專利名稱：松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于應用微生物學、分子生物學技術領域，具體涉及一種松口蘑培養(yǎng)物基 因組的制備方法。
背景技術：
松口蘑(Tricholoma matsutake)又名松茸，是一種與植物共生的真菌，其子實體 是具有食藥用價值的昂貴蘑菇，目前國際上尚不能人工栽培。我國東北長白山區(qū)、西南橫斷 山區(qū)野生的松口蘑主要供出口，每年為國家賺回近百億美元。為了保護利用這一珍稀的自 然資源，迫切需要解讀松口蘑的基因組，發(fā)展松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法。由于松口蘑子實體珍稀昂貴，研究材料針對松口蘑的純培養(yǎng)菌絲體，而松口蘑培 養(yǎng)物屬于難培養(yǎng)微生物，其生長速度異常緩慢，在優(yōu)選培養(yǎng)基上培養(yǎng)2個月，其菌落直徑不 到1cm，菌體生物量太少，常規(guī)絲狀菌制備基因組的方法不適用松口蘑。制備基因組的技術操作單元主要是細胞裂解、萃取、過濾、沉淀，其中生物化學的 萃取、過濾、沉淀技術已經成熟，但細胞裂解因應用微生物種類不同必須采用適宜的獨特技 術，國內外迄今發(fā)表的研究文獻都是圍繞該技術進行發(fā)明創(chuàng)造。檢索國內外迄今發(fā)表的研 究文獻，細胞裂解技術包括1、機械法，主要是各種液氮研磨、室溫研磨、玻璃珠研磨等手段，缺點是操作繁瑣， 操作中生物量有損失，得率低，不安全，基因組降解，產品質量不穩(wěn)定。2、化學法，采用氯化芐、各類溶菌酶消化，缺點是特異性差，成本高，適用范圍狹窄。3、物理法，報道了應用超聲波、微波、電鉆、煮沸等方法，缺點是操作繁瑣，不安全， 基因組降解，產品質量不穩(wěn)定，生物活性喪失。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，該方法得率高，制 備的松口蘑培養(yǎng)物基因組的質量完整、純度高。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案是松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方 法，其特征在于它包括如下步驟1)從松口蘑子實體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；2)保護緩沖液的配制:50mmol/L Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液的pH為 8.0) ；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA的中文名乙二胺四乙酸鈉，EDTA的pH為8. 0)； 1. 4mol/LNaCl 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB的中文名十六烷基三甲基溴化銨)；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒于保護緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復上 述震蕩、液氮冷凍、水浴過程1 3次；得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液；4)按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松 口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯仿與異戊醇的體積比為M 1 ；用氯仿/異戊醇萃取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液中的松口蘑培養(yǎng)物基因組， 離心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對上清液進行沉淀，離心，得到沉淀物；沉淀物用 乙醇洗后風干，溶于TE緩沖液，置-20°C下保存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組。步驟3)所述的松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與保護緩沖液的配比為IOmg 500 μ L0步驟幻所述的震蕩、液氮冷凍、水浴為震蕩10s，液氮冷凍10s，70°C水浴30s。步驟4)所述的萃取時間為30s，離心為13000g離心lmin。步驟5)所述的離心為4000g離心lmin。步驟幻所述的TE緩沖液的用量為按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與TE緩沖液的配比 為 IOmg 50 μ L0 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明先保護緩沖液對樣品進行預保護，避免基因組降解；然后采用低溫快速 凍結與常溫快速融化交替1 3次，引起微量培養(yǎng)物細胞完美裂解，所得松口蘑培養(yǎng)物基因 組的質量完整，生物活性保持。2、低溫快速凍結，不需手工操作，安全；抑制降解酶，保持生物活性；3、常溫快速融化，常規(guī)設備，成本低廉，方便安全；4、用料微量，步驟少，耗時短，效率高；5、對松口蘑微量培養(yǎng)菌體，沒有操作損失，得率高，可收獲足量高分子質量的基因 組，IOmg培養(yǎng)物可制備濃度在30-50 μ g/mL的產品，滿足100次以上的PCR實驗用量；6、純度高。主要用途廣泛適用于各種分子生物學實驗與遺傳操作，可以解讀松茸基因組信 息、制備分子條碼，進行染色體解組等分子育種，馴化栽培松茸，開發(fā)生物技術藥物。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結合實施例進一步闡明本發(fā)明的內容，但本發(fā)明的 內容不僅僅局限于下面的實施例。實施例1 松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，它包括如下步驟1)、從松口蘑子實體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；經 DNA親菌鑒定確認無誤后進入下面的操作步驟。2)、保護緩沖液的配制:50mmol/L Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液的pH為 8.0) ；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA的中文名乙二胺四乙酸鈉，EDTA的pH為8. 0)； 1. 4mol/LNaCl 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB的中文名十六烷基三甲基溴化銨)。3)取IOmg松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物，用500 μ L保護緩沖液浸沒，震蕩10s，液氮冷 凍10s，70°C水浴30s ；重復上述震蕩、液氮冷凍、水浴過程3次，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物 的裂解液。4)、按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松 口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯仿與異戊醇的體積比為M 1 ；萃取30s ； 13000g離心Imin ；收集上清液。