專利名稱：一種脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，具體地說，是涉及一種采用熒光激活流 式細(xì)胞分類和磁激活細(xì)胞分選相結(jié)合分離培養(yǎng)高純度脂肪干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived Stem Cells, ASCs)，是目前廣泛應(yīng)用于組 織工程及再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的一種成體干細(xì)胞(Cowan CM,. Nat Biotechnol, 2004. 22:560-567)。脂肪干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能，在特定條件下可 以向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、成內(nèi)皮細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞等多個(gè)方向分 化。除此之外，脂肪干細(xì)胞還具有許多其他類型成體干細(xì)胞所不具備的優(yōu)勢(shì)，如脂肪組織來 源充足、取材方便、獲取過程損傷輕微、無倫理學(xué)爭(zhēng)議，平均每100 mL的脂肪組織中可獲得 約1 X IO6個(gè)干細(xì)胞，脂肪組織來源的細(xì)胞約有2%具有干細(xì)胞特征，遠(yuǎn)高于骨髓間充質(zhì)干細(xì) 胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)(約 0. 02% 的細(xì)胞具有干細(xì)胞特征)。 并且脂肪干細(xì)胞具有穩(wěn)定的群體倍增率、自我更新潛能及良好的免疫相容性(Strem BM,. Trends Biotechnol, 2005. 24:1246-1253 )，其基因轉(zhuǎn)染效率高、能穩(wěn)定表達(dá)外源基因，已 廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的研究(Gimble JM，. Circ Res, 2007: 1249-1260)。而且ASCs分化 為脂肪細(xì)胞的效率比BMSCs更高。因此，脂肪干細(xì)胞是組織工程研究理想的種子細(xì)胞之一， 最有希望成為脂肪組織工程的種子細(xì)胞。目前常用的脂肪干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法是從脂肪組織分離獲取細(xì)胞，經(jīng)機(jī)械或酶處 理方法分離除去紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞后，采用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)。含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基雖可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖，但難以維持其未分化狀態(tài)，使得繼代培養(yǎng) 的脂肪干細(xì)胞容易老化。機(jī)械或酶處理方法僅能除去紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞，除紅后的這部分 細(xì)胞實(shí)質(zhì)為間質(zhì)血管片段細(xì)胞(stromal-vascular fraction，SVF細(xì)胞)，這部分細(xì)胞中仍 含有大量成熟細(xì)胞，因而，現(xiàn)有獲得的脂肪干細(xì)胞純度不高，由于細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞之間的 信號(hào)交通有關(guān)，純度不高的干細(xì)胞更易老化，往往在體外經(jīng)5-6次傳代培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞后， 脂肪干細(xì)胞就出現(xiàn)老化。干細(xì)胞老化(或稱衰老)，是指干細(xì)胞增殖能力下降，多向分化潛能 (或稱干性)降低或消失。老化意味著干細(xì)胞數(shù)量的減少和功能的減退，也可以說是無法再 生。脂肪干細(xì)胞的老化限制了其在脂肪組織工程及其他組織工程中應(yīng)用的深入研究。目前分離純化干細(xì)胞的方法有流式細(xì)胞分選法、免疫磁珠分選法等，例如In’ t Anker等運(yùn)用流式細(xì)胞分選法從羊水中獲得胎兒間充質(zhì)干細(xì)胞，Coppi等運(yùn)用免疫磁珠方 法從羊水細(xì)胞中分離出AFS細(xì)胞(amniotic fluid stem cells，AFS)。