專利名稱：一種淡水沉積物總dna的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于淡水沉積物DNA樣品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從淡水沉積物中提取DNA的方法。提取的DNA樣品可用于PCR反應(yīng)的模板或用于檢測淡水沉積物中微生物的數(shù)量或群落結(jié)構(gòu)。同時本發(fā)明中涉及到的試劑亦可作為沉積物總DNA提取試劑盒的核心試劑。
背景技術(shù)：
由于淡水水體沉積物中的成分復(fù)雜，常規(guī)提取DNA的方法難以除去腐植酸，而微量的腐殖酸即可抑制taq酶的擴(kuò)增，以及酶切反應(yīng)的限制性內(nèi)切酶活性(Steffen and Alats，1998 ；Porteous and Armstrong, 1991)。目前尚未見到針對淡水沉積物總DNA的提取試劑盒，提取沉積物總DNA通常采用土壤提取試劑盒。但土壤提取試劑盒價格非常昂貴， 且基因組斷裂現(xiàn)象明顯，對大批量樣品的提取不經(jīng)濟(jì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有方法存在的缺陷，建立一種操作簡單、方便且價格經(jīng)濟(jì)的淡水沉積物總DNA的提取方法，該方法可用于制作試劑盒，直接從淡水沉積物中提取純度極高的總DNA，可做為PCR反應(yīng)的模板，檢測淡水沉積物微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本申請人發(fā)明了一種從淡水沉積物中提取總DNA的方法。該方法包括以淡水沉積物為材料，采用適當(dāng)濃度的明礬溶液來去除底泥中的腐殖質(zhì)，用焦磷酸鈉作為分散劑將微生物與沉積物分離開，用CTAB和SDS聯(lián)合裂解細(xì)胞，PEG沉淀，能將底泥中的絕大部分腐殖質(zhì)去除。用此法得到的DNA在^Onm和^Onm處的吸光值的比值在1. 8左右，260nm和 230nm處的吸光值的比值在2. O左右，接近理想值，不做稀釋，不用試劑盒純化，能直接用于 PCR反應(yīng)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下所示本發(fā)明的主要步驟包括沉積物預(yù)處理、細(xì)胞裂解、DNA抽提和純化步驟。具體方法按照以下步驟操作1、一種從淡水沉積物中提取總DNA的方法，其特征在于包括下列步驟1)稱取新鮮淡水沉積物0. 3g于2ml的無菌離心管中，加300 μ IpH為6. 6磷酸緩沖液，再往其中加400μ 1溶液Α，在微型渦旋混合儀上渦旋2-;3min，使沉積物與溶液混勻， 再往該離心管中添加40 μ 1沉積物預(yù)處理液B，渦旋lmin，于室溫在12000g下離心5min，棄上清，得沉積物；2)向步驟1)中的離心管沉積物中添加630 μ 1溶液C和70 μ 1溶液D，10 μ 11 Omg/ ml的蛋白酶K，渦旋5min，得到沉積物懸浮物；3)將步驟2、的沉積物懸浮物在37°C下水浴Ih，再加100 μ 1 20%的SDS，于65 °C 水浴2h，期間每隔10-15min顛倒一次離心管；
3
4)將步驟3)的離心管于IOOOOg下離心5min，取上清700 μ 1于一 1.5ml無菌離心管中，加入700 μ 1溶液Ε，充分混勻，于室溫IOOOOg下離心5min，取600 μ 1上清于一新的1. 5ml無菌離心管中，再加入500 μ 1溶液Ε，充分混勻，室溫IOOOOg離心lOmin，得上清；5)取450 μ 1步驟4)的上清于一新的1. 5ml無菌離心管中，加入45 μ 1溶液F和 250 μ 1溶液G，混勻，于室溫下放置lh，然后IOOOOg離心lOmin，棄上清，留沉淀物1 ；6)向步驟5)的沉淀1中加入500 μ 1 80%的乙醇，于12000g下離心lOmin，棄上清，重復(fù)該步驟，得沉淀物2;7)將步驟6)沉淀物2在5000g離心ls，用微量移液器將離心管中殘留的液體除去，于室溫下干燥lOmin，得沉積物總DNA ；8)向步驟7)離心管中添加50 μ 1超純水，使沉積物總DNA溶解，得到沉積物總 DNA，在紫外分光光度計上檢測沉積物DNA的濃度和純度；9)用步驟 8)得到的 DNA,以 16S rDNA 的特異引物 341F :5，CCTACGGGAGGCAGCAG 3，和534R :5，ATTACCGCGGCTGCTGGCA 3，為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到沉積物16S rDNA序列片段，其中步驟1)中的溶液A為200mM的明礬溶液；溶液B為20%濃度的NaOH溶液；步驟2)中的溶液 C 的配方為IOOmM Tris-Hcl ； IOOmM EDTA ； IOmM pH 為 8. O 的磷酸鹽，1. 5M NaCl及CTAB溶液；溶液D為IOOmM的焦磷酸鈉溶液。步驟4)中的溶液E配方為飽和酚、三氯甲烷和異戊醇，其體積比為25 24 I0
