專利名稱：一株短小芽孢桿菌及其在生產(chǎn)2,3-丁二醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株短小芽孢桿菌及其應(yīng)用，尤其涉及一株短小芽孢桿菌及其在發(fā)酵 生產(chǎn)2，3-丁二醇中的應(yīng)用；屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2，3_ 丁二醇廣泛應(yīng)用于化工、食品、燃料及航天航空等多個(gè)領(lǐng)域(Syu M J. ApplMicrobiol Biotechnol, 2001, 55 (1) :10_18)。因其熱值較高 07，200kJ/kg)，同乙 醇09，100kJ/kg)相當(dāng)，可用作燃料添加劑；可代替1，4_丁二醇，用于聚酯和聚亞氨酯的合 成；其脫水產(chǎn)物甲乙酮是一種低沸點(diǎn)溶劑，廣泛應(yīng)用于涂料、潤滑劑、燃料等行業(yè)，同時(shí)又可 作為有機(jī)合成香料、抗氧化劑等的中間體；其脫水產(chǎn)物1，3-丁二烯可用來合成橡膠單體， 是一種重要的石油化工基礎(chǔ)有機(jī)原料；同甲乙酮縮合加氫形成辛烷，可用于生產(chǎn)高級航空 用油；其高值衍生物3-羥基丁酮和丁二酮廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、香料等行業(yè)。
目前2，3_ 丁二醇的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)法主要以 石油裂解時(shí)產(chǎn)生的丁烯為原料，經(jīng)過Hao的氧化及NaOH的作用后，在高溫高壓下水解得 到幾種不同種類的丁二醇，再通過減壓分餾分離獲得。相比于化學(xué)法，微生物發(fā)酵法具有 可利用生物質(zhì)可再生資源、環(huán)境友好、工藝簡單等特點(diǎn)，符合低碳經(jīng)濟(jì)的發(fā)展策略。自然界 中具有2，3_ 丁二醇生產(chǎn)能力的細(xì)菌主要包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、芽孢桿菌屬 (Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)和腸桿菌屬(Enterobacter)等(Afschar A S, Vaz RossellC E, Jonas R, et al. J Biotechnol, 1993,27(3) :317-329) 目前，國內(nèi)外發(fā)酵生 產(chǎn)2，3_ 丁二醇的研究常用菌株多為克雷伯氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌，其潛在的致病性，限制了 在食品工業(yè)中的應(yīng)用。芽孢桿菌具有食品安全性，現(xiàn)有多粘芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產(chǎn) 2，3- 丁二醇的專利報(bào)道(中國專利200910026807. 1，201010167019. 7)，但其產(chǎn)物生產(chǎn)強(qiáng)度 較低。
經(jīng)檢索，目前未見有使用短小芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇的報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有2，3_ 丁二醇生產(chǎn)方法中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一株新分 離的短小芽孢桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇中的應(yīng)用，即通過分段溶解氧控制策略，以 短小芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇。
本發(fā)明短小芽孢桿菌定名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) SDM，該菌已于 2010年11月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，湖北省武漢市武昌珞珈 山)，其保藏號為CCTCC NO =M 2010307。
上述短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307菌株形態(tài)為棒桿 狀，菌落顏色為黃色或白色，產(chǎn)芽孢，VP反應(yīng)成陽性，長2. O 3. O μ m，直徑0. 6 0. 7 μ m， 能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，能水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可在45°C 條件下生長。
上述短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307菌株的 16SrDNA 序列如SEQ ID No. 1所示，序列長度為151!3bp，所述序列與其他短小芽孢桿菌的16S rDNA 序列有99% 100%的相似性。
上述小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307菌株可以在高糖 LB培養(yǎng)基中生長；其中所述高糖LB培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含150g葡萄糖，IOg蛋白 胨，5g酵母粉，10gNaCl，121°C條件下滅菌15min。固體高糖LB培養(yǎng)基是在上述配方的基礎(chǔ) 上加入20g/L的瓊脂粉。
本發(fā)明所述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇中的應(yīng)用，其中所述應(yīng)用涉及 的方法是
制備細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取固體高糖LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株 1 2 環(huán)，接種在裝有滅菌的 IOOmL 高 糖LB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，置于搖床上，在37°C條件下，以180士 IOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng) 對士池，得所述菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；其中所述高糖LB培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含 150g葡萄糖，IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl ；所述固體高糖LB培養(yǎng)基是在上述配方的基 礎(chǔ)上加入20g/L的瓊脂粉；
