一種霍亂弧菌多重熒光pcr檢測試劑盒及其制備與應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術檢測領域，具體設及一種霍亂弧菌多重巧光PCR檢測試劑盒 及其制備與應用。
【背景技術】
[0002] 霍亂是一種烈性腸道傳染病，是我國的法定報告?zhèn)魅静≈?，病原體為霍亂弧菌 (Vibrio Cholerae)?；魜y發(fā)病急驟，傳播迅速，患者有劇烈的腹瀉和嘔吐癥狀，會導致脫 水、休克等一系列嚴重的綜合征，未及時確診和治療者死亡率較高。
[0003] 目前，根據(jù)菌體抗原的不同，霍亂弧菌可分為210多個血清群，其中僅Ol群和0139 群會導致霍亂流行。Ol群又分為古典生物型(Classical biotype)和埃爾托生物型化1 Tor biotype)?；魜y曾發(fā)生7次世界性大流行，前6次均由Ol群古典生物型引起，而自1961年起發(fā) 生的第7次世界性大流行則由Ol群埃爾托生物型引起，波及140多個國家和地區(qū)，至今未見 平息，近年來疫情還有所增加。0139群主要流行于亞洲。其他血清群的霍亂弧菌僅導致偶然 的散發(fā)病例或聚餐引起的很小規(guī)模的爆發(fā)，統(tǒng)稱為非01/非0139群?；魜y弧菌的致病因素之 一為霍亂毒素 （cholera toxin,CT)，產(chǎn)生毒素的霍亂弧菌致病力強，能引起霍亂暴發(fā)和流 行。而不產(chǎn)毒的Ol群和0139群則不會引起大流行。因此，準確快速地鑒定霍亂弧菌的血清群 類型和產(chǎn)毒能力對評價霍亂疫情風險，及時制定有效的防控策略有重要意義。
[0004] 霍亂弧菌的傳統(tǒng)檢測方法有：細菌分離培養(yǎng)法、糞便涂片鏡檢法、生化特征檢測 法、血清學凝集分型法、隧菌體分型法等。雖然細菌培養(yǎng)、生化和血清學鑒定方法一度是實 驗室診斷霍亂弧菌的"金標準"，但傳統(tǒng)的檢測方法均存在周期長，工作量大，易受培養(yǎng)條件 及操作人員經(jīng)驗等主客觀因素影響等不足，不能滿足疾病預防和控制快速反應體系的需 要。近年來，分子生物學技術因其操作簡單、靈敏度高、反饋快速、結果準確等優(yōu)點，越來越 廣泛地應用于霍亂弧菌的檢測和分型研究中。
[0005] 在分子生物學檢測方法中，普通的PCR法檢測霍亂弧菌的靈敏度和特異性雖然很 高，但每次只能檢測一個基因，效率較低；用凝膠電泳對擴增產(chǎn)物進行分析時，容易造成交 叉污染;電泳結果往往需要實驗人員主觀進行判斷，準確度欠佳。相較而言，多重巧光PCR方 法可在一次反應中檢測多個基因，節(jié)約了時間和成本;用儀器來識別巧光信號，提高了檢測 靈敏度，降低了檢測限，減少了人工誤差;在擴增反應過程中對巧光信號進行實時檢測，全 程封閉進行，大大降低了樣本間交叉污染的風險。
[0006] 鎖核酸化ocked nucleic acid,LNA)是新型的核酸類似物，它包含了2'-氧4'碳亞 甲基連接，運個連接限制了巧喃核糖環(huán)的靈活性，將其結構鎖定成一個剛性的雙環(huán)模式。由 于LNA與DNA/RNA在結構上具有相同的憐酸鹽骨架，故其對DNA、RNA有很好的識別能力和強 大的親和力，能夠提高引物/探針的雜交效率和穩(wěn)定性;同時還可W提高目標序列雜交的特 異性。使得由非所需激活的巧光背景大量減少，從而增大信號對背景噪音的比例，提高分辨 度。與普通的化qman探針相比，其雙鏈在相同的鹽溶液中，每增加一個單體LNA分子將導致 其烙點提高8°C，運樣強化后的雜交性能可W顯著擴大實驗檢測的環(huán)境限制，即通過調(diào)整 LNA堿基在探針序列中的位置來調(diào)節(jié)Tm值和雜交特異性。此外，由于LNA強化的雜交特征和 對烙點溫度的影響，含有LNA的實時定量PCR探針，長度較短，可W增加設計的靈活性，從而 減少或消除普通DNA探針某些設計的局限或無法解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對傳統(tǒng)檢測手段中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種霍亂弧菌多重巧 光PCR檢測試劑盒及其制備與應用。