但是這些對(duì)干細(xì)胞的 體外分離技術(shù)大多是建立在對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記識(shí)別的基礎(chǔ)之上的，如Coppi等分離出的AFS 細(xì)胞是c-Kit或CD117 (干細(xì)胞因子受體)表達(dá)陽性的細(xì)胞，而各種成體干細(xì)胞有各自獨(dú)特 的標(biāo)記物。Rodeheffer MS 等用細(xì)胞流式分選(Fluorescent-activated cell sorting, FACS)從脂肪組織中分離到LinTD29+⑶34+Sca-l+⑶24+細(xì)胞群，但這群細(xì)胞只能向脂肪細(xì) 胞分化，而且所得數(shù)量較低(0.08%士0.015))。到目前為止，脂肪干細(xì)胞的特異性標(biāo)記還沒有找到，還沒有發(fā)現(xiàn)脂肪基質(zhì)細(xì)胞(Adipose-derived stromal cells, ADSCs)里具有干性 的細(xì)胞群，國(guó)內(nèi)外的研究都不能獲得高純度的脂肪干細(xì)胞(高純度脂肪干細(xì)胞指的是細(xì)胞 表面抗原標(biāo)志相同、具有均一性、自我更新和多向分化能力一致的一群脂肪組織來源的干 細(xì)胞)。現(xiàn)有分離的脂肪干細(xì)胞純度不高、脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng)難以維持自我更新和多向 分化潛能的問題，極大地限制了國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果之間的對(duì)比和重復(fù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中體外培養(yǎng)條件下脂肪干細(xì)胞難以維持自我更 新和多向分化潛能的不足，提供一種脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法及其有效的新培養(yǎng)基。經(jīng) 按照該方法分離培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，經(jīng)10多代繼代培養(yǎng)后脂肪干細(xì)胞仍可維持其自我更新 和多向分化的潛能。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)方案為
一種脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括從脂肪組織中分離獲取、培養(yǎng)SVF細(xì)胞，還包括 用免疫磁珠分選法除去SVF細(xì)胞中的Lin+細(xì)胞，獲得LirT細(xì)胞群；用流式細(xì)胞分選法從獲 得的LirT細(xì)胞群中富集CD271+SCa-r細(xì)胞，得到脂肪干細(xì)胞；將獲得的脂肪干細(xì)胞用含有 LIF、FGF2的培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，免疫磁珠分選法中所采用的標(biāo)記物為CD5、 CD45R、CDllb、Anti-Gr-I 及 Ter-119。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，流式細(xì)胞分選法中使用的標(biāo)記物為L(zhǎng)in、 CD271 和 Sca-I。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)獲得的脂肪干細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是含有 LIF、FGF2 的 α -MEM 培養(yǎng)基。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)獲得的脂肪干細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是含有 10% 體積比胎牛血清、103-105 U/mL LIF、10-100 ng/ mL FGF2 的 α-MEM 培養(yǎng)基。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)獲得的脂肪干細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是含有 10% 胎牛血清、103U/mL LIF,20 ng/mL FGF2 的 α-MEM 培養(yǎng)基。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，還包括對(duì)獲得的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，所述的傳代培養(yǎng)是貼壁培養(yǎng)。