專利名稱：靈芝漆酶基因及其真核表達(dá)和純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種靈芝漆酶基因及其真核表達(dá)和純化方法。
背景技術(shù)：
漆酶(EC 1. 10. 3. 2)是一種含銅的氧化還原酶，屬于氧化酶的藍(lán)銅家族(Eur J Biocheml87 :341-352)。漆酶的應(yīng)用范圍很廣，目前研究它的應(yīng)用主要集中在它降解各種化工染料(J Ind Microbiol Biotechnol 31 127-132)、芳香族類化合物(Microbial Cell Factories 5 :31)以及二酚、多酚類化合物(Process Biochemistry 45 :507-513)的功能。 除此之外，漆酶在不同的物種發(fā)揮不同的功能在昆蟲中，它們參與甲殼的硬化；在植物中，參與細(xì)胞壁形成，還與木質(zhì)素化和去木質(zhì)素有關(guān)；在芽孢桿菌中，則是和抗紫外線的孢子組裝有關(guān)；在一些植物致病性真菌利用這類酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用。眾所周知， 漆酶給工業(yè)生產(chǎn)方面帶來了巨大的貢獻(xiàn)。大量的漆酶基因從植物(J Chem Soc 43:472)、 動(dòng)物(萬云洋，博士論文，武漢大學(xué))和微生物(Microbiology 148 =4003-4014)中分離出來，進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。在NCBI數(shù)據(jù)庫中，收集了很多微生物的全基因組的信息，其中編碼蛋白的序列都被注釋了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注釋蛋白的功能可以完善這些酶學(xué)，并運(yùn)用到工業(yè)應(yīng)用中去。多孔菌科靈芝屬于白腐菌擔(dān)子菌綱家族，是亞洲很受歡迎的藥用菌類。它的化學(xué)成分較為復(fù)雜，含有多糖類、免疫調(diào)節(jié)蛋白(Phytochemistry 67 =1985-2001)以及抗腫瘤蛋白(Immunol Invest 34 171-198)等。然而來自靈芝的漆酶生理生化特性研究和應(yīng)用還很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種靈芝漆酶基因及其真核表達(dá)和純化方法，即通過化學(xué)合成方法得到所述的漆酶基因，研究其生理生化特性，將其應(yīng)用于真核生物的表達(dá)和純化中。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下方式來實(shí)現(xiàn)的。所述的靈芝漆酶基因，來自于靈芝，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，其是通過化學(xué)合成方法制得的。即采用大量重疊的引物通過兩步 PCR 進(jìn)行全基因合成(PTDS) (Nucleic Acids Research，2004，32 :e98)。該方法是通過重疊延伸獲得合成基因的片段，再通過最外側(cè)的引物將全長的基因擴(kuò)增得到。該方法的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)就是不需要對(duì)引物進(jìn)行磷酸化處理。而且通過高通量的DNA合成儀器， 可以較為便利地獲得大量的引物。所述的靈芝漆酶基因，其具體合成方法如下1、引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)長度大概為60mer左右的覆蓋整個(gè)靈芝漆酶基因的寡核苷酸的序列36個(gè)，作為引物。每相鄰的兩個(gè)寡核苷酸序列有20個(gè)堿基的重復(fù)。利用PCR進(jìn)行靈芝漆酶基因擴(kuò)增，在100 μ 1反應(yīng)體系中，Ρ2-Ρ35共34個(gè)引物的添加量為2ng，外側(cè)引物Pl和P36添加量為30ng，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱Imin ；94°C,30s, 52°C，30s，72°C，1. 5min，72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KOD FX taq 酶 CToyobo 公司，日本)，共30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，1 %瓊脂糖膠回收片段，取10 μ 1直接與Τ/Α克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化于DH5ci感受態(tài)中，即獲得長度為1512bp的陽性克隆，即為本發(fā)明的靈芝漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ IDNo 2所示。將上述制得的漆酶基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞中。即將上述制得的漆酶基因直接與真核表達(dá)載體pYM7909(上海市農(nóng)科院生物所實(shí)驗(yàn)室提供)相連，經(jīng)過DH5ci克隆過的環(huán)形質(zhì)粒單酶切使其線性化，取約1 μ 1的線性DNA與80 μ 1畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化，然后涂布于固體SD山梨醇培養(yǎng)基QOg/L瓊脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，