以葡萄糖培養(yǎng)基或蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇所述發(fā)酵罐發(fā)酵條件為將 上述制得的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以50mL/L的接種量接種在裝有滅菌的4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā) 酵罐中，發(fā)酵溫度為30 40°C ；發(fā)酵前期從開始至14 24h攪拌轉(zhuǎn)速控制為400 600rpm， 通氣量為0. 8 1. 2vvm ；發(fā)酵后期即從15 2 開始攪拌轉(zhuǎn)速控制為200 350rpm，通氣 量為0. 3 0. 7vvm,發(fā)酵40 60h后發(fā)酵結(jié)束，得含2，3- 丁二醇發(fā)酵液；
分離提純2，3-丁二醇收集含2，3-丁二醇發(fā)酵液，8，000 10，OOOrpm離心5 10分鐘，取上清液采用常規(guī)的萃取方法得天然的2，3_ 丁二醇產(chǎn)品；
其中上述葡萄糖培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含150g葡萄糖，5 15g玉米漿干 粉，3 8g 酵母粉，2 IOg K2HPO4,0. 05 0. 4g MgSO4 · 7H20,0. 05 0. 4g CaCl2,0. 5 2g乙酸鈉；上述蔗糖培養(yǎng)基配方為IL蒸餾水中含120g蔗糖，5 15g玉米漿干粉，3 8g 酵母粉，2 IOg K2HPO4,0. 05 0. 4g MgSO4 · 7Η20，0· 05 0. 4g CaCl2,0. 5 2g 乙酸鈉。 115°C條件下滅菌20min。
上述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇中的應(yīng)用中所述以葡萄糖培養(yǎng)基或 蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的發(fā)酵溫度優(yōu)選為37°C。
上述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇中的應(yīng)用中所述以葡萄糖培養(yǎng)基 發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇的發(fā)酵條件優(yōu)選為發(fā)酵前期24h攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為 1. Ovvm ；發(fā)酵后期24h攪拌轉(zhuǎn)速為230rpm，通氣量為0. 4vvm ；發(fā)酵4 后發(fā)酵結(jié)束。
上述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3_ 丁二醇中的應(yīng)用中所述以蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵 生產(chǎn)2，3- 丁二醇的發(fā)酵條件優(yōu)選為發(fā)酵前期20h攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通氣量為Ivvm ；發(fā) 酵后期2 攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為0. 5vvm ；發(fā)酵4 后發(fā)酵結(jié)束。
本發(fā)明提供的2，3- 丁 二醇生產(chǎn)菌株短小芽孢桿菌，即短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO =M 2010307菌株，能以可再生資源為碳源，通過溶解氧分 段控制策略，得到了較高的2，3- 丁二醇產(chǎn)量，2，3- 丁二醇的濃度達(dá)到70g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為 1. 46g/L. h。本發(fā)明提供的產(chǎn)2，3- 丁二醇菌株具有生物安全性，發(fā)酵生產(chǎn)的2，3- 丁二醇具4有廣泛的用途。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但不僅限于此。
一般性說明
葡萄糖的測定方法為發(fā)酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀SBA_40C(山東省 科學(xué)院生物研究所)測定。測定原理為利用固定化葡萄糖脫氫酶膜專一性測定葡萄糖含量。
蔗糖的測定方法為=Agilent 1100高效液相色譜儀，G1311A四元泵，示差折光分 析檢測器，進(jìn)樣量10 μ L。Agilent HPLC 2D色譜工作站。色譜柱為ZORBAX碳水化合物分 析柱(4. 6 X 150mm)，柱溫30 50°C，流動(dòng)相為乙腈水=80 20 (ν/ν)，流速1. 2mL/min。 以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。
2，3-丁二醇的測定方法為VARIAN CP-3380氣相色譜儀檢測。乙酸丁酯為萃取 劑，體積比1 1萃取，取上層有機(jī)相檢測。具體測定的條件是火焰離子監(jiān)測器(FID)溫 度為280°C，進(jìn)樣器溫度為220°C，而毛細(xì)管柱溫是從50°C升溫到180°C，升溫速度20°C / min，載氣為氮?dú)狻＠?，3_ 丁二醇標(biāo)準(zhǔn)品(德國Sigma-Aldrich公司，貨號361461)做 出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出發(fā)酵液中2，3-丁二醇的含量。
實(shí)施例1 耐高糖并且產(chǎn)2，3- 丁二醇菌株的篩選
從果園等地取得土樣，用高糖LB培養(yǎng)基浸泡Mh，在500mL錐形瓶中裝收集的浸泡 液IOOmL,在37°C條件下，置于搖床上以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48小時(shí)。將培養(yǎng)液以10_2、10_3 兩個(gè)稀釋度涂布在固體高糖LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，37°C培養(yǎng)Mh。挑單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，通 過VP反應(yīng)進(jìn)行初篩。根據(jù)反應(yīng)時(shí)間和顏色變化篩選出陽性菌株。篩選原理是2，3-丁二醇 在堿性條件下氧化為雙乙酰，與肌酸或胍類衍生物合成紅色物質(zhì)，加入α -萘酚、肌酸可以 促進(jìn)反應(yīng)。然后測定初篩的陽性細(xì)菌的2，3-丁二醇產(chǎn)量，得到耐高糖并且產(chǎn)2，3-丁二醇 的菌株，用于下一步離子束誘變。