5)以與上清液等體積的異丙醇對上清液進行沉淀，4000g離心lmin，得到沉淀物； 沉淀物用70wt%乙醇洗后風干，溶于50 μ 1 TE緩沖液(10mmol/l Tris-HCl，pH8. 0 ； lmmol/ 1 EDTA)，置-20°C下保存，即為松口蘑培養(yǎng)物基因組制品(產品)。質量標準10mg松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物可制備濃度在30-50 μ g/mL的產品(說明 得率高)，經電泳檢測基因組質量完整，分子量高，滿足100次以上的PCR實驗用量；用分光 光度計測定0D26(i/28(i在1. 8-2. 0之間，表明雜質少，純度高，廣泛適用于各種分子生物學實驗 與遺傳操作。實施例2 松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，它包括如下步驟1)從松口蘑子實體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物(采用現(xiàn)有方法)，得到松口蘑的菌 絲體培養(yǎng)物(為現(xiàn)有的)；2)保護緩沖液的配制50mmol/L(25°C時)Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液 的pH為8. 0) ；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉(EDTA的中文名乙二胺四乙酸鈉，EDTA的pH為 8.0) ； 1.4mol/L NaCl十六烷基三甲基溴化銨(CTAB的中文名十六烷基三甲基溴化 銨)；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒于保護緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復上 述震蕩、液氮冷凍、水浴過程1次；得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液；4)按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松 口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯 仿與異戊醇的體積比為M 1 ；用氯仿/異戊醇萃取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液中的松口蘑培養(yǎng)物基因組， 離心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對上清液進行沉淀，離心，得到沉淀物；沉淀物用 乙醇洗后風干，溶于 TE 緩沖液(10mmol/L Tris-HCl, ρΗ8· 0 ；lmmol/L EDTA)，置 _20°C下保 存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組制品。質量標準10mg松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物可制備濃度在30-50 μ g/mL的產品(說明 得率高)，經電泳檢測基因組質量完整，分子量高，滿足100次以上的PCR實驗用量；用分光 光度計測定0D26(i/28(i在1. 8-2. 0之間，表明雜質少，純度高，廣泛適用于各種分子生物學實驗 與遺傳操作。
權利要求
1.松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)從松口蘑子實體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；2)保護緩沖液的配制50mmol/LTris-HCl緩沖液；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉； 1. 4mol/LNaCl ；十六烷基三甲基溴化銨；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒于保護緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復上述震 蕩、液氮冷凍、水浴過程1 3次；得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液；4)按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液與氯仿/異戊醇的體積比為1 1，選取松口蘑 的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液、氯仿/異戊醇；其中氯仿/異戊醇由氯仿和異戊醇組成，氯仿與 異戊醇的體積比為M 1 ；用氯仿/異戊醇萃取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物的裂解液中的松口蘑培養(yǎng)物基因組，離 心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對上清液進行沉淀，離心，得到沉淀物；沉淀物用乙醇 洗后風干，溶于TE緩沖液，置_20°C下保存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組。
2.根據權利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與保護緩沖液的配比為IOmg 500 μ L0
3.根據權利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的震蕩、液氮冷凍、水浴為震蕩10s，液氮冷凍10s，70°C水浴30s。
4.根據權利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟4)所述 的萃取時間為30s，離心為:13000g離心Imin0
5.根據權利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的離心為4000g離心lmin。
6.根據權利要求1所述的松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于步驟幻所述 的TE緩沖液的用量為按松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物與TE緩沖液的配比為IOmg 50 μ L0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法。松口蘑培養(yǎng)物基因組的制備方法，其特征在于它包括如下步驟1)從松口蘑子實體中分離純種菌絲體培養(yǎng)物，得到松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物；2)保護緩沖液的配制50mmol/L Tris-HCL緩沖液；50mmol/L乙二胺四乙酸鈉；1.4mol/L NaCl；4wt％十六烷基三甲基溴化銨；3)取松口蘑的菌絲體培養(yǎng)物浸沒于保護緩沖液中，震蕩、液氮冷凍、水浴，重復上述震蕩、液氮冷凍、水浴過程1～3次；4)萃取，離心，收集上清液；5)以與上清液等體積的異丙醇對上清液進行沉淀，離心，得到沉淀物；溶于TE緩沖液，保存，得到松口蘑培養(yǎng)物基因組。該方法用料微量、步驟少、耗時短、得率高，制備的松口蘑培養(yǎng)物基因組的質量完整、純度高。
文檔編號C12N15/31GK102061298SQ201010557760
公開日2011年5月18日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權日2010年11月23日
發(fā)明者曾東方, 陳玢 申請人:武漢工程大學