專利名稱：GmNDR1蛋白在促進水楊酸生物合成以及增強植物抗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及增強植物抗病性的蛋白、其編碼核苷酸序列與應(yīng)用。本發(fā)明的某些方面涉及將本發(fā)明提供的GmNDRl蛋白編碼核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達，從而促進了植物水楊酸的合成以及增強植物的抗病性。
背景技術(shù)：
植物在栽培生產(chǎn)過程中常發(fā)生各種病害，一些病害對植物生長構(gòu)成極大威脅，如根腐病、灰斑病等。對于農(nóng)作物，這些病害嚴(yán)重?fù)p害其產(chǎn)量和質(zhì)量。對于植物病害，目前主要采用藥物措施防治。最近人們開始應(yīng)用非生物誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)植物抗病性，并已廣泛應(yīng)用于煙草、馬鈴薯、番茄、黃瓜、菜豆、水稻等多種重要農(nóng)作物。這種措施的效果雖然理想，但成本較高，并污染環(huán)境。因此，迫切需要開發(fā)新的生物學(xué)手段以提高植物自身的抗病性。系統(tǒng)獲得性抗性是植物的一種防御反應(yīng)，當(dāng)植物遭受病原體和害蟲攻擊時，這種反應(yīng)會被誘導(dǎo)，并且能夠迅速擴散到植株的其它部位以保護植物。病程相關(guān)蛋白I3R是一類逆境蛋白，被認(rèn)為在植物的抗病中起重要作用，其中編碼PRl蛋白的基因常被用作植物抗病反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性中的指示基因，PRl基因的表達在植物抗病反應(yīng)中起重要作用。水楊酸是廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)，被認(rèn)為是誘發(fā)系統(tǒng)獲得性抗性的信號，可以誘導(dǎo)對病毒、細菌、真菌等多種病原體的抗性。研究表明，外施水楊酸后，PRl基因的轉(zhuǎn)錄被顯著激活。研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)植物某部位遭受病原體攻擊之后，植物體內(nèi)水楊酸含量會增加，而且水楊酸的增加出現(xiàn)在PRl基因表達之前。(L Sticher, B Mauch-Mani，and JP Metraux. Systemic Acquired Resistance. Annual Review of Phytopathology,1997, 35 :235-270 ；ER Ward, SJ Uknes, SC Williams et al. , Coordinate Gene Activity in Response to Agents That Induce Systemic Acquired Resistance. The Plant Cell, 1991,3 :1085-1094)研究進一步發(fā)現(xiàn)，植物中水楊酸的合成在很大程度上是通過異分支酸合成酶 (ICS, isochorismate synthase) ICSl 作用于底物異分支酸(isochorismate)從而合成水楊酸。但目前對于植物水楊酸合成調(diào)控的研究報道還極為少見。NDRl (nonrace-specific disease resistance)基因是一種在植物系統(tǒng)獲得性抗性的信號傳導(dǎo)途徑中起著非常重要作用的基因。具體來說，在擬南芥中它是一種閱讀框架為651bp，可以編碼217個氨基酸的基因，根據(jù)序列推測其有2個跨膜區(qū)，其可能處于植物抗病R基因介導(dǎo)的抗病信號通路的下游。NDRl功能的缺失可以導(dǎo)致活性氧的產(chǎn)生以及水楊酸合成的降低，進而導(dǎo)致植物對病原菌抗性減弱。然而，根據(jù)遺傳學(xué)表型和功能分析發(fā)現(xiàn)， NDRl和另一種抗病信號傳導(dǎo)途徑中非常重要的EDSl (enhanced disease susceptibility) 基因在作用的傳導(dǎo)途徑上是完全不同的，NDRl基因編碼的蛋白是一種膜定位蛋白，據(jù)此分析，推測該蛋白可能具有與某一類R蛋白相互作用的能力，使得抗病蛋白在靠近細胞膜的區(qū)域附近形成較高濃度，進而更加容易識別病原菌無毒基因，從而加速植物的抗病反應(yīng)。