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，當(dāng)獲得的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的生長(zhǎng)密 度達(dá)70-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。較好的，上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，當(dāng)獲得的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部 的生長(zhǎng)密度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，從脂肪組織中分離獲取SVF細(xì)胞的過程為 在常規(guī)無菌條件下切取小鼠腹股溝脂肪墊，經(jīng)漂洗、剪碎、除血液等處理后，在脂肪組織中 加入與脂肪等體積的0. 1% I型膠原酶，經(jīng)過消化、過濾、裂紅、離心后所獲得的細(xì)胞即為 SVF細(xì)胞。上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，SVF細(xì)胞的培養(yǎng)采用含10%體積比胎牛血清 的α-MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、5% (v/v) CO2。
如前所述任意一項(xiàng)的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法所分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，用于 純化或克隆干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞系的生產(chǎn)或者用于生產(chǎn)成脂/成骨細(xì)胞。如前所述脂肪干細(xì)胞用于生產(chǎn)成脂/成骨細(xì)胞的方法為
(1)、熒光激活流式細(xì)胞分類和磁激活細(xì)胞分選相結(jié)合分離獲取ASCs；
(2)、將ASCs分別復(fù)合纖維蛋白和BCP支架材料，接種于裸鼠背部或小鼠股骨缺損處。6-12周后，取出移植物進(jìn)行HE切片染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)等。現(xiàn)有技術(shù)中脂肪干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)容易出現(xiàn)老化，針對(duì)這一問題，發(fā)明人進(jìn)行了 廣泛的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，將從脂肪組織中分離獲取的SVF細(xì)胞用免疫磁珠分選法和流式細(xì) 胞分選法相結(jié)合，可以盡可能地除去SVF細(xì)胞中的成熟細(xì)胞，由此可以獲得抗原標(biāo)志相同、 具有均一性、自我更新和多向分化能力一致的高純度脂肪干細(xì)胞。發(fā)明人比較了在培養(yǎng)基 中加入抑制干細(xì)胞分化的因子LIF和促進(jìn)干細(xì)胞增殖的因子FGF2和常規(guī)培養(yǎng)條件下的克 隆形成能力、多向分化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入抑制細(xì)胞分化的因子LIF和促進(jìn)干 細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子FGF2可維持獲得的高純度干細(xì)胞的干性。因此，本發(fā)明從脂肪組織中分離獲取、培養(yǎng)SVF細(xì)胞脂肪，再?gòu)腟VF細(xì)胞中采用 MACS法去掉⑶5+、⑶45R+、⑶Ilb+和Tefl 19+這些造血和成熟細(xì)胞，富集LirT細(xì)胞；然后采 用FACS從LirT細(xì)胞群中分選CD271、Sca-l表達(dá)陽性的細(xì)胞，富集CD271+Sca-r細(xì)胞(S口脂 肪干細(xì)胞ASCs)；獲得脂肪干細(xì)胞后，通過在培養(yǎng)基中加入抑制細(xì)胞分化的因子LIF和促進(jìn) 干細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子FGF2來維持干細(xì)胞的干性。本發(fā)明比較了在培養(yǎng)基中加入抑制干 細(xì)胞分化的因子LIF和促進(jìn)干細(xì)胞增殖的因子FGF2和常規(guī)培養(yǎng)條件下的克隆形成能力、多 向分化能力，證明了在培養(yǎng)基中加入LIF和FGF2，有助于維持脂肪干細(xì)胞的干性。本發(fā)明測(cè) 定了 ASCs的培養(yǎng)和克隆形成能力，并從形態(tài)學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)、mRNA和蛋白水平等方面證 實(shí)所獲得的ASCs在體內(nèi)和體外都具有多向分化潛能等功能。本發(fā)明采用FACS和MACS相結(jié)合，可以高效快速的獲得高純度的脂肪干細(xì)胞，與現(xiàn) 有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果