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供一種霍亂弧菌多重巧光PCR檢測試劑盒，所述試劑盒中包 括霍亂弧菌溶血素基因檢測引物及探針、霍亂弧菌Ol群抗原基因檢測引物及探針、霍亂弧 菌0139群抗原基因檢測引物及探針、霍亂弧菌腸毒素基因檢測引物及探針，所述霍亂弧菌 溶血素基因檢測引物包括核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示的下游引物，霍亂弧菌溶血素基因檢測探針的核巧酸序列如SEQ ID NO.3所 示;所述霍亂弧菌Ol群抗原基因檢測引物包括核巧酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物 和核巧酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，所述霍亂弧菌Ol群抗原基因檢測探針的核 巧酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述霍亂弧菌0139群抗原基因檢測引物包括核巧酸序列如 SEQ ID NO.7所示的上游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物，所述霍亂弧菌 0139群抗原基因檢測探針的核巧酸序列如SEQ ID NO.9所示;所述霍亂弧菌腸毒素基因檢 測引物包括核巧酸序列如SEQ ID NO. 10所示的上游引物和核巧酸序列如SEQ ID NO. 11所 示的下游引物，所述霍亂弧菌腸毒素基因檢測探針的核巧酸序列如SEQ ID NO. 12所示;所 述霍亂弧菌溶血素基因檢測探針、霍亂弧菌Ol群抗原基因檢測探針、霍亂弧菌0139群抗原 基因檢測探針和霍亂弧菌腸毒素基因檢測探針上標記有巧光報告基團和巧光澤滅基團。
[0010] 優(yōu)選地，所述霍亂弧菌溶血素基因檢測探針、霍亂弧菌Ol群抗原基因檢測探針、霍 亂弧菌0139群抗原基因檢測探針和霍亂弧菌腸毒素基因檢測探針的5'端標記有巧光報告 基團，3 '端標記有巧光澤滅基團。
[0011] 進一步優(yōu)選地，所述霍亂弧菌溶血素基因檢測探針5'端標記的巧光報告基團為 FAM巧光基團，3 '端標記的巧光澤滅基團為B冊-1。
[0012] 進一步優(yōu)選地，所述霍亂弧菌Ol群抗原基因檢測探針5'端標記的巧光報告基團為 CY5巧光基團，3'端標記的巧光澤滅基團為B冊-3。
[0013] 進一步優(yōu)選地，所述霍亂弧菌0139群抗原基因檢測探針5'端標記的巧光報告基團 為肥X巧光基團，3 '端標記的巧光澤滅基團為肌Q-I。
[0014] 進一步優(yōu)選地，所述霍亂弧菌腸毒素基因檢測探針5'端標記的巧光報告基團為 化1 RedeiO巧光基團，3'端標記的巧光澤滅基團為B冊-2。
[0015] 本發(fā)明的試劑盒采用多重巧光PCR技術在單管中同時進行霍亂弧菌溶血素基因、 霍亂弧菌Ol群抗原基因、霍亂弧菌0139群抗原基因、霍亂弧菌腸毒素基因的檢測，根據(jù)擴增 及檢測情況可分析判斷霍亂弧菌感染情況、并對所感染霍亂弧菌進行準確分型、鑒定致病 毒力基因。因此，引物及探針的設計是本發(fā)明試劑盒的關鍵。
[0016] 基于本發(fā)明所述試劑盒是采用多重巧光PCR技術來進行檢測的，所W試劑盒中還 可W包括其他一些PCR所需要的常規(guī)試劑，如:dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、無 菌水(d地2〇)等常用PCR反應試劑中的一種或多種。由于此類PCR常用試劑均可經(jīng)市場途徑 單獨購得或者自行配置，因此具體需要將哪些試劑裝配入試劑盒，可W根據(jù)客戶實際需要 配置，為方便起見，也可全部裝配入試劑盒。
[0017] 所述PCR反應體系中，引物、探針、dNTP、MgCl2、PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、無菌水 (dd出0)均為常見組分，其含量亦為常規(guī)。
[0018] 所述PCR反應體系可自行配置，也可直接W市售的不含引物及探針的通用PCR反應 液加入引物及探針獲得。例如，所述試劑盒中還可W含有dNTP、MgCb、PCR緩沖液、Taq DNA 聚合酶、無菌水(dd出0)。