作為一種植物抗病信號傳導(dǎo)中非常重要的蛋白，對NDRl蛋白的生物工程研究具有重要的理論和實際意義。但是目前除了擬南芥和煙草外，對該基因在其它植物抗病基因工程的研究還尚無報道(竇道龍，王冰山，朱生偉等，轉(zhuǎn)NDRl基因煙草對赤星病和晚疫病的抗性增強，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36 (10) 1120-1124)。由于大豆的遺傳轉(zhuǎn)化目前仍然存在成功率低、周期長和對設(shè)備及人員要求高等一些難題，因此過量表達大豆的NDRl基因是否會誘導(dǎo)水楊酸合成和植物抗病基因的表達，進而可能提高植物抗病性，仍然沒有明確的答案。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供了一種GmNDRl蛋白及其編碼核苷酸序列，以及該GmNDRl 蛋白的類似物蛋白及其編碼核苷酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種增強植物抗病性的方法。所述方法包括將編碼本發(fā)明GmNDRl蛋白的核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達。所述植物細胞可以來源于雙子葉植物或單子葉植物。所述病害可以是根腐病、灰斑病等。在某些實施方案中，所述植物細胞是大豆細胞。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)植物水楊酸合成的方法。所述方法包括將編碼本發(fā)明GmNDRl蛋白的核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達。在某些實施方案中， 所述植物細胞是大豆細胞。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物抗性基因表達的方法。所述方法包括將本發(fā)明GmNDRl蛋白的編碼核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達。在某些實施方案中，所述植物抗性基因是PRl基因。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明GmNDRl蛋白通過調(diào)控植物水楊酸合成來調(diào)控植物抗性基因表達。在又一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有增強的抗病性的植物的方法。所述方法包括提供表達編碼本發(fā)明GmNDRl蛋白的核苷酸序列的植物細胞，并在合適的條件下將所述植物細胞培養(yǎng)為植物。進一步地，本發(fā)明提供了參與水楊酸合成調(diào)節(jié)的GmNDRl蛋白，其來源于大豆，可具有序列表中SEQ ID NO :2的氨基酸序列。其編碼核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO :1所
7J\ ο此外，本發(fā)明還提供了 GmNDRl蛋白的類似物蛋白，以及其編碼核苷酸序列。附圖簡述

圖1為大豆GmNDRl基因PCR電泳圖。圖2為擬南芥ICSl基因啟動子PCR電泳圖。圖3為擬南芥PRl基因啟動子PCR電泳圖。圖4顯示融合FLAG表達標(biāo)簽的大豆GmNDRl基因表達載體圖。圖5顯示擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體圖。圖6顯示擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體圖。圖7顯示將大豆GmNDRl基因表達載體和擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的顯微鏡觀測結(jié)果。圖8顯示將大豆GmNDRl基因表達載體和擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果。圖9顯示將大豆GmNDRl基因表達載體和擬南芥ICSl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，F(xiàn)LAG蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果。圖10顯示將大豆GmNDRl基因表達載體和擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后，GFP熒光蛋白的顯微鏡觀測結(jié)果。圖11顯示將大豆GmNDRl基因表達載體和擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后GFP熒光蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果。圖12顯示將大豆GmNDRl基因表達載體和擬南芥PRl基因啟動子連接GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體后FLAG蛋白的Wfestern Blotting結(jié)果。發(fā)明詳述定義本說明書全篇中所用的術(shù)語應(yīng)解釋為具有對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言常規(guī)和典型的意義。然而，申請人希望給予下列術(shù)語如下特定含義。術(shù)語“基本一致”相對于核苷酸序列而言可以被解釋為核苷酸序列與參考核酸序列有至少約85 %、90 %、95 %或97 %的序列一致性。術(shù)語“一致”應(yīng)解釋成，在比對序列并引入空隙(如果需要的話，以使整個序列達到最大的序列一致性百分比)之后，不考慮保守替代作為序列一致性的一部分時，候選序列中和與其比較的對應(yīng)序列中相同的核苷酸的百分?jǐn)?shù)。3’端或5’端延伸或插入不應(yīng)被理解成減少了一致性或同源性。用于比對的方法和計算機程序是本領(lǐng)域所熟知的。