專利名稱：一種Nisin的紅色熒光素檢測(cè)方法及所用的指示菌和重組質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及菌株的構(gòu)建，尤其是一種nisin的紅色熒光素檢 測(cè)方法及所用的指示菌和重組質(zhì)粒。
背景技術(shù)：
Nisin為乳酸鏈球菌素，是由某些乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種小分子肽，對(duì)許多引起食 物腐敗的革蘭氏陽(yáng)性菌如Clostridium，Bacillus, Listeria, Staphylococcus等屬的菌株 有很好的抑制作用，且對(duì)人畜無(wú)毒性，由于nisin具有的較廣抗菌譜活性，因此，作為防腐 劑被廣泛用于食品、乳品等工業(yè)中。目前檢測(cè)nisin的常用的方法有平板擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫吸附法、生物熒光檢測(cè)法 等，平板擴(kuò)散法的缺點(diǎn)是影響精確度和敏感度的因素較多，而且所需時(shí)間長(zhǎng)；酶聯(lián)免疫吸附 法雖然敏感度較高，但是易產(chǎn)生各種交叉反應(yīng)；生物熒光檢測(cè)法具有快速、靈敏且特異性強(qiáng) 等特點(diǎn)，但常見的熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)和綠色熒光蛋白(GFP)報(bào)告系統(tǒng)因受細(xì)胞、 材料等自發(fā)熒光的干擾，常造成信號(hào)噪音比不高，且熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)需要添加外源底物， 檢測(cè)方法較繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種Nisin檢測(cè)特異性高、檢 測(cè)方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)更加快捷的一種Msin的紅色熒光素檢測(cè)方法及所用的指示菌和重組質(zhì) 粒。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種重組質(zhì)粒，其特征在于含有一個(gè)PnisA啟動(dòng)子，一種選擇性標(biāo)記，一個(gè)復(fù)制起 點(diǎn)，一個(gè)編碼產(chǎn)紅色熒光素酶的基因cobA。而且，所述PnisA的啟動(dòng)子來(lái)自于乳酸鏈球菌亞種NZ9700菌株。而且，所述選擇性標(biāo)記為綠霉素抗性基因Cm。而且，所述編碼產(chǎn)紅色熒光素酶的基因cobA來(lái)自于Propionibacterium freudenreichii 。一種nisin檢測(cè)指示菌，在宿主菌中轉(zhuǎn)化引入如權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒。而且，所述宿主菌為不產(chǎn)生nisin的乳酸鏈球菌NZ9000菌株，該受體菌含有染色 體編碼的nisin響應(yīng)蛋白NisK和NisR。一種nisin檢測(cè)指示菌檢測(cè)nisin的方法，檢測(cè)的步驟是(1)在含有氯霉素的M17GS液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)指示菌至0D600為0. 5-1 ；(2)稀釋步驟(1)的指示菌液，制備nisin標(biāo)準(zhǔn)樣品液，在標(biāo)準(zhǔn)樣品液中加入 0. 05-0. 15%吐溫80并將pH調(diào)至2. 5-3. 5，將不同體積的標(biāo)準(zhǔn)樣品液加入Iml的稀釋指示 菌液中；
(3)在 25-35°C靜止培養(yǎng) 1. 5-2. 5 小時(shí);(4)用熒光測(cè)量?jī)x測(cè)定在紫外波長(zhǎng)區(qū)內(nèi)樣品熒光強(qiáng)度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1、本發(fā)明構(gòu)建的工程指示菌TD304在感應(yīng)nisin信號(hào)后，誘導(dǎo)紅色熒光素酶cobA 基因表達(dá)，使從而導(dǎo)致紅色熒光素西羅雙氫葉綠三酸積。紅色熒光素的積累量與細(xì)胞外 nisin的濃度成正比，通過(guò)檢測(cè)紅色熒光素的熒光強(qiáng)度，能夠間接地得出指示菌TD304細(xì)胞 外nisin的含量。2、本發(fā)明構(gòu)建的基因工程指示菌TD304可以用于快速檢測(cè)nisin發(fā)酵液中nisin 的含量，為確立nisin發(fā)酵的最佳終止點(diǎn)提供科學(xué)的參數(shù)，也可以用來(lái)快速檢測(cè)水、食品、 牛奶飲料中的nisin含量。