專利名稱：一種源于陰溝腸桿菌的泛醌輔酶q10合成酶基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種源于陰溝腸桿菌的泛醌輔酶QlO合成酶基因及其制備方法。
背景技術(shù)：
黑色素是一種廣泛存在于動植物和微生物中的非均質(zhì)的色素。黑色素的形成是通過酪氨酸酶催化L-酪氨酸成多巴，再經(jīng)過一系列聚合反應(yīng)合成的。目前黑色素可以分為三類1)真黑素(eumelanins)，含氮不含硫原子，主要是黑色和褐色的色素，是酪氨酸在酪氨酸酶的催化下被經(jīng)化，接著在一系列的氧化和聚合反應(yīng)中形成；幻棕黑素 (phaeomelanins)，含氮和硫原子，常呈棕色、紅色甚至黃色，和真黑素的合成途徑類似，但有谷胱甘肽或半胱氨酸等的參與；3)異黑素(allomelanins)，不含氮，常呈棕色或黑色，主要存在于植物體內(nèi)，通過多酚氧化酶將多酚氧化聚合而成。在工農(nóng)業(yè)上，黑色素可以作為吸收紫外線的化妝品成分、天然染發(fā)劑的成分、陽離子贅和劑、作為無定形的半導(dǎo)體以及生物殺蟲劑的光保護(hù)劑；此外黑色素在醫(yī)學(xué)上也具有很廣的應(yīng)用范圍，具有清除自由基、阻止心磷脂脂質(zhì)體的氧化、抗輻射及抗氧化、對病理學(xué)和分類學(xué)的研究具有重要意義、作為新型的天然藥物載體、用來治療某些與黑色素缺乏相關(guān)的神經(jīng)性疾病、一些可溶性的黑色素在體外具有抑制愛滋病病毒感染宿主細(xì)胞的作用， 因此有能成為一種有效的藥物。目前，黑色素的生產(chǎn)多是通過化學(xué)合成或從動、植物體進(jìn)行提取，但是化學(xué)合成黑色素的反應(yīng)過程多、程序復(fù)雜，且具有一定的毒害性；從動、植物體提取黑色素則存在樣品來源難的問題。利用微生物生產(chǎn)黑色素具有反應(yīng)條件溫和、成本低、操作簡單、無需大量的樣品等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了一種來源于陰溝腸桿菌的泛醌輔酶QlO合成酶基因及其制備方法， 具體是從被污染的土壤中提取能產(chǎn)黑色素的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)，并采用基因合成法克隆此細(xì)菌中的泛醌輔酶QlO合成酶基因，為培育出能產(chǎn)黑色素的轉(zhuǎn)基因植物提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—種源于陰溝腸桿菌的泛醌輔酶QlO合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1 所示，其編碼的氨基酸序列序列如SEQ ID NO 2所示。所述的泛醌輔酶QlO合成酶基因的提取方法為利用酪素培養(yǎng)基，從化工廠附近被污染的土壤中選擇生長良好的陰溝腸桿菌菌株；再將選擇出來的菌落置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時以上；之后提取總DNA，用0. 02-0. 5u/ μ L濃度限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A酶切提取所得的總DNA，時間20-60分鐘。
所述的泛醌輔酶QlO合成酶基因的具體獲取方法如下1)菌種分離稱取化工廠附近被污染的土壤樣品lg，加入0. 9% (wt/vol)氯化鈉溶液lml，5000 轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0.9% (wt/vol)氯化鈉溶液lml， 5000轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布于酪素固體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 24h。2)總DNA提取及菌種鑒定將分離獲得的細(xì)菌單株在液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl, IOg/ L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)中培養(yǎng)過夜(16小時)，菌體培養(yǎng)液以6，OOOg重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。先將這些沉淀在_20°C下冷凍lhr，之后使用TE緩沖液 (IOmMTris-HCiamM EDTA，pH 8.0)清洗一次，然后懸浮于濃度為10mg/mL溶菌酶的無菌水中，37°C搖床培養(yǎng)lhr。接著向培養(yǎng)液中加入0. 5M EDTA, 10% (w/v) SDS和濃度為5M的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入濃度為20mg/mL蛋白激酶K，37°C培養(yǎng)lhr。用與培養(yǎng)菌液液體體積相當(dāng)(1 倍體積)的苯酚氯仿異戊醇05 24 1，體積比)提取DNA ；水相用與相當(dāng)水相體積 1/2(0. 