用序列分析軟件可以測定序列一致性。術(shù)語“植物”包括完整的植物、植物器官(例如，葉、莖、根，等)、種子等。術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”通常指鹽濃度低于約1. 5M，通常為約0.01-1. 0M，pH在約 7. 0-8. 3之間，溫度在約30-60攝氏度之間。也可以通過添加去穩(wěn)定劑，例如甲酰胺，來實現(xiàn)嚴(yán)格雜交條件。術(shù)語“報告基因”通常指一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把報告基因的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利用它的表達產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達調(diào)控。常見的報告基因包括GFP、FLAG等。術(shù)語“類似物蛋白”應(yīng)理解為指與GmNDRl蛋白不同的任何分子，但仍保留與 GmNDRl蛋白相似或基本相似的生物學(xué)功能，特別是調(diào)節(jié)植物水楊酸合成。在一些方面，類似物蛋白的基本整體結(jié)構(gòu)與GmNDRl蛋白相似，或結(jié)構(gòu)上僅與實現(xiàn)GmNDRl蛋白生物學(xué)功能的一個或多個區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)相似。典型地，可以通過向GmNDRl蛋白的氨基酸序列添加一個或多個氨基酸、從GmNDRl蛋白的氨基酸序列刪除一個或多個氨基酸、和/或置換GmNDRl蛋白的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸、和/或上述方式的組合提供或形成 GmNDRl蛋白的類似物蛋白。在一些方面，本發(fā)明涵蓋了導(dǎo)致氨基酸序列改變的氨基酸倒置和其它突變改變?？梢酝ㄟ^向核酸分子中引入核苷酸改變，從而通過表達突變的核酸分子實現(xiàn)需要的氨基酸改變。氨基酸的取代可涉及保守的或非保守的氨基酸取代。術(shù)語“氨基酸保守置換”指用特征相似或基本相似的的另一個氨基酸來替換氨基酸殘基，基本不改變蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。下表1中提供了示例性的氨基酸保守置換。在一些方面，具體的保守置換是G、A、V、I、L、M;D、E、N、Q ；S、C、T ；K、R、H ；和P、N-α -烷基氨基酸。在一些方面，氨基酸保守置換可以基于以下選擇，它們對(a)取代區(qū)域中肽骨架的結(jié)構(gòu)、(b)蛋白質(zhì)在取代位點的電荷或疏水性、(C)在取代位點的側(cè)鏈體積、和/或上述方面的組合，不具有任何實質(zhì)性的影響。
表1 示例性氨基酸保守置換AlaVal*, Leu, lie
ArgLys*, Gin, Asn
AsnGln*, His, Lys, Arg, Asp
AspGlu*, Asn
CysSer
GlnAsn*, His, Lys,
GluAsp*，Y-羧基谷氨酸(Gla)
GlyPro
HisAsn, Gin, Lys, Arg氺
IleLeu*, Val, Met, Ala, Phe, norleucine (Nle)
LeuNle, lie*, Val, Met, Ala, Phe
LysArg*, Gin, Asn, ornithine (Orn)
MetLeu*, lie, Phe, Nle
PheLeu*, Val, lie, Ala
ProGly*，羥脯氨酸(Hyp)，Ser, Thr
SerThr
ThrSer
TrpTyr
TyrTrp, Phe*, Thr, Ser
Vallie, Leu*, Met, Phe, Ala, Nle*表示優(yōu)選的保守置換在一個方面，本發(fā)明提供了一種GmNDRl蛋白及其編碼核苷酸序列，以及其類似物蛋白及其編碼核苷酸序列。進一步地，本發(fā)明提供了參與水楊酸合成調(diào)節(jié)的GmNDRl蛋白，其來源于大豆，可具有序列表中SEQ ID NO :2的氨基酸序列。其編碼核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO :1所
7J\ ο此外，本發(fā)明還提供了 GmNDRl蛋白的類似物蛋白，以及其編碼核苷酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種增強植物抗病性的方法。所述方法包括將本發(fā)明GmNDRl蛋白的編碼核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達。所述植物細胞可以來源于雙子葉植物或單子葉植物。所述病害可以是根腐病、灰斑病。在某些實施方案中，所述植物可以是大豆。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)植物水楊酸合成的方法。所述方法包括將本發(fā)明GmNDRl蛋白的編碼核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達。