1、本發(fā)明采用熒光激活流式細(xì)胞分類(FACS)和磁激活細(xì)胞分選(MACS)相結(jié)合的方法 在國(guó)內(nèi)外首次運(yùn)用LirT:⑶271+:Sca-r富集到高純度的脂肪干細(xì)胞亞群，這群細(xì)胞具有較 強(qiáng)的克隆形成能力、自我更新能力和多向分化潛能，而另外的細(xì)胞不具備有這種能力。2、本發(fā)明運(yùn)用含有LIF和FGF2的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，P16代脂肪干細(xì)胞仍有較 強(qiáng)的成脂能力，P16代脂肪干細(xì)胞仍具有成骨的能力。3、本發(fā)明運(yùn)用纖維蛋白和雙相磷酸鈣陶瓷(BCP)作為脂肪干細(xì)胞的載體，采用綠 色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的ASCs作為示蹤，證明了 ASCs在體內(nèi)成脂/成骨微環(huán)境中能轉(zhuǎn)化 為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。4、本發(fā)明找到了一種可行、高效獲得脂肪干細(xì)胞的方法，為在體外獲取大量的具 有干性的種子細(xì)胞運(yùn)用于組織再生提供了新的方法。


圖1為經(jīng)過MACS獲得的LirT細(xì)胞群，然后用⑶271和Sca-I兩個(gè)抗體共染后流 式細(xì)胞分選，得到LirT:⑶271+: Sca-Γ細(xì)胞群(即脂肪干細(xì)胞)。圖2為采用有限稀釋法對(duì)ASCs進(jìn)行克隆培養(yǎng)其中A為L(zhǎng)in_:CD271+:SCa-r細(xì)胞群形成了克隆(第3天)，Scale bars= 100 μ m ； B為L(zhǎng)in_:CD271+: Sca-Γ細(xì)胞群形成的克 隆(第 5 天)，Scale bars= IOOym0圖3 A、B為脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的光鏡圖，細(xì)胞為成纖維樣梭形，可見典型漩渦狀 生長(zhǎng)，其中 A 圖的 Scale bars= 40 μ m，B 圖的 Scale bars=100 μ m。圖4為ASCs體外多向分化圖，其中A 成脂誘導(dǎo)后，油紅0將脂質(zhì)染為橙紅色， Scale bars= 200 μ m ;B 成骨誘導(dǎo)分化后，茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié)為片狀的紅染，Scale bars= 100 μ m;C:成軟骨誘導(dǎo)分化后，甲苯胺藍(lán)染色顯示軟骨基質(zhì)為藍(lán)色，有軟骨陷窩形 成，Scale bars= 400 μ m ;D 成肌誘導(dǎo)分化后，α -SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性，DAPI將細(xì) 胞核染為藍(lán)色，Scale bars= 400 μ m。圖 5 為 RT-PCR 檢測(cè) ASCs 在成脂(PPAR γ 2、C/EBP- α、LPL )、成骨(Runx2、Ορη )、 成軟骨(Acan、S0X9)和成肌(Myog、Myodl)誘導(dǎo)后，相關(guān)基因的表達(dá)情況，內(nèi)參為GAPDH。結(jié) 果顯示，在經(jīng)過多向誘導(dǎo)后，PPARy 2,C/EBP-a、LPL、Acan、Sox9、Myog、Myodl基因的表達(dá) 水平升高，從mRNA水平充分說明了我們培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞能夠向脂肪、骨、軟骨、肌細(xì)胞方 向分化。圖6 FGF2和LIF對(duì)ASCs增殖能力的影響。加入FGF2和LIF的培養(yǎng)基維持了 ASCs 的快速增殖能力、穩(wěn)定了細(xì)胞群體倍增時(shí)間；在無FGF2、LIF培養(yǎng)基的contorl組中，隨著傳 代次數(shù)增多，細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)。圖7為FGF2和LIF對(duì)ASCs的CFU-F形成能力的影響。FGF2和LIF培養(yǎng)基組 CFU-F形成能力無明顯下降；而無FGF2、LIF培養(yǎng)基的contorl組中CFU-F形成明顯減少。