3、本發(fā)明nisin的檢測(cè)方法靈敏度高，檢測(cè)的nisin濃度為彡0.015ng/ml，所需時(shí) 間僅為2個(gè)小時(shí)，克服了現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，同常用的生物熒光素(Luciferase)和綠色熒光 蛋白(GFP)基因報(bào)告系統(tǒng)相比，本檢測(cè)方法以在紫外光下發(fā)紅色熒光的西羅雙氫葉綠三酸 作為測(cè)量對(duì)象，大大降低了自發(fā)熒光的干擾，具有背景噪音低，特異性高的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明nisin濃度與熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的構(gòu)建和表達(dá)原理是在nisin生產(chǎn)菌中，nisin結(jié)構(gòu)基因nisA的轉(zhuǎn)錄受細(xì)胞外nisin自身的正向調(diào)控， 而nisin作為信號(hào)分子反過(guò)來(lái)促進(jìn)自身的合成則依賴于nisA的啟動(dòng)子？ &、基因nisR和 基因nisK三者的協(xié)調(diào)功能，nisR編碼一種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子NisR，nisK編碼一種組氨酸激酶 NisK，該激酶能感應(yīng)環(huán)境中的nisin信號(hào)分子，NisR和NisK偶聯(lián)形成一個(gè)二元系統(tǒng)來(lái)感應(yīng) 和傳遞細(xì)胞外nisin信號(hào)并將信號(hào)傳遞給PnisA啟動(dòng)子。Nisin信號(hào)的強(qiáng)弱在一定范圍內(nèi)與nisin的濃度成正比，而nisin的濃度則決定 PnisA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而控制結(jié)構(gòu)基因nisA的表達(dá)量，因此，nisin合成的自調(diào)控信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)可以用來(lái)構(gòu)建檢測(cè)細(xì)胞外nisin濃度的報(bào)導(dǎo)系統(tǒng)，即將PnisA啟動(dòng)子同紅色熒光素合成 酶基因cobA融合，放在一個(gè)能在乳酸鏈球菌表達(dá)的質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)入不產(chǎn)生nisin但含有編碼 NisK和NisR基因的乳酸鏈球菌宿主菌株而形成nisin工程指示菌。1、重組質(zhì)粒pLHC-cobA的構(gòu)建，該質(zhì)粒載體包含一個(gè)PnisA的啟動(dòng)子，一種選擇性標(biāo) 記，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)編碼產(chǎn)紅色熒光素酶的基因cobA。構(gòu)建過(guò)程如下(1)啟動(dòng)子PnisA的來(lái)源質(zhì)粒PNZ8048含有？ ^啟動(dòng)子。用限制內(nèi)切酶EcoRI、NcoI于37°C雙酶切質(zhì)粒 PNZ80482-3小時(shí)，然后用瓊脂糖膠電泳純化線性化的質(zhì)粒。(2)產(chǎn)紅色熒光素酶基因cobA的獲得及連接
^1^^7 n-j^BISS CObA ^gT Propionibacterium freudenreichii上游引物P1 5，-GATCGAAGCTTGCCGCCATGACCACCACACTGTTGC-3，下游引物P2 5，-GATCGGCGGCCGCTCAGTGGTCGCTGG-3，以質(zhì)粒pISA417為模板PCR 反應(yīng)體系為ddH20 20 μ 1，IOXbuffer 2. 5 μ 1, dNTP 1 μ 1，上下游引物 (lOpmol/μ 1)各 0. 5 μ 1，模板 IOng, Taq 酶 0. 25U。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性Imin ；94°C變性30s、55°C退火30s、72°C延伸lmin，反應(yīng) 30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物(cobA)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，其大小與NCBI上報(bào)道的吻合，隨后在 PCR擴(kuò)增的上游和下游引物中分別加入BspHI和EcoRI限制酶位點(diǎn)，因BspHI酶切末端和 NcoI酶切末端相匹配，cobA基因PCR產(chǎn)物經(jīng)BspHI和EcoRI雙酶切和純化后直接克隆到 PNZ8048的EcoRI/Ncol位點(diǎn)，產(chǎn)生的重組質(zhì)粒pLHC_cobA。在該重組質(zhì)粒中cobA基因位于 PnisA啟動(dòng)子的下端，其表達(dá)受PnisA啟動(dòng)子控制。2、指示菌株TD304的構(gòu)建(1)宿主菌乳酸鏈球菌NZ9000菌株的轉(zhuǎn)化制備宿主菌乳酸鏈球菌NZ9000菌株的感受態(tài)細(xì)胞，用電擊法將pLHC-cobA引入受 體乳酸鏈球菌NZ9000，涂布含有氯霉素(5ug/ml)的M17GS平板，30°C過(guò)夜培養(yǎng)。