在又一個方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)控植物抗性基因表達的方法。所述方法包括將本發(fā)明GmNDRl蛋白的編碼核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞中，并使其表達。在某些實施方案中，所述植物抗性基因是PRl基因。在一個具體的實施方案中，本發(fā)明GmNDRl蛋白通過調(diào)控植物水楊酸合成來調(diào)控植物抗性基因表達。在又一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)具有增強的抗病性的植物。所述方法包括提供表達編碼本發(fā)明GmNDRl蛋白的核苷酸序列的植物細胞，并在合適的條件下將所述植物細胞培養(yǎng)為植物。在本發(fā)明的一個實施方案中，將篩選獲得的可能參與植物水楊酸合成調(diào)節(jié)的候選基因，融合到含有FLAG報告基因的轉(zhuǎn)化表達載體中，通過與連接有誘導(dǎo)水楊酸合成關(guān)鍵基因-異分支酸合成酶基因(ICSl)-啟動子的GFP報告基因的轉(zhuǎn)化表達載體共同瞬時轉(zhuǎn)化植物原生質(zhì)體，根據(jù)熒光顯微鏡觀察植物原生質(zhì)體是否產(chǎn)生綠色熒光。并提取原生質(zhì)體總蛋白，分別用GFP和FLAG的抗體進行Western Blotting試驗，最終鑒定篩選到的候選蛋白是否能夠調(diào)節(jié)水楊酸合成。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種可以誘導(dǎo)ICSl基因啟動子的GmNDRl蛋白及其編碼核苷酸序列。實驗證明，將本發(fā)明的核苷酸序列構(gòu)建到表達載體，與連接有誘導(dǎo) ICSl基因啟動子的GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體后，可以在原生質(zhì)體的細胞質(zhì)中觀察到綠色熒光的產(chǎn)生，這說明所述GmNDRl蛋白能夠調(diào)控ICSl的啟動子起始轉(zhuǎn)錄。Western Blotting雜交的結(jié)果也再次證明了 GFP蛋白的增加是因為所述GmNDRl 蛋白的表達所引起的。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種可以誘導(dǎo)PRl基因啟動子的GmNDRl蛋白及其編碼核苷酸序列。實驗證明，將本發(fā)明的核苷酸序列構(gòu)建到表達載體，與連接有誘導(dǎo) PRl基因啟動子的GFP報告基因的表達載體共同轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體后，可以在原生質(zhì)體的細胞質(zhì)中觀察到綠色熒光的產(chǎn)生，這說明所述GmNDRl蛋白能夠調(diào)控PRl的啟動子起始轉(zhuǎn)錄。Western Blotting雜交的結(jié)果也再次證明了 GFP蛋白的表達是因為所述GmNDRl蛋白的表達所引起的。不受任何理論的約束，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為所述GmNDRl蛋白通過調(diào)控植物水楊酸合成促進了抗病基因PRl啟動子的起始轉(zhuǎn)錄。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明做進一步詳細說明。下述實施例中所用方法如無特別說明，則均為常規(guī)方法。具體步驟可參見 ((Molecular Cloning :A Laboratory Manual))(Sambrook J. ,Russell,David W. ,Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd edition,2001, NY,Cold Spring Harbor)。 Mffi弓L 合成及DNA序列測定，均由北京英駿生物有限公司進行。實施例1、與水楊酸合成相關(guān)GmNDRl基因的獲得檢索Phytozome數(shù)據(jù)庫及文獻，獲得GmNDRl基因的序列(登錄號 Glymal2g34210)，設(shè)計正向引物5，> GCTCTAGAATGGCGGCGGAGCACGAC > 3，和反向引物 5， > GCGAGCTCGAACCCACAAGCCACAAAAAGG > 3，。提取大豆葉片的 RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法將該基因擴增出來，構(gòu)建到3^-FLAG表達載體中，將連接產(chǎn)物通過熱激方法轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到2. 5ml含 50mg/L氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、180rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時。小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，送英駿生物公司進行序列測定。