繼續(xù)培養(yǎng)3天后獲得白色菌落。挑取經(jīng)測(cè)活呈陽性的畢赤酵母進(jìn)行細(xì)胞外分泌表達(dá)純化，即獲得純化后的靈芝漆酶基因。本發(fā)明的靈芝漆酶基因是一類應(yīng)用非常廣泛的生物用酶，通過克隆，可以高效合成本發(fā)明的漆酶基因，通過對(duì)該基因真核表達(dá)和純化，可以將其應(yīng)用于靈芝漆酶基因的工業(yè)生產(chǎn)中。


圖1為本發(fā)明的靈芝漆酶基因的化學(xué)合成方法策略圖。圖2為以pYM7909質(zhì)粒構(gòu)建DNA表達(dá)單元的示意圖。圖3為酶的最適溫度、最適PH及溫度和pH的穩(wěn)定性結(jié)果，其中，圖A為靈芝漆酶的最適溫度；圖B為該漆酶最適pH值；圖C為該漆酶溫度穩(wěn)定性；圖D為該漆酶pH穩(wěn)定性。圖4為金屬離子對(duì)酶活的影響。圖5為有機(jī)無機(jī)化合物對(duì)酶活的影響，其中1.對(duì)照，2.硫代硫酸鈉，3.疊氮化鈉， 4.甘露醇，5.低亞硫酸鈉，6. L型-丙氨酸，7. L型-組氨酸，8. L型-甘氨酸，9. L型-精氨酸，10. L型-天門冬氨酸，11. L型-苯丙氨酸。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學(xué)出版社。)實(shí)施例1靈芝漆酶基因的化學(xué)合成參看圖1，以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆制備本CN 102533803 A發(fā)明的靈芝漆酶基因。設(shè)計(jì)的引物如下Pl :Tm = 54,60merGCT，GCT，GTC，GTC，GTC，AAT，GGT，GTC，TTC，CCT，GGT，CCA，CTG，ATC，ACT, GGC， AAC，AAG，GGA，GACP2 :Tm = 54,60merTGT，GGT，TGG，TCA，GCT，GGT，CGA，TGA，CGT，TCA，GCT，GGA，ATC，TGT，CTC，CCT， TGT, TGC, CAG, TGAP3 :Tm = 54,60merCGA，CCA，GCT，GAC，CAA，CCA，CAC，CAT, GCT，GAA，GAC，CAC，CTC，CAT, CCA，CTG， GCA，TGG，CTT，CTTP4 :Tm = 54,60merGAT，GAA，GGC，AGG，ACC，ATC，AGC，CCA，GTT，AGT，ACC，TTT，CTG，GAA，GAA，GCC， ATG，CCA，GTG，GATP5 :Tm = 54,60merCTG，ATG，GTC，CTG，CCT，TCA，TCA，ACC，AGT，GTC，CAA，TCG，CTT，CTG，GTC，ATT， CCT，TCC，TGT，ACGP6 :Tm = 54,60merTGA，TAC，CAG，AAG，GTG，CCA，GCT，TGA，TCT，GGA，ACT, TGA，AAG，TCG，TAC，AGG， AAG，GAA，TGA，CCAP7 :Tm = 54,60merGCT，GGC，ACC，TTC，TGG，TAT，CAC，TCT，CAT, CTG，TCT，ACT, CAG，TAC，TGT，GAT， GGT，CTG，AGA，GGTP8 :Tm = 54,60merGAC，CCT，TCA，GAG，GAT，CTT，TAG, GAT，CAT, AGA，CAA，CGA，ATG，GAC，CTC，TCA， GAC，CAT, CAC，AGTP9 :Tm = 54,60merTAA，AGA，TCC，TCT，GAA，GGG，TCT，GTA，CGA，TGT，TGA，TAA，CGA，TTC，TAC，TGT， TAT，CAC，TCT，GTCPlO :Tm = 54,60merGAA，GGA，AGG，TCC，AAG，TCT，GGC，AGC，AAC，ATG，ATA，CCA，GTC，AGA，CAG，AGT， GAT，AAC，AGT，AGAPll :Tm = 54,60merCCA，GAC，TTG，GAC，CTT，CCT，TCC，CAC，TGG，GTT，CTG，ACT, CCA，CTC，TGA，TCA， ATG，GTC，TGG，GTAP12 :Tm = 54,60merTTG，ATG，ACA，GCA，AGA，CCA，GCA，GTA，GCG，TTG，GTG，GTG，GAT，CTA，CCC，AGA， CCA，TTG，ATC，AGAP13 :Tm = 54,60merGCT，GGT，CTT，GCT，GTC，ATC，AAC，GTC，ACC，CAA，GGC，AAG，AGA，TAC，AGA，TTC，AGA，CTG，GTC，TCCP14 :Tm = 