5倍體積)的氯仿異戊醇04 1，體積比)萃取，振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(dāng)(1倍體積)的異戊醇，振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν) 酒精沖洗DNA，干燥，之后在TE緩沖液中重懸浮。所得總DNA于4°C保存。以 P16SR (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，)和 P16SF (5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT C-3’)為擴(kuò)增引物，以菌株的DNA為模板進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增。隨后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收，克隆和測序。3)泛醌輔酶QlO合成酶基因獲取和序列分析提取所得的菌株總DNA用限制性核酸內(nèi)切酶Sau34 I酶切，時間20_60分鐘，然后 0.7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳，切下長度為2-41Λ的DNA片段，用膠試劑盒回收備用。選擇 pACYC184(NEB公司)作為表達(dá)載體，用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI酶切并進(jìn)行膠回收。先對酶切的載體質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化操作，以降低質(zhì)粒自連，并對堿性磷酸酶進(jìn)行失活操作后(Sambrook，分子克隆手冊，1989)，再與外源的DNA片段(即長度為2-41Λ的陰溝腸肝菌DNA片段)連接。反應(yīng)溫度16°C，連接時間為10-1池。連接產(chǎn)物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10 μ 1的超純水溶解，將連接物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為電脈沖2. 5 μ F， 電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5S。復(fù)蘇后，將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有 50yg/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養(yǎng)12_1他，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega 公司)進(jìn)行質(zhì)粒提取。這樣就構(gòu)建成了包含有目的基因的基因組文庫。以 p93z :5，-GGATCCATGACAACAACACGCTCCCATCA-3，和 p93f 5，-GAGCTCTTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAG-3’為引物，上文制備好的含有目的基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行泛醌輔酶QlO合成酶基因的PCR擴(kuò)增。將回收片段用BamHI和McI雙酶解，與PG251表達(dá)載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌ER2799 (NEB公司)中，涂布酪素培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h，確定閱讀框表達(dá)質(zhì)粒的正確性。4)泛醌輔酶QlO合成酶基因的合成和篩選
采用基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)將上述陰溝腸桿菌泛醌輔酶QlO合成酶基因克隆。具體是利用PCR進(jìn)行泛醌輔酶QlO合成酶基因擴(kuò)增，在Taq DNA聚合酶存在的反應(yīng)體系中，使用17個擴(kuò)增引物和2個外側(cè)引物完成。擴(kuò)增條件為94°C 預(yù)熱 Imin ；940C 30 秒，50°C 30 秒，72°C延長 IOmin，共 25 個循環(huán)。PCR 結(jié)束后，0. 8% (w/v) 瓊脂糖膠回收。本發(fā)明技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的有益效果本發(fā)明從化工廠附近被污染的土壤中分離并提取陰溝腸肝菌總DNA，經(jīng)檢測得到的菌株與陰溝腸桿菌中的16s rRNA有99%的同源性，并經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的本發(fā)明的泛醌輔酶QlO合成酶基因及其表達(dá)載體可應(yīng)用于培育產(chǎn)黑色素轉(zhuǎn)基因植物中。本發(fā)明所述的術(shù)語與其一般概念相同。所述的“核苷酸”和“引物”序列均為5’端至3’端。所述的“生物細(xì)胞”指微生物、植物細(xì)胞或組織。所述的“微生物”指原核微生物或真核微生物，原核微生物主要為細(xì)菌；真核微生物為真菌或藻類，真菌主要指酵母菌。


