTT TAC CCT CT Lyra-IA CAG CCT CAA CTC CAA TCT CG Lyra-2S CCA TCG CCG CTA CTA TCA C Lyra-2A AAA GGA GAA GAG GGT ATC AAC Lyra-3S CCA ATG TTC ACT ACC ACC CC Lyra-3A GAA GGT TTT GGT TTC AGG AT Lyra-4S CCT TGC TCA CGA CTC CTT TA Lyra-4A CCA ATG CTG TTG CCA CCT TC Lyra-5S CCT TCT TTG GCT ACT CAC AT Lyra-5A CAG TCA GTC CAT CCT CTT GC Lyra-6S CAT CCC CTC CCC GAA CTA T Lyra-6A GCT TCT CAC CGC CGC TAA T Lyra-7S GGG TGA TGA AAT GAA CTG Lyra-7A ACT CCT ATT GCC ACC CTC Lyra-8S CAG TCG CTA AAC TAA GCC CTAT Lyra-8A CCC ACA ACT TGC CTT CCT CT Lyra-9S AAC TCC AAC CAC CCT TTA Lyra-9A ACT TGC CTT CCT CTT TCT Lyra-IOS TCG CTC AAC TTA CCT CTA Lyra-IOA TGA TTC CTC CAT GCT TCT。
全文摘要
本發(fā)明公開了石蒜微衛(wèi)星DNA分子標記，包括石蒜微衛(wèi)星(CT)n富集文庫的構(gòu)建，微衛(wèi)星序列陽性克隆的篩選及測序，得到33個含有微衛(wèi)星DNA的克隆，確定了10個多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星分子標記Lyra-1、Lyra-2、Lyra-3、Lyra-4、Lyra-5、Lyra-6、Lyra-7、Lyra-8、Lyra-9、Lyra-10。本發(fā)明可用于研究石蒜的遺傳多樣性保護，石蒜屬植物種間和居群間的變異和進化關(guān)系及石蒜的品種鑒定；重復(fù)性好，是一種可靠有效地分子標記。
文檔編號C12N15/11GK101988063SQ20101053625
公開日2011年3月23日 申請日期2010年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月9日
發(fā)明者宣守芹, 朱國萍, 李雪, 王暉, 鄭基陽, 高鵬 申請人:安徽師范大學