54,60merGAC，CAT, CGA，TAG, AGA，AGG，TGT，AGT，TAG, GAT，CAC，AGG，ACA，GGG，AGA，CCA， GTC，TGA，ATC，TGTP15 :Tm = 54,60merCAC，CTT，CTC，TAT，CGA，TGG，TCA，TGA，CAT, GTC，CGT，CAT, CGA，AGC，TGA，TGG， CAT, TGC，TAC，TCAP16 :Tm = 54,60merCTG，AGC，AGA，GAA，GAT，TTG，GAT，AGC，GTT，AGC，AGT，GAC，AGG，TTG，AGT，AGC， AAT，GCC，ATC，AGCP17 :Tm = 54,60merTCC，AAA, TCT，TCT，CTG，CTC，AGA，GAT，ACT, CCT，TCG，TCC，TGA，CTG，CCA，ACC， AGA，CCA，TTG，GCAP18 :Tm = 54,60merCCG，ATG，TTT，CCG，AAG，GAA，GGA，TTG，GCT，CTG，ATC，CAG，TAG, TTG，CCA，ATG， GTC, TGG, TTG, GCAP19 :Tm = 54,60merCCT，TCC，TTC，GGA，AAC，ATC，GGT，TTC，ACC，AAT，GGC，ATC，AAC，TCT，GCC，ATC， CTG，AGA，TAC，TCTP20 :Tm = 54,60merTGG，TCT，GTT，GAG，CAG，TAG, TAG, GTT，CGA，TAG, GAT，CAG，CTC，CAG，AGT，ATC， TCA, GGA, TGG, CAGP21 :Tm = 54,60merTAC，TAC，TGC，TCA，ACA，GAC，CAC，TCA，GAA，CCT，GCT，GAA，CGA，AGT，TGA，TCT， GCA，TCC，ATT，CGTP22 :Tm = 54,60merAGT，ACC，ACC，TTG，AGT，AGC，TCT，ACC，AGG，AGT，CTG，CTT，AGC，AAC，GAA，TGG， ATG，CAG，ATC，AACP23 :Tm = 54,60merGAG, CTA，CTC，AAG，GTG，GTA，CTG，ATG，TTG，CCA，TCA，ACA，TGG，TCT，TCA，ACT, TCA，ATG，GCT，CCAP24 :Tm = 54,60merACA，GTT，GGT，GGA，GTG，AAG，GAA，GCG，TTG，TTG，ATG，AAG，AAG，TTG，GAG，CCA， TTG，AAG，TTG，AAGP25 :Tm = 54,60merTCC，TTC，ACT, CCA，CCA，ACT, GTT，CCT，GTC，CTG，CTT，CAG，ATT，CTG，TCT，GGT， GCA，CAA，GCA，GCTP26 :Tm = 54,60merTAG, GAA，GAG, TGT，AGA，CAG，AGC，CAG，ATG，GAA，GCA，GAT，CCT，GAG，CTG，CTT，GTG，CAC，CAG，ACAP27 :Tm = 54,60merCTC，TGT，CTA，CAC，TCT，TCC，TAT，CAA，CAA，GTC，CAT, CGA，ACT, CAC，CTT，TCC， TGC，TAC，TGT，CAAP28 :Tm = 54,60merGTG，ACC，ATG，CAG，GTG，GAA，TGG，ATG，TGG，AGC，ACC，AGG，AGC，ATT，GAC，AGT， AGC，AGG，AAA, GGTP29 :Tm = 54,60merCAT, TCC，ACC，TGC，ATG，GTC，ACT, CCT，TCG，CTG，TCG，TCA，GAA，GTG，CTG，GTT， CCA，CCG，AGT，ACAP30 :Tm = 54,60merCCA，GTG，GAG，ACG，ACG，TCT，CTC，CAG，ACA，GGG，TTG，TTG，TAG, TTG，TAC，TCG， GTG，GAA，CCA，GCAP31 :Tm = 54,60merAGA，GAC，GTC，GTC，TCC，ACT, GGT，ACT, CCT，GCT，GCT，GGT，GAT，AAC，GTC，ACC， ATC，AGA，TTC，CAGP32 :Tm = 54,60merCGA，TGT，GAC，AAT，GCA，GGA，ACC，AAG，GTC，CAG，GAT，TGT，CAG，TCT，GGA，ATC， TGA, TGG, TGA, CGTP33 :Tm = 54,60merGTT，CCT，GCA，TTG，TCA，CAT, CGA，CTT，TCA，TCT，CGA，AGC，TGG，CTT，TGC，TGT， TGT, CTT, TGC, TGAP34 :Tm = 54,60merCTG，TGG，AAC，ATG，GTT，GGC，AAG，AGA，AGT，GTC，AGC，AGT，GTC，TTC，AGC，AAA, GAC，AAC，AGC，AAAP35 :Tm = 54,60merTTG，CCA，ACC，ATG，TTC，CAC，AGG，CTT，GGT，CTG，ACC，TGT，GTC，CTA，CCT，ACG， ATG，CTC，TCT，CTGP36 :Tm = 54,40merGAG, CTC，TTA，GTG，GTC，GTC，AGC，AGA，GAG，AGC，ATC，GTA，GGT，A利用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，在100 μ 1反應(yīng)體系中，Ρ2—Ρ35共34個(gè)引物的添加量為 