專利名稱：一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18,19-脫氫喜樹堿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的誘導(dǎo)合成方法，具體涉及一種人 工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿(Camptothecin，CPT)是一種植物抗癌藥物，它是從中國(guó)特有的珙桐科植 物喜樹中分離得到的一種天然五環(huán)生物堿。喜樹堿是由Wall等于1966年首次從喜樹皮中 提取出來(lái)，隨后人們的研究又逐步分離出10-羥基喜樹堿、甲氧基喜樹堿、10-甲氧基喜樹 堿等喜樹堿衍生物。喜樹堿通過嵌合抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I (Topo I)攻擊腫瘤細(xì)胞，最終 導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，是理想的抗癌藥物。喜樹堿系列衍生物抗癌藥物是附加值極高的高技 術(shù)產(chǎn)品，對(duì)胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌和血液腫瘤等均 有效，加之可以口服，且對(duì)心、肺、肝、腎和神經(jīng)毒性較小，已成為世界抗腫瘤藥物市場(chǎng)上主 要品種。提取喜樹堿的原料主要有兩種，一是喜樹，二是臭馬比木。從目前的研究情況和國(guó) 內(nèi)外的研究趨勢(shì)來(lái)看，喜樹堿及其衍生物主要是靠從喜樹中分離獲得，至今已從喜樹中分 離出來(lái)的30余種成分中，喜樹堿及其衍生物已有10余種。喜樹堿及衍生物的提取與分離 主要是利用這些物質(zhì)不溶于水而溶于乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑等方面的特性，通過分離提取， 然后回收溶劑、結(jié)晶即可得到最終產(chǎn)品。但由于喜樹的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，通常要8-15年才能 結(jié)果，喜樹果中喜樹堿的最高含量也只萬(wàn)分之幾。此外，由于喜樹主要分布在人為活動(dòng)區(qū)， 面臨以毀林開田為目的的砍伐，優(yōu)良的野生喜樹資源較少，其相關(guān)的藥用研究和開發(fā)也受 到一定限制。臭馬比木為茶茱萸科植物海桐假柴龍樹(Nothapodytes Pittosporoides (Oliv.) sleum.)的根皮，其含有喜樹堿(camptothecine)及喜樹堿的甲氧基衍生物，臭馬比木全株 含有喜樹堿，是喜樹堿的另一個(gè)原料主要來(lái)源。臭馬比木，名稱青脆枝，學(xué)名Nothapodytes nimmoniana(Graham)Mablerley,原產(chǎn)地為蘭嶼，也屬于茶茱萸科，分布我國(guó)于甘肅、湖北、 湖南、廣東、海南、廣西、四川、貴州等地，臭馬比木全株含有喜樹堿。據(jù)植物提取產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng) 了解，臭馬比木來(lái)源的99%喜樹堿價(jià)格要比喜樹來(lái)源的低一萬(wàn)元左右，價(jià)格上的優(yōu)勢(shì)使臭 馬比木成為了喜樹堿提取的另一個(gè)關(guān)注熱點(diǎn)。但是采用植物資源提取喜樹堿及其衍生物， 其周期較長(zhǎng)，產(chǎn)量相對(duì)較低，所用的植物資源不能再生，嚴(yán)重的限制了喜樹堿及其衍生物的 生產(chǎn)，而全世界對(duì)喜樹堿及其衍生物的需求量又非常大，為了解決這一矛盾，國(guó)內(nèi)外學(xué)者都 在不斷的研究從其他的渠道來(lái)獲取喜樹堿及其衍生物，植物內(nèi)生菌的研究也逐漸進(jìn)入研究 者的視線中。植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種 組織和器官內(nèi)部的微生物，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出外在病癥，可通過組織學(xué)方法或從 嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物DNA的方法來(lái)證明其
3內(nèi)生。它不僅包括互惠共利的和中性的內(nèi)共生微生物，也包括那些潛伏在宿主體內(nèi)的病原 微生物，這些微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌等。自1898年Vogl從黑麥草種子內(nèi)分離出第一 株內(nèi)生真菌以來(lái)，植物內(nèi)生菌作為一種新的微生物資源受到了廣泛的關(guān)注，從內(nèi)生菌中尋 找和發(fā)現(xiàn)新的活性化合物已成為國(guó)內(nèi)外研究的又一熱點(diǎn)。近年來(lái)，該領(lǐng)域的研究已取得一 定進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些有醫(yī)用、農(nóng)用價(jià)值的菌株和化合物。內(nèi)生菌分為內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi) 生放線菌等。植物內(nèi)生菌是一類次生代謝產(chǎn)物豐富、應(yīng)用前景廣闊的資源微生物。近年來(lái)， 植物內(nèi)生菌由于能夠產(chǎn)生豐富多樣的具有活性的次生代謝產(chǎn)物，在自然界中具有重要的生 態(tài)學(xué)作用，引起了人們廣泛的關(guān)注并取得很大進(jìn)展。從微生物中尋找發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物， 是新藥研制的重要途徑。內(nèi)生菌作為微生物中的重要類群，其物種豐富，數(shù)量龐大，這為新 藥的研究和開發(fā)提供了巨大的資源庫(kù)。最近一個(gè)全面的研究顯示，51%的從植物內(nèi)生菌分離 的生物活性物質(zhì)是以前沒有發(fā)現(xiàn)的化合物，而從土壤微生物發(fā)現(xiàn)的新物質(zhì)僅為38%。由此 可見，研究植物內(nèi)生菌，尋找具有藥物活性的次生代謝產(chǎn)物，是研發(fā)新型藥物的重要途徑， 前景十分廣闊。從紫杉樹皮中分離出產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌，進(jìn)一步證實(shí)了“內(nèi)共生理論”， 即與宿主共同進(jìn)化的內(nèi)生真菌可能從宿主獲得相關(guān)基因的直接傳遞，具有與宿主相同的次 生代謝產(chǎn)物合成途徑。因此近年來(lái)內(nèi)生真菌已經(jīng)成為篩選與宿主相同或相似的有益代謝產(chǎn) 物的熱點(diǎn)。主要從其中篩選一些抗生素類、抗腫瘤活性類、抗病毒類、殺蟲活性類、植物生長(zhǎng) 調(diào)節(jié)劑類等等，甚至有抗氧化劑類、免疫抑制劑類、揮發(fā)性抗生素類、除草活性類等一些物 質(zhì)。