將測序正確的質(zhì)粒用QIAGEN生物公司的質(zhì)粒大提試劑盒進行質(zhì)粒大提，最終將質(zhì)粒濃度定為2ug/ul，OD2607280介于1. 8到2. 0之間，用于后面的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗。根據(jù)本實驗所設(shè)計的引物，最終成功克隆到了全長為651bp的GmNDRl基因(其核苷酸序列為SEQ ID N0:1所示序列)，電泳結(jié)果參見圖1，其中M代表核苷酸的marker，為 TaKaRa 公司的 DL2000。t施例2、擬南芥水楊酸合成關(guān)鍵某因ICSl某因啟動子(ProAtIcsl)的獲得檢索NCBI數(shù)據(jù)庫及文獻，獲得AtICSl的序列(登錄號AT1G74710)， 根據(jù)生物信息學(xué)的方法分析啟動子序列，根據(jù)其序列分析結(jié)果，分別設(shè)計正向弓丨物5，> AACTGCAGTTATCCACGCTTTGTCACACA > 3，和反向引物 5，> CGGGATCCCCATTGCAGAAATTCGTAAAGT > 3，。提取擬南芥葉片的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法將該基因擴增出來，構(gòu)建到326-GFP表達載體中，將連接產(chǎn)物通過熱激方法轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到2. 5ml含 100mg/L氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、180rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時。小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，送英駿生物公司進行序列測定。將測序正確的質(zhì)粒用QIAGEN生物公司的質(zhì)粒大提試劑盒進行質(zhì)粒大提，最終將質(zhì)粒濃度定為2ug/ul，OD2607280介于1. 8到 2. O之間，以用于后面的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗。根據(jù)本實驗所設(shè)計的引物，最終成功克隆到了全長為2102bp的擬南芥ICSl基因啟動子核苷酸片段(其核苷酸序列為SEQ ID NO 3所示序列)，電泳結(jié)果參見圖2，其中M 代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000。3、擬南芥棺4勿抗病基因PRl啟動子(Pro^)的獲得檢索NCBI數(shù)據(jù)庫及文獻，獲得AtPRl的序列(登錄號AT2G14610)， 根據(jù)生物信息學(xué)的方法分析啟動子序列，根據(jù)其序列分析結(jié)果，分別設(shè)計正向引物5，> AACTGCAGTGGCAAATAAACAACGGACA >3，和反向引物 5，> CCGCTCGAGTAAAATTCATTTTTCTAAGTTGA > 3，。提取擬南芥葉片的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA， 用TaKaRa公司I^rimeSTAR HS高保真酶的方法將該基因擴增出來，構(gòu)建到326-GFP表達載體中，將連接產(chǎn)物通過熱激方法轉(zhuǎn)化進大腸桿菌DH5 α菌株，挑選陽性菌落加入到2. 5ml含 100mg/L氨芐霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、180rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時。小量提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確后，送英駿生物公司進行序列測定。將測序正確的質(zhì)粒用QIAGEN生物公司的質(zhì)粒大提試劑盒進行質(zhì)粒大提，最終將質(zhì)粒濃度定為2ug/ul，OD2607280介于1. 8到 2. O之間，以用于后面的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化試驗。根據(jù)本實驗所設(shè)計的引物，最終成功克隆到了全長為1939bp的擬南芥PRl基因啟動子核苷酸片段(其核苷酸序列為SEQ ID NO :4所示序列)，電泳結(jié)果參見圖3，其中M代表核苷酸的marker，為TaKaRa公司的DL2000。實施例4、擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化實施例4. i、326-ProAtICS1: :GFP表達載體與326-GmNDRl:FLAG表達載體的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建正確的3^_ProAtiesi GFP表達載體(參見圖5 ；GFP的核苷酸序列為 SEQ IDNO :5所示序列)，分別與構(gòu)建正確的326-GmNDRl:FLAG表達載體(參見圖4)和 326-T7-FLC表達載體共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體。