2ng，外側(cè)引物Pl和P36添加量為30ng，擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱Imin ；94°C 30s, 52°C 30s， 72°C 1.5min，72°C lOmin，使用的 iTaq DNA 聚合酶為 KOD FX taq 酶 CToyobo 公司，日本)，共 30個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后，瓊脂糖膠回收，取10 μ 1直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，高效轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)中。獲得陽性克隆，即為本發(fā)明的靈芝漆酶基因，其序列如SEQ ID No 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。將該SEQ ID No 1序列與來自靈芝的漆酶基因相比對(duì)，同源性為75.對(duì)％，具體如下1 GCTGCTGTCGTCGTCAATGGTGTCTTCCCTGGTCCACTGATCACTGGCAACAAGGGAGAC
Il Il Il Il Il 111111111111111 Il Il mil Il IIIIIIIIII130 GCCGCCGTTGTGGTGAATGGTGTCTTCCCTGGGCCGCTCATCACAGGGAACAAGGGAGAC61 AGATTCCAGCTGAACGTCATCGACCAGCTGACCAACCACACCATGCTGAAGACCACCTCCι IIIIIIIII IIIIIIIII Illll Illlll 1111111111111190 CGTTTCCAGCTGAATGTCATCGACCAACTGACGAACCACACAATGCTGAAGACCACCAGC121 ATCCACTGGCATGGCTTCTTCCAGAAAGGTACTAACTGGGCTGATGGTCCTGCCTTCATCIl Il IIIIIIIII ΜΙΝΙ Il Il ΜΙΝΙ ΜΙΝΙ Il Mill250 ATTCATTGGCATGGCTTTTTCCAGAAGGGCACGAACTGGGCGGATGGTCCCGCGTTCATC181 AACCAGTGTCCAATCGCTTCTGGTCATTCCTTCCTGTACGACTTTCAAGTTCCAGATCAAIIIIIIIII Il III Il Il Il III III Il Il III III310 AACCAGTGTCCGATTGCTAGCGGGCACTCGTTCCTCTACGATTTCCAGGTTCCGGATCAG241 GCTGGCACCTTCTGGTATCACTCTCATCTGTCTACTCAGTACTGTGATGGTCTGAGAGGTIl III Il III IIIIII Il Il IIIIIIIII III Il Il370 GCCGGCACTTTTTGGTACCACAGCCATCTCTCCACGCAGTACTGTGACGGTCTCAGGGGT301 CCATTCGTTGTCTATGATCCTAAAGATCCTCTGAAGGGTCTGTACGATGTTGATAACGATΜΙΝΙ Il III III Il Il Il III ΜΙΝΙ Il Il III430 CCATTCGTGGTATATGACCCTAAGGACCCCCTCAAGGGACTGTACGACGTCGACAACGAC361 TCTACTGTTATCACTCTGTCTGACTGGTATCATGTTGCTGCCAGACTTGGACCTTCCTTCIl III III Il Il IIIIIIIII Il Illlll Illlll III490 TCGACTGTGATCACCCTCTCCGACTGGTATCACGTGGCTGCCAGGCTTGGACCGAGCTTC421 CCACTGGGTTCTGACTCCACTCTGATCAATGGTCTGGGTAGATCCACCACCAACGCTACTIl Il Il Il III III ΜΙΝΙ Il Il I III IIIIIIIII550 CCGCTCGGCTCGGACTCGACTCTCATCAATGGCCTTGGCCGTAGCACTACCAACGCTACC481 GCTGGTCTTGCTGTCATCAACGTCACCCAAGGCAAGAGATACAGATTCAGACTGGTCTCCIl Il Il III IIIIIIIII Il III I Il I III I Il Il Il610 GCCGGCCTCGCTGTTATCAACGTCACACAGGGCAAACGTTATCGCTTCCGCCTTGTGTCC541 CTGTCCTGTGATCCTAACTACACCTTCTCTATCGATGGTCATGACATGTCCGTCATCGAAIlll Il Il Il IIIIIIIIIIIII Il llllllllllll Il670 TTGTCATGCGACCCCAACTACACCTTCAGCATCGACGGCCATGACATGTCCGTTATTGAG601 GCTGATGGCATTGCTACTCAACCTGTCACTGCTAACGCTATCCAAATCTTCTCTGCTCAGIl III III