步驟5)中的溶液F為5M的NaCl溶液；溶液G為50%的聚乙二醇6000溶液。本發(fā)明的積極效果是本發(fā)明提取的沉積物總DNA得率高，重復(fù)性強(qiáng)，純度高，無明顯剪切現(xiàn)象，操作簡單，價格低，適宜淡水沉積物大批量DNA樣品的提取。


圖1 用本提取方法提取的湖北省武漢市洪山區(qū)南湖漁場(以下簡稱“南湖”)和淡水養(yǎng)殖池塘沉積物總DNA電泳檢測圖(圖中泳道1為湖北省武漢市洪山區(qū)南湖養(yǎng)殖場沉積物總DNA，泳道2為淡水養(yǎng)殖池塘沉積物總DNA)，點(diǎn)樣量為2 μ 1。圖中兩側(cè)的泳道為DNA Marker,其分子量標(biāo)準(zhǔn)從上往下依次為 23130bp，9416bp，6557bp，4361bp，2322bp, 2027bp, 564bp (bp :堿基對，lambda DNA/HindIII，購自 Fermentas 公司)。圖2 用本發(fā)明提取的淡水養(yǎng)殖池塘沉積物總DNA在NaNODROP紫外分光光度計 (型號 NanoDropTM2000，基因有限公司)上的掃描圖，A260/A280 = 1. 85, A260A230 = 1. 94 ；DNA 的濃度為253. 4ng/ul (從每克沉積物中可以得到DNA的總量為42. 2ug)。圖3 用本發(fā)明提取的南湖沉積物總DNA在NaNODROP紫外分光光度計(型號 NanoDropTM2000，基因有限公司)上的掃描圖，A26。/A28。= 1. 86, A260A230 = 1. 92 ；DNA 的濃度為80. 4ng/ul (從每克沉積物中可以得到DNA的總量為13. 4ug)。圖4 是以本發(fā)明提取的兩不同沉積物樣品DNA為模板做PCR擴(kuò)增的得到的產(chǎn)物電泳檢測圖。DNA Marker，其分子量標(biāo)準(zhǔn)從上往下依次為700bp，600bp，500bp，400bp， 300bp, 200bp, IOObp (bp 堿基對，DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 從淡水沉積物中提取總DNA所用淡水沉積物(底泥)來自湖北省公安縣崇湖漁場靜水淡水養(yǎng)殖池塘和武漢市洪山區(qū)南湖漁場，取樣后，-80°C保存待用，具體操作步驟如下1)稱取0.3g上述的沉積物(底泥)置于2毫升無菌離心管中，加300 μ 1磷酸緩沖液(磷酸緩沖液的制備稱取十二水磷酸氫二鈉2. 686g和二水磷酸二氫鈉1. 950g，定容至1L)和400ml溶液A (溶液A的制備稱取9. 487g十二水硫酸鋁鉀，溶于無菌雙蒸水，定容至100ml)，在微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司，產(chǎn)品型號為WH-2型)上渦旋2-3分鐘，充分混勻，再往該離心管中添加40 μ 1沉積物預(yù)處理液B (沉積物預(yù)處理B液的制備稱取4克氫氧化鈉，用無菌雙蒸水溶解并定容至100ml)，渦旋Imin ；室溫20_25°C， 12000g下離心5分鐘，棄上清，得到沉積物懸浮物；2)向步驟1)的離心管中添加630μ1溶液C(溶液C的制備稱取12.110g Tris-HCl、29. 224gEDTA、3. 581g NaH2PO4,87. 660g NaClUOg CTAB (溴代十六烷基三甲胺)， 溶于900ml雙蒸水，調(diào)pH到8. 0，定容至1L)和70 μ 1溶液D (溶液D的制備稱取4. 461g 十水焦磷酸鈉，溶于無菌雙蒸水，定容至100ml)，加10 μ 1 10mg/ml的蛋白酶K，渦旋5分鐘，得沉積物懸浮物；37°C水浴lh，再加100 μ 1 20%的SDS (十二烷基硫酸鈉)(20% SDS 的制備稱取20gSDS，加入90ml無菌雙蒸水中，使其充分溶解)，于65°C下水浴2h，期間每 10-15min顛倒一次離心管；3)將上步的離心管于IOOOOg下離心5min，取上清700 μ 1于一新的1. 5ml無菌離心管中，加入700 μ 1溶液E(溶液E的制備量取50ml飽和苯酚、48ml三氯甲烷、2ml 異戊醇充分混勻，靜止30分鐘后使用)，充分混勻，在室溫00-25。C )下，IOOOOg離心 5min,取600 μ 1上清于一新的1. 5ml無菌離心管中，再加入500 μ 1溶液Ε，充分混勻，室溫 20-250C IOOOOg 離心 IOmin ；4)取450 μ 1上清于另一新的1.5ml無菌離心管中，加入45 μ 1溶液F (溶液F的制備稱取29. 220g氯化鈉，溶于無菌雙蒸水，定容至IOOml)和250 μ 1溶液G (溶液G的配制稱取50. OOOg聚乙二醇6000 (PEG6000)，用無菌雙蒸水溶解并定容至IOOml)，混勻，室溫 (20-250C )放置lh，在12000g下離心lOmin，棄上清，留沉淀物1 ；5)向上步的沉淀1加入500 μ 1 80%的乙醇，于12000g下離心lOmin，棄上清，重
