間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能的細(xì)胞，它能夠定向誘導(dǎo)為胰島樣細(xì)胞、 軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞。且間充質(zhì)細(xì)胞存在于人體多種組織中，尤其是臍帶、胎盤、脂肪組織 來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來源廣泛、易于采集、無倫理問題等優(yōu)勢，可規(guī)?；T導(dǎo)分化為 胰島樣細(xì)胞，為臨床治療糖尿病提供新的技術(shù)方案。
[0003]因間充質(zhì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的貼壁性，因此，在二維培養(yǎng)體系中，間充質(zhì)干細(xì)胞易聚集 成團(tuán)，不利于細(xì)胞增殖培養(yǎng)，且細(xì)胞活性較低、活細(xì)胞比率低等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對現(xiàn)有技術(shù)中間充質(zhì)干細(xì)胞在二維培養(yǎng)體系中 存在細(xì)胞活性低、增殖效果差等缺陷，提供一種能夠提高細(xì)胞增殖率和活細(xì)胞比率的間充 質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng) 方法，包括以下步驟：獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，將間充質(zhì)干細(xì)胞與PM多肽水凝膠混合后進(jìn)行培 養(yǎng)。
[0006]在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中，所述PM多肽水凝膠由PM多肽 溶解于去離子水所獲得的。
[0007]在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中，所述PM多肽水凝膠中，所述PM多肽水凝膠中，PM多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1% -0. 75%。
[0008]在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中，所述PM多肽水凝膠中，所述PM多肽水凝膠與間充質(zhì)干細(xì)胞混合前，還包括采用培養(yǎng)液反復(fù)浸潤所述PM多肽水凝膠的步 驟。
[0009]在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中，所述PM多肽水凝膠中，所述培 養(yǎng)液為基礎(chǔ)培養(yǎng)液或完全培養(yǎng)液。
[0010] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中，所述PM多肽水凝膠中，所述PM多肽水凝膠浸潤次數(shù)為2-4次。
[0011] 在本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法中，所述PM多肽水凝膠與間充質(zhì) 干細(xì)胞混合前，還包括采用完全培養(yǎng)液重懸間充質(zhì)干細(xì)胞的步驟，并使得間充質(zhì)干細(xì)胞的 濃度為 1X104個 /mL-1X10 6個 /mL。
[0012] 實(shí)施本發(fā)明提供的間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，可以達(dá)到以下有益效果：利用 具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的PM多肽水凝膠為間充質(zhì)干細(xì)胞提供一個模擬人體內(nèi)細(xì)胞生長的環(huán) 境，為間充質(zhì)干細(xì)胞提供充足的生長空間和營養(yǎng)需求，有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增及提高 間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞活性。
【附圖說明】
[0013] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0014] 圖1為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng) 前，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)12 天后，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0016] 圖3為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0. 25%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在培 養(yǎng)前，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0017] 圖4為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0. 25%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在培 養(yǎng)12天后，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0018] 圖5為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0. 5%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在培 養(yǎng)前，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0019] 圖6為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0. 5%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 12天后，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0020] 圖7為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0. 75%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞在培 養(yǎng)前，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖；