實(shí)施例2 離子束誘變
挑取固體高糖LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的由實(shí)施例1得到的耐高糖并且產(chǎn)2，3- 丁二醇 的菌株，接種在裝有滅菌的IOOmL高糖LB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，在37°C條件下，置于搖 床上以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)Mh，即制得耐高糖并且產(chǎn)2，3- 丁二醇菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。
將制得的上述細(xì)胞液體培養(yǎng)物離心，去上清，用生理鹽水洗滌后懸浮，制成菌懸 液。吸取100 μ L涂布于裝有固體高糖LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，無菌風(fēng)吹干制成菌膜后進(jìn) 行離子注入，離子能量為30keV，注入劑量分別為0, 5X 1014ions/cm2, 20X 1014ions/cm2, 100X1014ions/cm2。離子注入后的培養(yǎng)皿用ImL生理鹽水洗脫。各不同注入劑量分別吸取 100 μ L，稀釋1000倍，分別涂布于裝有高糖LB培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在37°C條件下，靜置培養(yǎng) 36h，挑出單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)，檢測2，3- 丁二醇產(chǎn)量，挑選其中最高產(chǎn)量的菌株。其中得到的 產(chǎn)量最高的菌株為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) SDM。
上述發(fā)明菌株形態(tài)為為棒桿狀，菌落顏色為黃色或白色，產(chǎn)芽孢，VP反應(yīng)成陽性， 長2. 0 3. 0 μ m，直徑0. 6 0. 7 μ m，能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、果糖產(chǎn)酸，能 水解酪蛋白、明膠、吐溫80，可在45°C條件下生長。其16S rDNA序列與其他短小芽孢桿菌的16S rDNA序列(序列表中的序列1)有99% 100%的相似性。
本發(fā)明菌株定名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus) SDM，該菌已于2010年11月 22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC，湖北省武漢市武昌珞珈山)，其保藏號 為CCTCC NO :M 2010307。
實(shí)施例3 制備短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株 的細(xì)胞液體培養(yǎng)物
挑取固體高糖LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的短小芽孢桿菌(Baci 1 luspumi lus) SDM CCTCCNO :M 2010307菌株一環(huán)，接種在裝有滅菌的IOOmL高糖LB培養(yǎng)基的500mL錐 形瓶中，置于搖床上，在37 °C條件下，以ISOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)Mh，得短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物。
實(shí)施例4 利用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株 以葡萄糖為碳源，在5L發(fā)酵罐中生產(chǎn)2，3- 丁二醇
將通過實(shí)施例3的方法獲得的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO: M2010307菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以50mL/L的接種量接種在裝有滅菌的4L發(fā)酵培養(yǎng)基的 5L發(fā)酵罐中，在37°C條件下，發(fā)酵前期24h攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，通氣量為1. Ovvm ；發(fā)酵后期 24h攪拌轉(zhuǎn)速為230rpm，通氣量為0. 4vvm。第48h 2，3- 丁二醇的濃度達(dá)到70. Og/L。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為IL蒸餾水中含150g葡萄糖，7g玉米漿干粉，8g酵母粉， 5g K2HPO4,0. 3g MgSO4 · 7Η20，0· 3g CaCl2, Ig 乙酸鈉，115°C條件下滅菌 20min。
實(shí)施例5 利用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株 以葡萄糖為碳源，在5L發(fā)酵罐中生產(chǎn)2，3- 丁二醇
將通過實(shí)施例3的方法獲得的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO: M2010307菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以50mL/L的接種量接種在裝有滅菌的4L發(fā)酵培養(yǎng)基的 5L發(fā)酵罐中，在40°C條件下，發(fā)酵前期14h攪拌轉(zhuǎn)速為600rpm，通氣量為1. Ovvm ；發(fā)酵后期 28h攪拌轉(zhuǎn)速為350rpm，通氣量為0. 7vvm。第42h 2，3- 丁二醇的濃度達(dá)到50. 6g/L。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為IL蒸餾水中含150g葡萄糖，7g玉米漿干粉，8g酵母粉， 5g K2HPO4,0. 3g MgSO4 · 7Η20，0· 3g CaCl2, Ig 乙酸鈉，115°C條件下滅菌 20min。
實(shí)施例6 利用短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株 以蔗糖為碳源，在5L發(fā)酵罐中生產(chǎn)2，3- 丁二醇