圖1為黑色素產(chǎn)生菌陰溝腸桿菌在酪素培養(yǎng)基上的篩選培養(yǎng)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。rtaq酶、Τ/Α載體、限制性核酸內(nèi)切酶Sau3A和BamHI購于寶生物工程(大連)有限公司，KOD taq酶購于日本Toyobo公司。本發(fā)明所用的試劑和材料若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇 (Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書(J.薩姆布魯克、E. F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科學(xué)出版社，1994)。該書及其后續(xù)出版版本是本領(lǐng)域技術(shù)人員在進(jìn)行與分子生物學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作時最常用的具有指導(dǎo)性的參考書籍。實(shí)施例1菌種分離稱取化工廠附近被污染的土壤樣品lg，加入0. 9% (wt/vol)氯化鈉溶液1ml，5000 轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，3000轉(zhuǎn)/分輕離心，倒掉上清，再加入0.9% (wt/vol)氯化鈉溶液lml， 5000轉(zhuǎn)/分震蕩混勻，冰上IOmin靜置，吸取150 μ 1溶液涂布于酪素固體培養(yǎng)基(葡萄糖 lg，蛋白陳10g，NaCl 5g, CaCl2 0. lg，L-酪氨酸lg，瓊脂粉40g，定容至1L，pH7. 0)中培養(yǎng) 24h0將長出來的單菌落接種于加入1.6ml LB液體培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/LNaCl， 10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH7. 5)的試管中，28°C培養(yǎng)48h，然后吸取150μ 1的培養(yǎng)液再次涂布酪素固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)Mh，黑色素產(chǎn)生菌陰溝腸桿菌在酪素培養(yǎng)基上的篩選培養(yǎng)參見圖1，最后將生長良好的菌落選出來進(jìn)行進(jìn)一步研究。實(shí)施例2總DNA的提取及菌種鑒定將實(shí)施例1中分離獲得的細(xì)菌單株在IOml液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/ LNaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液ρΗ7· 5)中培養(yǎng)16小時，菌體培養(yǎng)液以6，OOOg重力加速度離心5min，得到菌體沉淀。首先將菌體沉淀在-20°C下冷凍lhr，然后使用TE緩沖液 (IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，pH8. 0)清洗一次，再加入 20μ 1 溶菌酶(Sigma-Aldrich)濃度為lOmg/mL的無菌水懸浮，在37°C下?lián)u床培養(yǎng)lhr。接著加入50 μ 1濃度為0. 5Μ EDTA, 50 μ 1濃度為10% (w/v) SDS和50 μ 1濃度為 5Μ的NaCl并輕輕振蕩混勻后，再加入10 μ 1濃度為20mg/mL蛋白激酶K(Takara日本)，反應(yīng)物在37°C下培養(yǎng)lhr。用與培養(yǎng)菌液液體體積相當(dāng)(1倍體積)的苯酚氯仿異戊醇 (25 24 1，體積比)提取DNA。水相用與相當(dāng)水相體積1/2 (0. 5倍體積)的氯仿異戊醇04 1，體積比)萃取。振蕩混勻后離心5min。水相中加入與水相體積相當(dāng)(1倍體積)的異戊醇。振蕩混勻后離心15min。取沉淀，用70% (ν/ν)酒精沖洗DNA，干燥，之后在 TE緩沖液中重懸浮，所得總DNA于4°C保存。以抽提的總DNA為模板，利用陰溝腸桿菌的16s rRNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 擴(kuò)增的引物如下P16SR 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，P16SF 5' -ACGGCTACCTTGTTACGACTTC-3，以KOD Plus (Toyobo日本)為Taq DNA聚合酶，其中，擴(kuò)增體系為 5. O μ LlOPCRbuffer, 4 μ L dNTPS (2. 5mmol/L)，1 μ L模板(20ng-50ng)，引物各 1 μ L，0. 