[0021] 圖8為本發(fā)明檢測實(shí)驗(yàn)二中，采用0. 75%PM多肽水凝膠培養(yǎng)的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 12天后，電鏡觀察到的的細(xì)胞生長狀況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為解決現(xiàn)有技術(shù)中間充質(zhì)干細(xì)胞在二維培養(yǎng)體系中，間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增效果不 佳，活性不高等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)在于提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，通過在 培養(yǎng)基中加入具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的PM多肽水凝膠，能夠模擬人體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，為間充 質(zhì)干細(xì)胞提供充足的生長空間和營養(yǎng)需求，從而實(shí)現(xiàn)了提高間充質(zhì)干細(xì)胞活性及擴(kuò)增倍數(shù) 的目的。
[0023] 本發(fā)明提供的一種間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)方法，包括以下步驟：獲取間充質(zhì)干 細(xì)胞，將間充質(zhì)干細(xì)胞與PM多肽水凝膠混合后進(jìn)行培養(yǎng)。
[0024] PM多肽水凝膠具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠模擬人體內(nèi)細(xì)胞生長環(huán)境，增大了間充質(zhì) 干細(xì)胞與培養(yǎng)基和氧氣的接觸面積，同時，由于間充質(zhì)干細(xì)胞為較強(qiáng)的貼壁細(xì)胞，PM多肽水 凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，也為間充質(zhì)干細(xì)胞提供更充足的生長空間，更有利于臍帶間充質(zhì)干 細(xì)胞的擴(kuò)增，同時，PM多肽水凝膠含水量較高，也提高了間充質(zhì)干細(xì)胞的活性。
[0025] 本發(fā)明所采用的PM多肽水凝膠，又稱PM凝膠肽（PuraMatrix凝膠肽），購自于BD 公司；PuraMatrix多肽是由16個氨基酸殘基組成的一種肽，沒有包含明顯的生長因子或細(xì) 胞因子，自組裝形成納米纖維結(jié)構(gòu)，溶于水溶液中，疏水和離子氨基酸結(jié)合形成三維網(wǎng)狀結(jié) 構(gòu)的凝膠狀，即PM多肽水凝膠，可以供間充質(zhì)干細(xì)胞提供充足的生長空間，擴(kuò)大間充質(zhì)干 細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面積，有利于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增。目前PM多肽水凝膠公開的用 途為用于組織再生，如骨填充物，傷口愈合以及用于藥物輸送系統(tǒng)等，而本發(fā)明中將PM多 肽溶于水之后，利用其三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)，能夠獲得較好的間充質(zhì)干 細(xì)胞的培養(yǎng)效果。
[0026] 具體地，間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)過程為：
[0027] 1、去離子水溶解PM多肽，獲取PM多肽水凝膠；
[0028] 2、采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液反復(fù)浸潤步驟1獲得的PM多肽水凝膠，浸潤次數(shù)為2-4次；
[0029] 3、獲取間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0030] 4、將步驟3中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞與步驟2中獲得的PM多肽水凝膠混合后進(jìn)行 培養(yǎng)。
[0031 ] 步驟1中，將PM多肽放入超聲波水浴鍋超聲振蕩30min，其中，該水浴所采用的水 為去離子水；若振蕩過程中產(chǎn)生氣泡，轉(zhuǎn)移至離心管離心（4000轉(zhuǎn)/5min)去除。根據(jù)所需PM多肽水凝膠中PM多肽的終濃度，取1. 5mL的EP管（印pendorf管，標(biāo)有相應(yīng)濃度的離心 管），用去離子水稀釋PM多肽原液配制所需濃度的PM多肽水凝膠，優(yōu)選地，在PM多肽水凝 膠中，PM多肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1 % -0. 75%，PM多肽水凝膠濃度過大，則PM多肽水凝膠形成 的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于致密，不利于細(xì)胞因子的傳遞和細(xì)胞之間信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，或?qū)е录?xì)胞的缺氧， 不利于細(xì)胞的增殖培養(yǎng)。
[0032] 由于電解質(zhì)物質(zhì)會影響PM多肽水凝膠在水中的溶解度，因此，該過程中采用去除 電解質(zhì)物質(zhì)的去離子水進(jìn)行溶解稀釋PM多肽水凝膠。另外，氣泡的存在使得PM多肽水凝 膠在去離子水中分散不均勻，影響間充質(zhì)干細(xì)胞的擴(kuò)增密度，并且氣泡結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會隨時 破裂，容易破壞附著在PM多肽水凝膠上的間充質(zhì)干細(xì)胞，因此，在該過程中，要盡量避免產(chǎn) 生氣泡。
[0033] 步驟2中，將步驟1中獲得的PM多肽水凝膠接種于細(xì)胞培養(yǎng)容器中，如培養(yǎng)板中， 一次性從培養(yǎng)孔中心快速注入相應(yīng)濃度PM多肽水凝膠50yL，盡量避免產(chǎn)生氣泡，如有氣 泡，用細(xì)針頭刺破，并保證高濃度PM多肽水凝膠鋪滿孔底，將培養(yǎng)板置于37°C培養(yǎng)箱靜置 15min〇
[0034] 然后，用200yL移液槍小心緩慢地沿著培養(yǎng)孔壁注入20