圖8為FGF2和LIF對(duì)維持ASCs成脂分化潛能的影響。A為FGF2和LIF培養(yǎng)基 中的P16代ASCs成脂誘導(dǎo)10天后油紅0染色結(jié)果，B為無FGF2和LIF培養(yǎng)的P16代ASCs 成脂誘導(dǎo)10天后油紅0染色結(jié)果，ASCs成脂能力明顯降低，Scale bars= 200 μ m。圖9甘油-3-磷酸脫氫酶活性定量測(cè)定。從P6代開始，有FGF2、LIF和無FGF2、LIF 培養(yǎng)的ASCs兩組間成脂誘導(dǎo)后甘油-3-磷酸脫氫酶活性出現(xiàn)明顯差別，數(shù)據(jù)以mean士SE 表示(n=3)，(P < 0. 01)。圖10 A 有FGF2和LIF的培養(yǎng)條件下，P16代ASCs成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色可見礦 化結(jié)節(jié)形成；B 無FGF2和LIF的培養(yǎng)條件下，P16代ASCs成骨誘導(dǎo)后未見礦化結(jié)節(jié)形成。 Scale bars= IOOum0圖11 C57小鼠的GFP脂肪干細(xì)胞為成纖維細(xì)胞樣的梭形，胞內(nèi)無脂滴，均有綠色 熒光蛋白表達(dá)。圖IlA為普通光學(xué)顯微鏡的圖像，圖IlB為倒置熒光顯微鏡觀察到的圖像。 Scale bars= 40 μ m。圖12細(xì)胞-纖維蛋白復(fù)合物植入體內(nèi)6w后的成脂情況。A:HE染色顯示，呈圓 形或多邊形，胞質(zhì)內(nèi)含有空泡，空泡為制作切片過程中被溶去脂滴的部位，胞核被脂滴擠向 一側(cè)、呈扁圓形，Scale bars=200 μ m0 B 油紅0染色顯示，脂滴為橘紅色，細(xì)胞核被擠到 一邊、呈藍(lán)色，Scale bars=200 μ m0 C 新生的脂肪細(xì)胞抗GFP免疫組織化學(xué)陽性，Scale bars=100μ m。圖13細(xì)胞-BCP支架材料復(fù)合物植入體內(nèi)后的成骨情況。A、B為HE和Masson染 色，新骨主要在BCP支架材料的孔隙中形成，呈骨島樣分布，新骨周邊是成骨細(xì)胞，HE染色 可見淡粉紅色的骨小梁及正在礦化的膠原纖維，可見到骨陷窩的形成；Masson染色可見新形成的骨小梁和正在礦化的膠原纖維為藍(lán)色。Scale bars=200 μ m0 C為新骨抗GFP免疫組 織化學(xué)檢測(cè)，其中淺棕色者為陽性細(xì)胞，可見成骨細(xì)胞抗GFP陽性(紅色箭頭所示)。Scale bars=200μ m。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解 為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本 發(fā)明的范圍。本發(fā)明實(shí)施例中所提到的脂肪組織來源于小鼠，本發(fā)明實(shí)施例中所用主要材料、 試劑與設(shè)備如下
C57小鼠(由四)I丨大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)；
綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因C57小鼠(生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室干細(xì)胞生物學(xué)研究室惠贈(zèng))； 裸小鼠(購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)； 纖維蛋白膠支架(杭州普濟(jì)，中國(guó))；
多孔雙相磷酸鈣陶瓷(BCP)支架材料(由四川大學(xué)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)材料工程技術(shù)研究中 心提供)。α-MEM 培養(yǎng)基(Hyclone，美國(guó))； 胎牛血清(Hyclone，美國(guó))；
胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA )(Gibco，美國(guó))；
FGF2 (Peprotech Inc，美國(guó))；
LIF、Anti-GFP 抗體(Millipore，美國(guó))；
I型膠原酶(COLLAGENASE TYPE I)，二甲基亞砜(DMSO)，地塞米松(Dex)，L-抗壞血酸 (L-ascorbic acid), 1, 25—二羥維生素 D3 (1，25-(OH) 2VitD3)，3-異丁基-1-甲基黃嘌 呤(IBMX)，吲哚美辛，油紅0，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； RNA抽提試劑盒(上海華舜，中國(guó))；