2 μ L Taq酶，加無菌水定容至50 μ L。擴(kuò)增條件依次為94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 120秒，擴(kuò)增30個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，加入2個單位的rtaq酶，72°C延伸300秒，擴(kuò)增片段長1500bp。 PCR結(jié)束后，利用(w/v)瓊脂糖凝膠回收，取IOyL回收產(chǎn)物直接與Τ/Α載體相連，4°C 連接過夜，得到DNA連接產(chǎn)物。先將DNA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞(購自Takara公司)中，再用ABI Prism Big Dye的ΑΒΙ3700毛細(xì)管自動化測序儀測序，測得的序列通過Blast程序與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，得到菌株與陰溝腸桿菌中的16s rRNA有99%的同源性，從而證實(shí)分離菌株為陰溝腸桿菌。實(shí)施例3陰溝腸肝菌泛醌輔酶QlO合成酶基因片斷分離和序列分析陰溝腸桿菌DNA用Sau3A I酶切，時間20-60分鐘。然后經(jīng)0. 7% (w/v)瓊脂糖凝膠電泳后，切下長度為2-41Λ的DNA片段，用凝膠試劑盒(上海生物工程公司)回收。質(zhì)粒載體pACYC184 (NEB公司)用BamH I完全酶切后SAP堿性磷酸酯酶進(jìn)行末端去磷酸化，以減少載體自連。上述回收后的菌株DNAQOOng)和末端去磷酸化的質(zhì)粒載體pACYC184(150ng) 用2U的T41igase在4°C下連接16h。將得到的連接產(chǎn)物用正丁醇沉淀后，用70% (ν/ν)的乙醇離心洗滌，最后用10μ L 的超純水溶解，將連接物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為電脈沖 2. 5 μ F,電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5S。復(fù)蘇后，將菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基 (含有50yg/mL氨芐青霉素)平板上，37°C培養(yǎng)12_1他，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega公司)進(jìn)行質(zhì)粒提取。將大量提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，電擊參數(shù)為電脈沖為 2. 5 μ F,電壓2. 5kV，電阻200 Ω，電擊時間為4. 5. S。復(fù)蘇后，將菌液涂布酪素培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48h，而后用質(zhì)粒大量提取試劑盒(美國Omega公司)進(jìn)行質(zhì)粒提取。這樣就構(gòu)建成了包含有目的基因的基因組文庫。
以 p93z :5，-GGATCCATGACAACAACACGCTCCCATCA-3，和 p93f 5，-GAGCTCTTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAG-3’為擴(kuò)增引物，以上文制備好的含有目的基因的質(zhì)粒DNA為模板，對泛醌輔酶QlO合成酶基因的閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為 5. OyL 10PCRbuffer,4y L dNTPS (2. 5mmol/L)，1 μ L模板，引物各 1 μ L，0. 2 μ L KODFX taq 酶，加無菌水定容至50 μ L0擴(kuò)增條件依次為94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 2分鐘，30個循環(huán)。然后加入2單位rtaq酶，在72°C延伸30分鐘。PCR結(jié)束后，(w/v)瓊脂糖凝膠回收，獲得長度為774bp的片段，即本發(fā)明的泛醌輔酶QlO合成酶基因，其序列如SEQ ID No 1 所示，其編碼的氨基酸258個，其氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。選擇pG251(CN1338515NCBI)作為表達(dá)載體，用限制性核酸內(nèi)切酶BamH I (大連寶生物工程公司)酶切并進(jìn)行膠回收。對酶切的載體質(zhì)粒進(jìn)行去磷酸化操作，以降低質(zhì)粒自連，并對堿性磷酸酶進(jìn)行失活操作后Sambrook分子克隆手冊1989，再與外源的DNA片段 (即長度為774bp的泛醌輔酶QlO合成酶基因)連接。連接前用瓊脂糖凝膠電泳的方法估計濃度，確保連接反應(yīng)中外源DNA的濃度至少是載體濃度3-5倍。反應(yīng)溫度16°C，連接時間為10-1 1。再將該載體轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。