復(fù)本步驟，得沉淀物2;6)將步驟5)的沉淀物2在5000g下離心ls，用微量移液器將離心管中殘留的液體除去，于室溫20-25°C下干燥lOmin，得沉積物總DNA。再向離心管中添加50 μ 1超純水， 得沉積物總DNA溶液。本實(shí)施例的效果如圖1所示，提取的沉積物總DNA的分子大小在23Kbp左右，無明顯剪切現(xiàn)象。經(jīng)過電泳檢測其條帶相當(dāng)整齊。實(shí)施例2 實(shí)施例1提取的沉積物總DNA的純度和濃度檢測以超純水為空白對照，在NaNODROP紫外分光光度計上對實(shí)施例1提取的沉積物總 DNA進(jìn)行純度和濃度的檢測，得到如圖2和圖3所示的掃描圖像。圖2中所示A26(i/A28Q = 1. 85，A260ZA230 = 1. 94 ；DNA的濃度為253. 4ng/ul (從每g沉積物中可以得到DNA的總量為42. 2ug)。圖 3 中所示 A260A280 = 1. 86，A260A230 = 1. 92 ；DNA 的濃度為 80. 4ng/ul (從每 g 沉積物中可以得到DNA的總量為13. 4ug)。實(shí)施例3 實(shí)施例1提取的沉積物總DNA應(yīng)用于PCR檢測試驗(yàn)用實(shí)施例1提取的沉積物總DNA為模板，以16S rDNA引物正向引物341F 5，CCTACGGGAGGCAGCAG3，和反向引物 534R 5，ATTACCGCGGCTGCTGGCA3，為引物進(jìn)行 PCR， 擴(kuò)增出沉積物16S rDNA。PCR反應(yīng)體系如下(總體積20ul)雙蒸水14. 8ul ；DNA =Iul ； 10XPCR buffer (購自寶生物工程大連有限公司代理，或稱TaKaRa公司)2ul ；dNTP(購自寶生物工程大連有限公司代理，每種IOmM) 0. 4ul ；16S rDNA引物341F (100uM，由生工生物工程(上海)有限公司合成)0.8ul ；16S rDNA引物534R(100uM，由生工生物工程(上海) 有限公司合成):0. 8ul ；Taq Enzyme (TaKaRa公司，5U/ul) :0. 2ul。PGR程序如下預(yù)變性: 950C Imin ；變性:95°C 5s ；退火和延伸:60°C 60s ；最后延伸:72°C 3min，30個循環(huán)。擴(kuò)增的目的DNA片段大小為193bp (參照文獻(xiàn)Muyzer G, de Waa EC and UitterlindenAG. 1993)，其電泳結(jié)果見附圖4所示(圖4中泳道1是以湖北省武漢市南湖漁場沉積物DNA為模板擴(kuò)增的16S rDNA的部分片段，泳道2為以湖北省公安縣池塘沉積物 DNA為模板擴(kuò)增的16S rDNA的部分片段)。主要參考文獻(xiàn)1、Steffan R J and Atlas R Μ. DNA amplification to enchance detection of geneticallyengineered bacteria in environmentel samples. Applied EnvrionmentalMicrobiolgy, 1998，54 :2185-2191.2、Porteous L A and Armstrong J L. Recovery of bulk DNA from soil by a rapid, small-scaleextration method. Current Microbiology,1991,22 :345-348.3、Muyzer G, de Waa EC, Uitterlinden AG. Profiling of complex microbial populationby denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chainreaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol, 199359 :695-700.