TaKaRa one step RNA PCR Kit (AMV)、DL2000 均購(gòu)自日本 TaKaRa 公司。恒溫水浴箱(Heto-Hoten，丹麥)；微量移液器(Gi 1 son公司，法國(guó))；培養(yǎng)瓶 (Corning，美國(guó))，電子天平(Strtorius，美國(guó))，0. 22pm無菌針頭式過濾器(Millipor， 美國(guó))，超純水機(jī)UNIQUE-R30 (Millipore，美國(guó))；C02培養(yǎng)箱(Thermo，德國(guó)，臺(tái)式離心機(jī) S0RVALLR LEGEND RM(Thermo，德國(guó))，溫控臺(tái)式離心機(jī) S0RVALLR LEGEND T(Thermo，德國(guó))， Thermo KS12 超凈工作臺(tái)(Thermo，德國(guó))，Thermo -86°C HERA freeze, (Thermo，德國(guó))； OLYMPUS 1X71倒置相差熒光顯微鏡(Olympus，日本)，OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡(Olympus， 日本)，OLYMPUS CX41正置顯微鏡(Olympus，日本)，_152°C超低溫冰箱(SANYO，日本)，掃描 電子顯微鏡(JSM-5900LV)(日本電子株式會(huì)社)；Tanon-2500凝膠成像儀(上海天能，中國(guó)); PCR 儀(BI0-RAD，美國(guó))，凝膠成象分析軟件 Quantity One 4. 6. 2 (BI0-RAD，美國(guó))。本發(fā)明列舉的實(shí)施例中所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括從小鼠脂肪組織 中分離獲取、培養(yǎng)SVF細(xì)胞，還包括用免疫磁珠分選法除去SVF細(xì)胞中的Lin+細(xì)胞，獲得 LirT細(xì)胞群；用流式細(xì)胞分選法從獲得的LirT細(xì)胞群中富集CD271+SCa-r細(xì)胞，得到脂肪 干細(xì)胞；將獲得的脂肪干細(xì)胞用含有LIF、FGF2的培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代培養(yǎng)。
上述脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法中，從小鼠脂肪組織中分離獲取、培養(yǎng)SVF細(xì)胞 包括，在常規(guī)無菌條件下切取小鼠腹股溝脂肪墊，經(jīng)漂洗、剪碎、除血液處理后，在脂肪組織 中加入與脂肪等體積的0. 1% I型膠原酶，經(jīng)過消化、過濾、裂紅、離心后所獲得的細(xì)胞即為 SVF細(xì)胞。SVF細(xì)胞的培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的α -MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C、5% (ν/ ν) CO20免疫磁珠分選法中所采用的標(biāo)記物為CD5、CD45R、CDllb、Anti-Gr-I及Ter-119。 流式細(xì)胞分選法中使用的標(biāo)記物為L(zhǎng)in、⑶271和Sca-I。培養(yǎng)獲得的脂肪干細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是含有10%體積比胎牛血清、IO3 U/mLLIF、 20ng/mLFGF2 的 α -MEM 培養(yǎng)基。進(jìn)行貼壁傳代培養(yǎng)，當(dāng)獲得的脂肪干細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的生長(zhǎng)密度達(dá)80%時(shí)，進(jìn) 行傳代培養(yǎng)，并將P16的脂肪干細(xì)胞，用于生產(chǎn)成脂/成骨細(xì)胞。1、間質(zhì)血管片段(SVF)細(xì)胞的獲取及培養(yǎng)
1)取4周齡雌性C57小鼠，以戊巴比妥鈉0.lmg/100g腹腔注射麻醉，麻醉顯效后于無 菌條件下取大鼠腹股溝脂肪墊，用無菌PBS溶液清洗組織塊；
2)在超凈工作臺(tái)中將脂肪組織塊剪碎，用等體積0.1% I型膠原酶于37°C恒溫?fù)u床上 消化45-60 min，期間適當(dāng)振蕩以充分消化；
3)加入含10%體積比胎牛血清的培養(yǎng)基中和I型膠原酶，以70μ m的細(xì)胞篩濾去未 消化完全的較大組織塊和消化余下的殘?jiān)?，低速離心(1200g，5 min)，離心管底部即為細(xì)胞 團(tuán)；
4)吸除表面漂浮的脂肪組織及成熟脂肪細(xì)胞，細(xì)胞團(tuán)用新鮮配制的紅細(xì)胞裂解液重懸 并靜置 10 min，離心(300g，5 min)；