采用PEG介導(dǎo)的擬南芥葉片原生質(zhì)體瞬時表達的方法。在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)擬南芥種子，待根長至1-3厘米時即可移栽到土里，溫室培養(yǎng)，光照12h/12h，150 μ E0準(zhǔn)備好一個90mm培養(yǎng)皿，稱1. 82g D-甘露醇于20ml雙蒸水中。培養(yǎng)皿的蓋子用來切葉片。取4周后未抽薹前的葉片，約90片。切成Imm寬的長條， 置于甘露醇溶液中。配酶解液，IOOml三角瓶，15ml酶解體系。將細條撈出，置于酶解液中。 黑暗，23°C，40-50rpm酶解3小時。酶解液過100-200目的篩子，將過濾后的綠色混合物置于15ml離心管(直徑約Icm)中，均分為兩管。4°C，60g，15分鐘。棄上清，沉淀用冰冷的 W5溶液輕柔洗滌，每管。4°C，100g, 1分鐘。棄上清，沉淀用冰冷的W5溶液輕柔洗滌，每管鈿1。冰上放置30分鐘。23°C，100g，l分鐘。棄上清，每管沉淀用0.5ml MaMg重懸。共轉(zhuǎn)化時，每種質(zhì)粒取約15ug于IOml管中，加300ul原生質(zhì)體。用200ul槍頭(剪去前端) 輕柔混勻。加入310ulPEG4000/Ca(NO3)2溶液，輕柔混勻。放置20-30分鐘。加入Iml W5 溶液，來回顛倒混勻。23°C，100g，l分鐘。棄上清，加IOOul W5，混勻。加900ul W5，混勻。 上述混合液體置于六孔板內(nèi)，230C，弱光，孵育6-18小時。熒光觀察，觀察之后常溫IOOg離心2分鐘，終體積控制在50ul，液氮速凍之后，置于-80°C保存。實施例4. 2、326-ProWR1: :GFP表汰載體與326_GmNDRl :FLAG表汰載體的轉(zhuǎn)化按照實施例4. 1所述方法，將構(gòu)建正確的326_ftx)AtPK1: GFP表達載體(參見圖6)， 分別與構(gòu)建正確的326-GmNDRl :FLAG表達載體(參見圖4)和326_T7_FLC表達載體共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體。棚列5詹后_·補本白喊·■趣吸取轉(zhuǎn)化后的擬南芥原生質(zhì)體30ul，置于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片后，放于 ZEISSAXI0SK0P熒光顯微鏡下進行觀察和拍照。實施例5. U326-Pro,tIcsl: :GFP表達載體與326-GmNDRl FLAG表達載體轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化了 3^-ProAtiesi: :GFP和326-GmNDRl FLAG載體的擬南芥原生質(zhì)體的熒光顯微鏡觀察結(jié)果參見圖7，分別進行了熒光觀測和明場觀測。根據(jù)圖7所示，我們可以得到在熒光觀測下，在共同轉(zhuǎn)化了 3^-ProAtiesi: :GFP和3^_GmNDRl :FLAG載體的原生質(zhì)體中， 出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)化326-GFP載體的正對照相同的綠色熒光。并且此時作為負(fù)對照的共同轉(zhuǎn)化 326-ProAtIcsl: :GFP和326_T7_FLC載體的原生質(zhì)體并不能觀察到明顯的綠色熒光。這樣的結(jié)果表明，GmNDRl表達的蛋白，可以與ICSl啟動子區(qū)作用，并且促使其后續(xù)GFP基因的表達。 因此可以判斷，GmNDRl基因在正調(diào)控水楊酸合成關(guān)鍵酶ICSl的啟動子上，起到了促進的作用。實施例5. 2、326-ProWR1: :GFP表達載體與326-GmNDRl FLAG表達載體轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化了 3^-ProAtPK1 GFP和326-GmNDRl FLAG表達載體的擬南芥原生質(zhì)體的熒光顯微鏡觀察結(jié)果參見圖10。分別進行了熒光觀測和明場觀測。根據(jù)圖10所示，我們可以得到在熒光觀測下，在共同轉(zhuǎn)化了 3^-ProAtPK1 :GFP和326-GmNDRl FLAG載體的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與轉(zhuǎn)化326-GFP載體的正對照相同的綠色熒光。并且此時作為負(fù)對照的共同轉(zhuǎn)化326-ProAtPK1: :GFP和326_T7_FLC載體的原生質(zhì)體并不能觀察到明顯的綠色熒光。這樣的結(jié)果表明，GmNDRl蛋白促進了水楊酸的合成關(guān)鍵酶ICSl基因的表達，并且最終可以導(dǎo)致抗病基因PRl啟動子起始轉(zhuǎn)錄，并且促使其后續(xù)GFP基因的表達。不受任何理論的約束，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為GmNDRl基因通過調(diào)控植物水楊酸的合成促進了抗病基因PRl啟動子的起始轉(zhuǎn)錄。