Il III Il Il Il Illlll 111111111111111730 GCGGATGGTATTGCAACGCAACCCGTGACCGCGAACGCTATTCAAATCTTCTCTGCTCAA661 AGATACTCCTTCGTCCTGACTGCCAACCAGACCATTGGCAACTACTGGATCAGAGCCAATIlll Il III ΜΙΝΙ Il III IIIIIIIII III I III790 CGATATTCTTTCGTGCTGACTGCAAATCAGACAATTGGCAACTATTGGATTCGCGCCAAC721 CCTTCCTTCGGAAACATCGGTTTCACCAATGGCATCAACTCTGCCATCCTGAGATACTCTIl III III Il Illlll III 1111111111111111 I III850 CCGAGCTTTGGAAATATTGGTTTCACGAATGGAATCAACTCTGCCATCCTGCGCTACTCG781 GGAGCTGATCCTATCGAACCTACTACTGCTCAACAGACCACTCAGAACCTGCTGAACGAA
III III lllllllll Il Il III III Illlll Il Il910 GGAGCGGATCCCATCGAACCTACGACGGCCCAACAAACCACACAGAACCTCCTCAATGAG841 GTTGATCTGCATCCATTCGTTGCTAAGCAGACTCCTGGTAGAGCTACTCAAGGTGGTACTII II II II II II II III III III I III Il Illlll970 GTCGACCTCCACCCCTTTGTCGCTAAACAGACGCCTGGCCGCGCTACACAGGGTGGTACC901 GATGTTGCCATCAACATGGTCTTCAACTTCAATGGCTCCAACTTCTTCATCAACAACGCTMM lllllllllllllllllllll Il III llllllllllllllllll1030 GATGTGGCCATCAACATGGTCTTCAACTTTAACGGCTCGAACTTCTTCATCAACAACGCG961 TCCTTCACTCCACCAACTGTTCCTGTCCTGCTTCAGATTCTGTCTGGTGCACAAGCAGCTIlllll Il Il III Il III lllllllll Il Il III Il1090 TCCTTCACGCCTCCCACTGTCCCCGTCCTCCTTCAGATTTTGAGCGGCGCACAGGCCGCC1021 CAGGATCTGCTTCCATCTGGCTCTGTCTACACTCTTCCTATCAACAAGTCCATCGAACTCMM Il Il Il Il Il lllllllll Il Il 111111111111111 Il1150 CAGGACCTCCTGCCTTCCGGAAGTGTCTACACGCTGCCGATCAACAAGTCCATCGAGCTC1081 ACCTTTCCTGCTACTGTCAATGCTCCTGGTGCTCCACATCCATTCCACCTGCATGGTCACIII Il Il Il III Il Il Il III Il Il lllllllll III1210 ACCTTCCCCGCCACGGTCAACGCCCCCGGGGCTCCCCACCCCTTCCACCTGCACGGTCAT1141 TCCTTCGCTGTCGTCAGAAGTGCTGGTTCCACCGAGTACAACTACAACAACCCTGTCTGGIl Illlll III I Il Il Il III Il Illlll III Il Il Il1270 TCGTTCGCTGTGGTCCGCAGCGCCGGCTCCACAGAATACAACTATAACAATCCCGTATGG1201 AGAGACGTCGTCTCCACTGGTACTCATGTTCCACAGGCTTGGTCTGACCTGTGTCCTACCι ΜΙΝΙ Il Il Il Il I Il I II1330 CGCGACGTCGTTTCGACCGGCACCCCTGCAGCGGGCGACAACGTCACGATCCGCTTCCAG1261 TACGATGCTCTCTCTGCTGACGACCACTAAGAGCTCATCGACTTTCATCTCGAAGCTGGCIII ι ι ιIl ι ι ι lllllllll lllllll Il Il1390 ACCGACAACCCCGGACCGTGGTTCCTCCATTGCCACATCGACTTCCATCTCGAGGCGGGC1321 TTTGCTGTTGTCTTTGCTGAAGACACTGCTGACACTTCTCTTGCCAACCCTGCTGCTGGTIl III Il Il Il Il III III Illlll Il Illl1450 TTCGCTGTCGTGTTCGCCGAGGACACCGCTGATACTTCTCTGGCGAACCA. . . TGTCCCA1381 GATAACGTCACCATCAGATTCCAGACTGACAATCCTGGACCTTGGTTCCTGCATTGTCACIII Il III Il Il IIIl1507 