5)收集離心管底部的細(xì)胞團(tuán)(間質(zhì)血管片段細(xì)胞，SVF細(xì)胞)，培養(yǎng)基洗滌3次，按 1 X 105/mL的細(xì)胞密度接種于直徑IOcm的培養(yǎng)皿中，在飽和濕度、37°C、5%C02的孵箱中進(jìn) 行培養(yǎng)，每3天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為含lOOu/mL青霉素和ΙΟΟμ g/mL鏈霉素的10%體積比 FBS+ α -MEM 培養(yǎng)基；
6)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底單層生長(zhǎng)達(dá)到約80%融合時(shí)，傳代培養(yǎng)。2、從SVF細(xì)胞中富集脂肪干細(xì)胞
2. 1 獲取 SVF，選用 Lineage Cell Depletion Kit 陰選 LirT 細(xì)胞
1)將得到的SVF細(xì)胞計(jì)數(shù)，PBS溶液洗，離心(300 X g，10 min)，完全吸除上清。2) 40 μ L緩沖液重懸IO7個(gè)細(xì)胞。3)加 10 μ L Biotin-Antibody Cocktail 于 IO7 細(xì)胞中。4)充分混勻，4°C孵育10 min。5)力口 30 μ L緩沖液于IO7細(xì)胞中。6)力口 20 μ L Anti-Biotin Microbeads。7)充分混勻后4°C孵育15 min。8)1-2 mL緩沖液洗細(xì)胞，離心(300 X g，10 min)，吸除上清。9)重懸細(xì)胞在500 μ L緩沖液中。10)將磁柱放于磁架的合適位置，500 μ L緩沖液洗柱子一次。
11)將500 μ L細(xì)胞懸液加于磁柱中，收集流出的液體，里面所含為L(zhǎng)irT細(xì)胞 12) 500 μ L緩沖液洗磁柱3次，收集的流出液與上一步收集的流出液混在一起。13)移下磁柱，置于新的收集管上方，加1 mL緩沖液于磁柱中，迅速推出磁性標(biāo)記 的細(xì)胞。此部所得細(xì)胞為L(zhǎng)in+細(xì)胞(CD5、CD45R、CDllb、Anti-Gr-I或Ter-119陽性)。2. 2 FACS 從 Lin_ 細(xì)胞群中富集 CD271+Sca-1+ 細(xì)胞
1)將上一步驟收集的LirT細(xì)胞記數(shù)，置于1.5mL EP管中。2)PBS液洗一次，用不含血清的α -MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。3)加入purified的CD271一抗(兔抗小鼠)，避光孵育30 min。4)PBS液洗，用不含血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入熒光二抗(猴抗兔)，孵育30 min5) PBS液洗，用不含血清的α -MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入Sca-I和7AAD或DAPI， 孵育30 min。6)PBS液洗，用不含血清的α -MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀無菌分選，得到 LirT:CD271+:Sca-r 的一群細(xì)胞及 LirT:CD27r 和 LirT: CD271+: Sca-Γ 細(xì)胞群。7)得到的LirT:⑶271+:SCa-r細(xì)胞群進(jìn)行培養(yǎng)。同時(shí)，將收集的Lin+細(xì)胞群、 LirT:⑶27Γ細(xì)胞群和LirT:⑶271+: Sca-Γ細(xì)胞群也進(jìn)行培養(yǎng)。3、ASCs 克隆形成能力(Clony-forming unit-fibroblast, CFU-F)的測(cè)定
將新鮮分離的細(xì)胞群采用有限稀釋方法進(jìn)行克隆培養(yǎng)，用20%FBS+a-MEM培養(yǎng) 基制成單個(gè)細(xì)胞的懸液，用微量吸管將單個(gè)的細(xì)胞吸入到48孔板的每個(gè)孔內(nèi)，加入 20%FBS+ α -MEM 培養(yǎng)基。14d后檢測(cè)克隆形成情況，克隆形成率=(克隆形成/接種細(xì)胞數(shù))X 100%,經(jīng)測(cè)定 克隆形成率為15. 7%士0. 58，如圖2所示細(xì)胞形成狀態(tài)良好的克隆。4、ASCs體外多向分化能力的檢測(cè)，此步驟是為了驗(yàn)證得到的脂肪干細(xì)胞的多向分 化能力。4. 1成脂誘導(dǎo)
將Pl代ASCs接種于六孔板中，24 h后加入成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，誘導(dǎo)液成分見表1，每3 天半量換液；成脂誘導(dǎo)10天后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，進(jìn)行油紅0染色，DAPI染核。如圖 4A所示，圓圓的脂滴呈紅色，分布在細(xì)胞的周圍，說明細(xì)胞能夠向脂肪方向分化。表1各種誘導(dǎo)液配方