微生物具有生長(zhǎng)繁殖快，易培養(yǎng)，易控制、產(chǎn)量高，不受季節(jié)、氣候、地域等自然條件的限 制，發(fā)酵成本低，易于通過現(xiàn)代生物技術(shù)等改造遺傳性狀等優(yōu)點(diǎn)，使得有望通過植物內(nèi)生菌 發(fā)酵為人類突破植物資源周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、不可再生等限制，為一些重要的藥物生產(chǎn)開辟了 新途徑，因此具有極大的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值。目前已研究過的內(nèi)生菌的藥用植物至少有 145種。喜樹堿及其衍生物具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制，是目前世界上最理想的抗癌藥物，主要用 于治療胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌和血液腫瘤等，然而 喜樹堿科植物資源生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低，臨床對(duì)喜樹堿的需求量又十分巨大，形成了藥源與 需求的尖銳矛盾，為了改變藥源緊缺的狀況，國(guó)內(nèi)外學(xué)者為從多渠道得到喜樹堿做了大量 的研究，包括化學(xué)合成、生物合成等，研究從喜樹堿植物上分離出生產(chǎn)喜樹堿的內(nèi)生菌，為 喜樹堿及其他藥物的內(nèi)生菌發(fā)酵開辟了新途徑。截止目前盡管已分離出多株產(chǎn)喜樹堿的內(nèi)生菌，但這些內(nèi)生菌培養(yǎng)液中的喜樹堿 含量很低，遠(yuǎn)不能達(dá)到商業(yè)化生產(chǎn)的毫克級(jí)水平，因此迫切需要通過一定的途徑提高內(nèi)生 菌喜樹堿的產(chǎn)量。研究發(fā)現(xiàn)，改變內(nèi)生菌的生長(zhǎng)條件能夠提高產(chǎn)量，如改變培養(yǎng)液的營(yíng)養(yǎng)成 分，特別是在發(fā)酵液中添加合成喜樹堿的前提物或加入喜樹堿提取物，尋找一些內(nèi)生菌代 謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑，也可以提高喜樹堿的產(chǎn)量，現(xiàn)代生物技術(shù)是提高內(nèi)生 菌產(chǎn)量更理想的途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對(duì)內(nèi)生菌進(jìn)行遺傳改造能大幅度提高喜樹堿 的含量，通過原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生菌喜樹堿 產(chǎn)量低的問題。我國(guó)藥用植物種類豐富，絕大多數(shù)為野生種類，由于其生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、不可 再生等限制，很難滿足人類的需要。植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物的多樣性以及其他優(yōu)點(diǎn)使 其有望解決部分藥物供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的抗癌活性超過喜樹堿，對(duì)肝癌和頭頸部癌也有明顯療效，而且副作用較少。可用于惡性腫瘤，銀屑病，治疣，急慢性白血病以及血吸蟲病引起 的肝脾腫大等。所以利用植物內(nèi)生菌的多樣性，研究合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的 方法有非常重要的意義和作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫 喜樹堿的方法，采用該種方法，可以克服采用喜樹或臭馬比木提取喜樹堿的原料來(lái)源周期 長(zhǎng)，產(chǎn)量低、原料不可再生的缺陷。為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的方法，包括如下步
驟
(1)菌懸液的制備
將臭馬比木內(nèi)生菌置于PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、天，用接種環(huán)刮取菌落周邊生長(zhǎng)旺 盛的菌絲體，接入裝有玻璃珠的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，25 3(TC搖床培養(yǎng)4(Γ50小時(shí)， 轉(zhuǎn)速為10(Tl50/min，用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基稀釋至菌體含量為10_4，得到菌懸液；
(2)人工誘變
在菌懸液中加入濃度為2 1500 M的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)Γ7天，再次加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的 用量為0. 2^1. 5克/L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3飛天，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，篩選出合成9-甲 氧基-18，19-脫氫喜樹堿量高的菌株。上述的誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑。本發(fā)明的有益效果是
本發(fā)明采用人工誘導(dǎo)臭馬比內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿，可以克服原料 來(lái)源周期長(zhǎng)，產(chǎn)量低、原料不可再生的缺陷，生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程中的環(huán)境污染程度低，對(duì) 生產(chǎn)人員的毒害小，產(chǎn)品收率高，純度高。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，這些實(shí)施例僅用來(lái)說明本發(fā)明，并 不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1
一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的方法，包括如下步
驟
(1)菌懸液的制備
將臭馬比木內(nèi)生菌置于PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，用接種環(huán)刮取菌落周邊生長(zhǎng)旺 盛的菌絲體，接入裝有玻璃珠的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，25°C搖床培養(yǎng)50小時(shí)，轉(zhuǎn)速為 lOOmin，用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基稀釋至菌體含量為10_4，得到菌懸液；
(2)人工誘變
在菌懸液中加入濃度為2 M的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)4天，再次加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的用 量為1. 5克/L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，篩選出合成9-甲氧 基-18，19-脫氫喜樹堿量高的菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵，提取獲得9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿。實(shí)施例2