(2)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證通過(guò)質(zhì)粒提取，酶切和瓊脂糖膠電泳來(lái)驗(yàn)證從平板上收集的菌落是否含有 pLHC-cobA，獲得的轉(zhuǎn)化子為TD304指示菌。3、一種利用指示菌TD304檢測(cè)nisin的方法，過(guò)程如下(1)在含有氯霉素的M17GS液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)指示菌TD304至0D600為0. 7 ；(2)稀釋以上菌液150倍，制備適當(dāng)濃度nisin標(biāo)準(zhǔn)樣品液，在樣品中加入0. 1% 吐溫80并將pH調(diào)至3. 0，將2ul到40ul不同體積的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入Iml的稀釋指示菌液中；(3)在30°C靜止培養(yǎng)2小時(shí)；(4)用熒光測(cè)量?jī)x測(cè)定在紫外波長(zhǎng)區(qū)內(nèi)樣品熒光強(qiáng)度。根據(jù)nisin濃度和所測(cè)熒 光強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法在nisin生產(chǎn)發(fā)酵液檢測(cè)的最低量為0. 015ng/mL·
權(quán)利要求
1.一種重組質(zhì)粒，其特征在于含有一個(gè)？ &啟動(dòng)子，一種選擇性標(biāo)記，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)， 一個(gè)編碼產(chǎn)紅色熒光素酶的基因cobA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述PnisA的啟動(dòng)子來(lái)自于乳酸鏈球 菌亞種NZ9700菌株。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述選擇性標(biāo)記為綠霉素抗性基因Cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述編碼產(chǎn)紅色熒光素酶的基因 cobA 來(lái)自于 Propionibacterium freudenreichii。
5.一種nisin檢測(cè)指示菌，其特征在于在宿主菌中轉(zhuǎn)化引入如權(quán)利要求1所述的重 組質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的nisin檢測(cè)指示菌，其特征在于所述宿主菌為不產(chǎn)生nisin 的乳酸鏈球菌NZ9000菌株，該受體菌含有染色體編碼的nisin響應(yīng)蛋白NisK和NisR。
7.一種利用如權(quán)利要求5或6所述指示菌檢測(cè)nisin的方法，其特征在于檢測(cè)的步 驟是(1)在含有氯霉素的M17GS液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)指示菌至0D600為0.5-1 ；(2)稀釋步驟(1)的指示菌液，制備nisin標(biāo)準(zhǔn)樣品液，在標(biāo)準(zhǔn)樣品液中加入 0. 05-0. 15%吐溫80并將pH調(diào)至2. 5-3. 5，將不同體積的標(biāo)準(zhǔn)樣品液加入Iml的稀釋指示 菌液中；(3)在25-35°C靜止培養(yǎng)1.5-2. 5小時(shí);(4)用熒光測(cè)量?jī)x測(cè)定在紫外波長(zhǎng)區(qū)內(nèi)樣品熒光強(qiáng)度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種nisin的紅色熒光素檢測(cè)方法及所用的指示菌和重組質(zhì)粒，通過(guò)重組質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主乳酸鏈球菌NZ9000得到一株能響應(yīng)nisin而生成紅色熒光素的基因工程指示菌。重組質(zhì)粒載體含有一個(gè)受誘導(dǎo)型強(qiáng)啟動(dòng)子PnisA控制的紅色熒光素酶cobA基因，一個(gè)氯霉素抗性基因。本發(fā)明構(gòu)建的基因工程指示菌TD304可以用于快速檢測(cè)nisin發(fā)酵液中nisin的含量，為確立nisin發(fā)酵生產(chǎn)的最佳終止點(diǎn)提供科學(xué)的參數(shù)，也可以用來(lái)快速檢測(cè)水、食品、牛奶飲料中的nisin含量。
文檔編號(hào)C12N15/52GK102071210SQ20101057265
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者劉曉光, 劉運(yùn)德, 胡國(guó)武 申請(qǐng)人:天津艾瑪斯特生物科技有限公司