實施例6、轉(zhuǎn)化后擬南芥原牛質(zhì)體總可溶蛋白的Western Blotting檢測丨將轉(zhuǎn)化后的擬南芥原生質(zhì)體加入等體積2 X上樣緩沖液，沸水煮5分鐘，離心后用于SDS-PAGE電泳。SDS-PAGE電泳分離膠采用濃度12%的均一膠，濃縮膠濃度為4%。分離膠之上覆蓋一層長度約Icm的4%濃縮膠。本試驗電流采用20mA/板。電泳完畢后切去濃縮膠等多余部分，并切去凝膠的右上角作為上樣順序標(biāo)記。電泳凝膠在轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10-20分鐘。之后剪取與電泳凝膠大小一樣的PVDF膜，也在右上角做一標(biāo)記。之后先用甲醇浸潤10秒，用水沖洗之后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10分鐘。然后打開半干轉(zhuǎn)膜儀，依次放置三層濾紙、PVDF膜、電泳凝膠、三層濾紙，合上轉(zhuǎn)膜儀頂蓋。操作過程中，一定要將膜與膠之間的氣泡全部趕出，最后再次確定蛋白是從負(fù)極到正極移動。 待裝好電轉(zhuǎn)移裝置后，設(shè)定電流大小為所轉(zhuǎn)膜面積的0.8倍，即I (mA) =Area(Cm2)XO. 8, 電轉(zhuǎn)移1. 5小時。電轉(zhuǎn)移完成后，將PVDF膜取出放在培養(yǎng)皿中，將與凝膠接觸的一面向上，用TTBS 短暫沖洗后加入TTBS封閉液(TTBS+5%脫脂奶粉)，4°C封閉2小時以上。當(dāng)膜封閉好之后，按1 2000 (ν/ν)稀釋倍數(shù)加入GFP或者FLAG的一抗，4°C結(jié)合過夜。第二天用TTBS洗滌3次，每次5分鐘。然后按照1 5000 (ν/ν)稀釋倍數(shù)，加入羊抗鼠的辣根過氧化物酶HRP抗體，4°C結(jié)合2小時。再用TTBS洗滌3次，每次5分鐘。將ECL超敏化學(xué)發(fā)光液(普利萊生物公司)A和B等體積混合后加到膜上，用保鮮膜包裹平整后，在暗室中壓上X光膠片，曝光顯影、定影。最后待X光膠片晾干之后，掃描保存。實施例6. U326-Pro,tIcsl: :GFP表達載體與326_GmNDRl :FLAG表達載體轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體對轉(zhuǎn)化3^-ProAtiesi :GFP和326_GmNDRl :FLAG載體后的擬南芥原生質(zhì)體，進行總可溶蛋白的Western Blotting檢測。結(jié)果參見圖8，當(dāng)用Anti-GFP抗體雜交時我們發(fā)現(xiàn)，在共同轉(zhuǎn)化了 326-ftOAtIcsl: :GFP和326-GmNDRl :FLAG載體的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與326-GFP 正對照相同條帶，可以確定為GFP條帶，而在作為負(fù)對照的共同轉(zhuǎn)化3^-ProAtresi: :GFP和 326-T7-FLC載體的原生質(zhì)體中，并沒有GFP蛋白信號。為了判斷GFP的產(chǎn)生是否與GmNDRl蛋白有關(guān)，我們又用Anti-FLAG抗體與三種轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體進行了 Western Blotting檢測，結(jié)果參見圖9。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對轉(zhuǎn)化 326-ProAtIcsl :GFP 和 326-GmNDRl FLAG 載體的擬南芥原生質(zhì)體中，326-GmNDRl :FLAG 確實得到了表達，這就進一步從蛋白水平說明了 GmNDRl基因所表達的蛋白，可以與ICSl的啟動子區(qū)作用，并且促使其后續(xù)GFP基因的表達。因此可以判斷，GmNDRl基因在正調(diào)控水楊酸合成關(guān)鍵酶基因ICSl的啟動子上，起到了促進的作用。實施例6. 2、326-ProWR1 :GFP表達載體與326-GmNDRl FLAG表達載體轉(zhuǎn)化的擬南芥原生質(zhì)體對轉(zhuǎn)化3^-ProAtPK1: :GFP和326-GmNDRl FLAG載體后的擬南芥原生質(zhì)體，進行總可溶蛋白的Astern Blotting檢測。結(jié)果參見圖11，當(dāng)用Anti-GFP抗體雜交時我們發(fā)現(xiàn)， 在共同轉(zhuǎn)化了 326-ftOAtPK1: GFP和326-GmNDRl:FLAG載體的原生質(zhì)體中，出現(xiàn)了與M6-GFP 正對照相同條帶，可以確定為GFP條帶，而在作為負(fù)對照的共同轉(zhuǎn)化3^-ProAtPK1: :GFP和 326-T7-FLC載體的原生質(zhì)體中，并沒有GFP蛋白信號。