一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的方法，包括如下步
驟
(1)菌懸液的制備
將臭馬比木內(nèi)生菌置于PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，用接種環(huán)刮取菌落周邊生長(zhǎng)旺 盛的菌絲體，接入裝有玻璃珠的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)40小時(shí)，轉(zhuǎn)速為 150min，用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基稀釋至菌體含量為10_4，得到菌懸液；
(2)人工誘變
在菌懸液中加入濃度為1500 M的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)7天，再次加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的 用量為0. 2克/L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5天，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，篩選出合成9-甲氧 基-18，19-脫氫喜樹堿量高的菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵，提取獲得9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹 堿。實(shí)施例3
一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的方法，包括如下步
驟
(1)菌懸液的制備
將臭馬比木內(nèi)生菌置于PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，用接種環(huán)刮取菌落周邊生長(zhǎng)旺 盛的菌絲體，接入裝有玻璃珠的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，觀搖床培養(yǎng)45小時(shí)，轉(zhuǎn)速為 130min，用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基稀釋至菌體含量為10_4，得到菌懸液；
(2)人工誘變
在菌懸液中加入濃度為1000 M的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)6天，再次加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的 用量為1. 0克/L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4天，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，篩選出合成9-甲氧 基-18，19-脫氫喜樹堿量高的菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，提取獲得9-甲氧基-18，19-脫氫 喜樹堿。
權(quán)利要求
1.一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫喜樹堿的方法，其特征在 于包括如下步驟(1)菌懸液的制備將臭馬比木內(nèi)生菌置于PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3、天，用接種環(huán)刮取菌落周邊生長(zhǎng)旺 盛的菌絲體，接入裝有玻璃珠的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，25 3(TC搖床培養(yǎng)4(Γ50小時(shí)， 轉(zhuǎn)速為10(Tl50/min，用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基稀釋至菌體含量為10_4，得到菌懸液；(2)人工誘變?cè)诰鷳乙褐屑尤霛舛葹? 1500 μ M的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)Γ7天，再次加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的 用量為0. 2^1. 5克/L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3飛天，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，篩選出合成9-甲 氧基-18，19-脫氫喜樹堿量高的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人工誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18，19-脫氫 喜樹堿的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)劑為非生物誘導(dǎo)劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)臭馬比木內(nèi)生菌合成9-甲氧基-18,19-脫氫喜樹堿的方法，該方法是將臭馬比木內(nèi)生菌置于PDA平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3~4天，用接種環(huán)刮取菌落周邊生長(zhǎng)旺盛的菌絲體，接入裝有玻璃珠的馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，用馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基稀釋至菌體含量為10-4，得到菌懸液，在菌懸液中加入濃度為2~1500μM的誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)4~7天，再次加入誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)劑的用量為0.2~1.5克/L液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3~5天，接種于PDA平板培養(yǎng)基中，篩選出合成9-甲氧基-18,19-脫氫喜樹堿量高的菌株，然后進(jìn)行發(fā)酵，用超聲波提取，該方法生產(chǎn)成本低，生產(chǎn)過程中的環(huán)境污染程度低，對(duì)生產(chǎn)人員的毒害小，產(chǎn)品收率高，純度高。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102071234SQ20101057487
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月6日
發(fā)明者張?jiān)方?申請(qǐng)人:張?jiān)方?br>