將通過實(shí)施例3的方法獲得的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM CCTCC N0: M2010307菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以50mL/L的接種量接種在裝有滅菌的4L發(fā)酵培養(yǎng)基的 5L發(fā)酵罐中，在37°C條件下，發(fā)酵前期20h攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通氣量為Ivvm ；發(fā)酵后期 28h攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為0. 5vvm。第48h 2，3- 丁二醇的濃度達(dá)到65. 0g/L。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含120g蔗糖，15g玉米漿干粉，5g酵母粉，8g K2HPO4,0. 4g MgSO4 · 7Η20，0· 4g CaCl2, 2g 乙酸鈉，115°C條件下滅菌 20min。權(quán)利要求
1.一株產(chǎn)2，3_ 丁二醇的短小芽孢桿菌，其特征在于，所述短小芽孢桿菌定名為短小芽 孢桿菌(BaCilluSpumiluS)SDM，該菌已于2010年11月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心，其保藏號為CCTCC NO =M 2010307。
2.權(quán)利要求1所述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于所述 應(yīng)用涉及的方法是制備細(xì)胞液體培養(yǎng)物挑取固體高糖LB培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)的短小芽孢桿菌 (Bacilluspumilus)SDM CCTCC NO :M 2010307 菌株 1 2 環(huán)，接種在裝有滅菌的 IOOmL 高 糖LB培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，置于搖床上，在37°C條件下，以180士 IOrpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng) 對士池，得所述菌株的細(xì)胞液體培養(yǎng)物；其中所述高糖LB培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含 150g葡萄糖，IOg蛋白胨，5g酵母粉，IOg NaCl ；所述固體高糖LB培養(yǎng)基是在上述配方的基 礎(chǔ)上加入20g/L的瓊脂粉；以葡萄糖培養(yǎng)基或蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇所述發(fā)酵罐發(fā)酵條件為將上述 制得的細(xì)胞液體培養(yǎng)物以50mL/L的接種量接種在裝有滅菌的4L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐 中，發(fā)酵溫度為30 40°C ；發(fā)酵前期從開始至14 24h攪拌轉(zhuǎn)速控制為400 600rpm，通 氣量為0. 8 1. 2vvm ；發(fā)酵后期即從15 2 開始攪拌轉(zhuǎn)速控制為200 350rpm，通氣量 為0. 3 0. 7vvm,發(fā)酵40 60h后發(fā)酵結(jié)束，得含2，3- 丁二醇發(fā)酵液；分離提純2，3-丁二醇收集含2，3-丁二醇發(fā)酵液，8，000 10，OOOrpm離心5 10分 鐘，取上清液采用常規(guī)的萃取方法得天然的2，3- 丁二醇產(chǎn)品；其中上述葡萄糖培養(yǎng)基配方為1L蒸餾水中含150g葡萄糖，5 15g玉米漿干粉， 3 8g 酵母粉，2 IOg K2HPO4,0. 05 0. 4g MgSO4 ·7Η20，0· 05 0. 4g CaCl2,0. 5 2g 乙 酸鈉；上述蔗糖培養(yǎng)基配方為IL蒸餾水中含120g蔗糖，5 15g玉米漿干粉，3 8g酵母 粉，2 IOg K2HPO4,0. 05 0. 4g MgSO4 · 7Η20，0· 05 0. 4g CaCl2,0. 5 2g 乙酸鈉。
3.如權(quán)利要求2所述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于所 述以葡萄糖培養(yǎng)基或蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的發(fā)酵溫度為37°C。
4.如權(quán)利要求2所述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于所 述以葡萄糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的發(fā)酵條件為發(fā)酵前期24h攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm， 通氣量為1. Ovvm ；發(fā)酵后期24h攪拌轉(zhuǎn)速為230rpm，通氣量為0. 4vvm ；發(fā)酵4 后發(fā)酵結(jié) 束ο
5.如權(quán)利要求2所述短小芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇中的應(yīng)用，其特征在于所 述以蔗糖培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇的發(fā)酵條件為發(fā)酵前期20h攪拌轉(zhuǎn)速為500rpm，通 氣量為Ivvm ；發(fā)酵后期2 攪拌轉(zhuǎn)速為200rpm，通氣量為0. 5vvm ；發(fā)酵4 后發(fā)酵結(jié)束。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)2，3-丁二醇的短小芽孢桿菌，其中所述短小芽孢桿菌定名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)SDM，該菌已于2010年11月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NOM 2010307。本發(fā)明所述菌株能以可再生資源為碳源，通過溶解氧分段控制策略，得到2，3-丁二醇的濃度達(dá)到70g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.46g/L.h。且所述菌株具有生物安全性，發(fā)酵生產(chǎn)的2，3-丁二醇具有廣泛的用途。
文檔編號C12P7/18GK102041240SQ201010566909
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者李理想, 王鈺, 許平, 馬翠卿 申請人:山東大學(xué)