權(quán)利要求
1.一種脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括從脂肪組織中分離獲取、培養(yǎng)SVF細(xì)胞，其特 征在于還包括以下步驟用免疫磁珠分選法除去SVF細(xì)胞中的Lin+細(xì)胞，獲得LirT細(xì)胞群； 用流式細(xì)胞分選法從獲得的LirT細(xì)胞群中富集CD271+SCa-r細(xì)胞，得到脂肪干細(xì)胞；將獲 得的脂肪干細(xì)胞用含有LIF、FGF2的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于免疫磁珠分選法 中所采用的標(biāo)記物為 CD5、CD45R、CDllb、Anti-Gr-I 及 Ter-119。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于流式細(xì)胞分選法 中使用的標(biāo)記物為L(zhǎng)in、CD271和Sca_l。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)獲得的脂肪 干細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是含有10%體積比胎牛血清、103-105 U/mL LIFU0-100 ng/mL FGF2的 α -MEM培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)獲得的脂肪 干細(xì)胞所用的培養(yǎng)基是含有10%體積比胎牛血清、103U/mL LIF、20 ng/mL FGF2的α-MEM培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于還包括對(duì)獲得的 脂肪干細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于所述的傳代培養(yǎng)是貼壁培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于當(dāng)獲得的脂肪干 細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部的生長(zhǎng)密度達(dá)70-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法所分離培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞 的應(yīng)用，其特征在于其應(yīng)用于純化或克隆干細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因干細(xì)胞系的生產(chǎn)或者用于生產(chǎn)成 脂/成骨細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的脂肪干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于其應(yīng)用于生產(chǎn)成脂/成骨細(xì) 胞的方法為(1)、熒光激活流式細(xì)胞分類和磁激活細(xì)胞分選相結(jié)合分離獲取ASCs；(2)、將ASCs分別復(fù)合纖維蛋白和BCP支架材料，接種于裸鼠背部或小鼠股骨缺損處。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。本發(fā)明的方法包括從脂肪組織中分離獲取、培養(yǎng)SVF細(xì)胞，其特征在于還包括以下步驟用免疫磁珠分選法除去SVF細(xì)胞中的Lin+細(xì)胞，獲得Lin-細(xì)胞群；用流式細(xì)胞分選法從獲得的Lin-細(xì)胞群中富集CD271+Sca-1+細(xì)胞，得到脂肪干細(xì)胞；將獲得的脂肪干細(xì)胞用含有LIF、FGF2的培養(yǎng)基培養(yǎng)。本發(fā)明采用FACS和MACS相結(jié)合，可以高效快速的獲得高純度的脂肪干細(xì)胞，這群細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力、自我更新能力和多向分化潛能，本發(fā)明方法獲得的P16代脂肪干細(xì)胞仍有較強(qiáng)的成脂能力和成骨能力，為在體外獲取大量的具有干性的種子細(xì)胞運(yùn)用于組織再生提供了新的方法。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102002478SQ20101056887
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者孫欽策, 李 杰, 田衛(wèi)東, 肖金剛, 郭維華, 黃科 申請(qǐng)人:四川大學(xué)