為了判斷GFP的產(chǎn)生是否與GmNDRl蛋白有關(guān)，我們又用Anti-FLAG抗體與三種轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體進行了 Western Blotting檢測，結(jié)果參見圖12。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對轉(zhuǎn)化 326-ProAtPE1: :GFP 和 326_GmNDRl :FLAG 載體的擬南芥原生質(zhì)體中，326_GmNDRl :FLAG 確實得到了表達，這也進一步說明了 GmNDRl蛋白誘導(dǎo)了擬南芥原生質(zhì)體中水楊酸合成關(guān)鍵酶 ICSl基因的表達，并且最終可以導(dǎo)致下游抗病基因rai啟動子起始轉(zhuǎn)錄，促使了后續(xù)GFP基因的表達。不受任何理論的約束，本發(fā)明的發(fā)明人認(rèn)為GmNDRl基因通過調(diào)控植物水楊酸的合成促進了抗病基因PRl啟動子的表達。本說明書中提及的所有出版物都通過引用納入本文中。本說明書中對文獻、操作、 材料、儀器、文章等的任何討論，都僅為本發(fā)明公開的實施方式提供上下文背景。不應(yīng)將其視為承認(rèn)這些材料中的任一或全部形成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分、或者是本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)知識。如本說明書顯示的，在不背離所公開的本發(fā)明精神或范圍的前提下，可以根據(jù)公開的實施方式產(chǎn)生多種變化和/或修飾，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，在各方面，本發(fā)明的實施方式都應(yīng)認(rèn)為是示例性而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)植物中水楊酸合成的方法，該方法包括將編碼下述蛋白的核苷酸序列導(dǎo)入植物細胞，并使該核苷酸序列表達(i)所述蛋白具有SEQID NO 2的氨基酸序列；或(ii)通過置換、缺失或添加SEQID NO :2氨基酸序列中的氨基酸而形成的類似物蛋白，該類似物蛋白可以調(diào)節(jié)植物中水楊酸的合成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述置換是氨基酸保守置換。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列為SEQID NO :1所示序列。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列在嚴(yán)格雜交條件下可以與SEQID NO 1核苷酸序列的互補序列雜交。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核苷酸序列的核苷酸序列與SEQID N0:1核苷酸序列基本一致。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述核苷酸序列的核苷酸序列與SEQID N0:1核苷酸序列具有至少90%的一致性。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述蛋白通過調(diào)控所述植物中異分支酸合成酶基因啟動子來調(diào)節(jié)該植物中水楊酸的合成。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述異分支酸合成酶基因啟動子具有SEQID NO 3 的核苷酸序列。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物細胞來源于雙子葉植物或單子葉植物。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述植物細胞是大豆細胞。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述病害包括根腐病、灰斑病。
12.—種生產(chǎn)具有增強的病害抗性的植物的方法，該方法包括(a)提供表達編碼下述蛋白的核苷酸序列的植物細胞(i)所述蛋白具有SEQID NO 2的氨基酸序列；或(ii)通過置換、缺失或添加SEQID NO :2氨基酸序列中的氨基酸而形成的類似物蛋白，該類似物蛋白可以增強植物對病害的抗性；和(b)將所述植物細胞培養(yǎng)為植物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述蛋白通過調(diào)節(jié)所述植物中水楊酸的合成來使該植物的病害抗性增強。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)具有增強的病害抗性的植物的方法。在某些方面，本發(fā)明提供了一種GmNDR1蛋白及其編碼基因，該蛋白通過調(diào)控植物中水楊酸的合成，增強了植物的抗病性。
文檔編號C12N15/29GK102477434SQ201010555019
公開日2012年5月30日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者周曉鋒, 蔡斌, 金京波 申請人:中國科學(xué)院植物研究所