CAAGCATGGTCGGATCTTTGCCCGACGTACGATGCGCTCTCGGCTGATGATCACTGA實(shí)施例2靈芝漆酶基因在畢赤酵母中表達(dá)將實(shí)施例1制得的漆酶基因直接與真核表達(dá)載體PYM7909相連，經(jīng)過DH5 α克隆過的環(huán)形質(zhì)粒單酶切使其線性化，取約1 μ 1的線性DNA與80 μ 1畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合后進(jìn)行點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化，然后涂布于固體SD山梨醇培養(yǎng)基O0g/L瓊脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，28°C繼續(xù)培養(yǎng)3天后獲得白色菌落。挑取多個(gè)經(jīng)測(cè)活呈陽性的畢赤酵母，分別接種于3ml液體BMGY培養(yǎng)基(10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5 μ 1生物素，甘油， SD)中，26°C搖床直到菌液的濃度達(dá)到OD6tltl為1.0時(shí)離心(12000rpm)收集菌體，再用液體BMMY培養(yǎng)基(SD)重懸畢赤酵母菌體，甲醇誘導(dǎo)3天，離心(12000rpm)分別收集上清測(cè)活，選取有活性的菌株活化。按上述方法進(jìn)行大量培養(yǎng)，使得靈芝漆酶大量表達(dá)。實(shí)施例3靈芝漆酶基因的純化將實(shí)施例2中得到的培養(yǎng)液在5，OOOg重力加速度下離心5min，收集含有酶液上清，進(jìn)行硫酸銨沉淀，所得到的蛋白沉淀用SD重懸，使用微孔濾膜過濾離心好的上清，上到 Ni-Agarose柱上，純化出目的蛋白，將目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起來。該目的蛋白即為純化后的靈芝漆酶基因。實(shí)施例4靈芝漆酶基因的酶動(dòng)力學(xué)特性分析靈芝漆酶基因的酶動(dòng)力學(xué)特性分析主要有2個(gè)底物。它們分別是愈瘡木酚和 ABTS,反應(yīng)采用實(shí)施例3中的體系。主要測(cè)定靈芝漆酶酶基因?qū)Σ煌孜锏腒m和最大反應(yīng)速度Vmax，也就是在溫度、pH及酶濃度恒定的條件下，底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的速度有很大的影響。在底物濃度很低時(shí)，酶促反應(yīng)的速度(ν)隨底物濃度的增加而迅速增加；隨著底物濃度的繼續(xù)增加，反應(yīng)速度的增加開始減慢；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥侥撤N程度時(shí)，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值(Vmax)。底物濃度與反應(yīng)速度的這種關(guān)系可用Michaelis-Menten方程式表示 [。178]
權(quán)利要求
1.一種靈芝漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈芝漆酶基因，其編碼的核苷酸序列如SEQID No2所示。
3.權(quán)利要求1所述的靈芝漆酶基因在真核生物中的表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的靈芝漆酶基因在真核生物中的表達(dá)，其特征在于，將所述靈芝漆酶基因與真核表達(dá)載體PYM 7909連接，轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌，進(jìn)行點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化。
5.權(quán)利要求3所述的靈芝漆酶基因在真核生物中的表達(dá)的應(yīng)用，其特征在于，挑取經(jīng)測(cè)活呈陽性的畢赤酵母進(jìn)行細(xì)胞外分泌表達(dá)純化，以制備純化的靈芝漆酶基因。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靈芝漆酶基因及其真核表達(dá)和純化方法。所述的靈芝漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。將該基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體中并轉(zhuǎn)化入真核生物中，可用于靈芝漆酶的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/53GK102533803SQ20101059850
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2010年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 孫靜, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院