權(quán)利要求
1. 一種從淡水沉積物中提取總DNA的方法，其特征在于包括下列步驟1)稱取新鮮淡水沉積物0.3g于2ml的無菌離心管中，加300 μ IpH為6. 6磷酸緩沖液， 再往其中加400μ 1溶液Α，在微型渦旋混合儀上渦旋2-3分鐘，使沉積物與溶液混勻，再往該離心管中加40 μ 1沉積物預(yù)處理液B，渦旋lmin，于室溫在12000g下離心5min，棄上清；2)向步驟1)中的離心管中添加630μ 1溶液C和70 μ 1溶液D，10 μ 1 10mg/ml的蛋白酶K，渦旋5分鐘，得到沉積物懸浮物；3)將步驟幻的沉積物懸浮物在37°C下水浴lh，再加100μ 1 20%的十二烷基硫酸鈉， 于65°C水浴2h，期間每隔10-15min顛倒一次離心管；4)將步驟3)的離心管于IOOOOg下離心5min，取上清700μ1于一 1. 5ml離心管中，加入700 μ 1溶液Ε，充分混勻，于室溫IOOOOg下離心5min，取600 μ 1上清于另一 1. 5ml離心管中，再加入500 μ 1溶液Ε，充分混勻，室溫IOOOOg離心lOmin，得上清；5)取450μ 1步驟(4)的上清至1.5ml離心管中，加入45 μ 1溶液F和250 μ 1溶液G， 混勻，于室溫下放置lh，然后在IOOOOg下離心lOmin，棄上清，留沉淀物1 ；6)向步驟5)的沉淀物1中加入500μ1 80%的乙醇，于12000g下離心lOmin，棄上清， 重復(fù)該步驟，得沉淀物2;7)將步驟6)沉淀2在5000g離心ls，用微量移液器將離心管中殘留的液體除去，于室溫下干燥lOmin，得沉積物總DNA ；8)向步驟7)的沉積物總DNA中添加50μ 1超純水，使該沉積物總DNA溶解，在紫外分光光度計上檢測該沉積物DNA的濃度和純度；9)用步驟8)得到的 DNA,以 16S rDNA 的特異引物 341F :5，CCTACGGGAGGCAGCAG 3，和 534R 5' ATTACCGCGGCTGCTGGCA 3，為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到沉積物16S rDNA序列片段， 其中步驟1)中的溶液A為200mM的明礬溶液；沉積物預(yù)處理液B為20%濃度的NaOH溶液；步驟2)中的溶液C的配方為IOOmM Tris-Hcl ；IOOmM EDTA ； IOmM pH為8. O的磷酸鹽，1. 5M NaCl及CTAB溶液；溶液D為IOOmM的焦磷酸鈉溶液。步驟幻中的溶液E配方為飽和酚、三氯甲烷和異戊醇，其體積比為25 24 I0步驟6)中的溶液F為5M的NaCl溶液；溶液G為50%的聚乙二醇6000溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于淡水沉積物DNA樣品制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從淡水沉積物中提取DNA的方法。以淡水沉積物為材料，采用適當(dāng)濃度的明礬溶液來去除底泥中的腐殖質(zhì)，用焦磷酸鈉作為分散劑將微生物與沉積物分離開，用CTAB和SDS聯(lián)合裂解細(xì)胞，PEG沉淀，能將底泥中的絕大部分腐殖質(zhì)去除。用此法得到的DNA在260和280處的吸光值的比值在1.8左右，260和230處的吸光值的比值在2.0左右，接近理想值，不做稀釋，不用試劑盒純化，能直接用于PCR反應(yīng)。本發(fā)明得到的DNA純度高，得率穩(wěn)定，獲取的DNA量大，無明顯剪切現(xiàn)象，價格低廉，操作簡單，可用于商業(yè)試劑盒的組裝。
文檔編號C12N15/10GK102485891SQ20101057301
公開日2012年6月6日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者何緒剛, 廖明軍, 張敏, 謝從新, 陸詩敏 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)