利用ABI PrismBig Dye的ΑΒΙ3700 毛細(xì)管自動化測序儀測序，確定774bp閱讀框(泛醌輔酶QlO合成酶基因)表達(dá)質(zhì)粒的正確性。實(shí)施例4陰溝腸桿菌泛醌輔酶QlO合成酶基因的合成通過基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆得到本發(fā)明的陰溝腸桿菌泛醌輔酶QlO合成酶基因，所用的引物如下1. AraII-I ATGACAACAACACGCTCCCATCATGACAACGTAGAAAAACAGTTTGGTTCTCAGGCAAGT2. Aral 1-2 GATCGCGGCCAGAAGCATGCACGGCACTGCTCAGATAGGCACTTGCCTGAGAACCAAACT3. Aral 1-3 GCATGCTTCTGGCCGCGATCTGGTGCGTCTCGGTGAACGTCTGGCGGCGTTCCCGCAGGC4. Aral 1-4 GCTGGCATGCCCTGCCCCGCAGCCTAAATCCAGCACGTGCGCCTGCGGGAACGCCGCCAG5. Aral 1-5 GCGGGGCAGGGCATGCCAGCTTTACGGCTGCGCAGCGGGTCGCGCACGTTACCGCGTATG6. Aral 1-6 GCCGCCCCAGCAACGACGTCCAGCATCTGGCTGGATAAGTCATACGCGGTAACGTGCGCG7. Aral 1-7 GACGTCGTTGCTGGGGCGGCAAAAGCGAAAGGGCTGAACAACATCGATACGCGCCAGGGC8. Aral 1-8 CCTCAAACGATGCATCATCGAACGGTAAGGATTCGGCATAGCCCTGGCGCGTATCGATGT9. Aral 1-9 CGATGATGCATCGTTTGAGGTGGTGATCAGCCGTTATTCCGCGCACCACTGGCACGATGT10. AraII-IO CGGCTTCAGAACACGTTTGACCTCGCGCAATGCCTGGCCGACATCGTGCCAGTGGTGCGC
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11. AraII-Il TCAAACGTGTTCTGAAGCCGGGCGGCACCTTCATCATTATGGATGTGATGTCTCCCGGAC12. AraII-12 AGCGCTTCTACCGTCTGCAGCCAGATATTGCGCACCGGGTGTCCGGGAGACATCACATCC13. AraII-13 CTGCAGACGGTAGAAGCGCTGCGCGATACCTCGCACGTGCAAAATTACGCCAGCGGAGAG14. AraII-14 CGCGCGCGATCAGCCCCGCTTCAGTGATAAGCGACAACCACTCTCCGCTGGCGTAATTTT15. AraII-15 AGCGGGGCTGATCGCGCGCGCGTTGATTACCGATCGTTTACCGCTGGAGTTCAGCTCCTG16. AraII-16 CGCCTGGCTCAATGCTTCCGGGGTGCGCATACGCGCGATCCAGGAGCTGAACTCCAGCGG17. AraII-17 CGGAAGCATTGAGCCAGGCGATCAGACTGTATCAGGAGAGTGCGTCCGCGGAGGTAAAGG18. AraII-18 TCGCTGGTAAACGAGCCATCGTCCTGCAGTTCAAAGTACGCCTTTACCTCCGCGGACGCA19. AraII-19 TTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAGCCATGATGGTATCGCTGGTAAACGAGCCATC利用PCR進(jìn)行泛醌輔酶QlO合成酶基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系為Probest buffer 10 μ L, dNTPs 8 μ L，AralI-2-AraI 1-18 共 17 個內(nèi)側(cè)引物各 2 μ L，AraII-I 和 AraII-19 外側(cè)引物各2yL，Probest酶0. 4yL，加無菌水定容至lOOyL，以KOD FX taq酶(Toyobo 公司，日本)為Taq DNA聚合酶。擴(kuò)增條件依次為94°C預(yù)熱Imin ；94°C 30s ；50°C 30s ； 72°C lOmin，共 25 個循環(huán)。PCR結(jié)束后，(w/v)瓊脂糖膠回收，取10 μ 1回收產(chǎn)物直接與Τ/Α克隆載體相連，4°C連接過夜。高效轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中，獲得陽性克隆，其序列如SEQ IDNo 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，該陽性克隆即為本發(fā)明的陰溝腸桿菌泛醌輔酶QlO合成酶基因。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。
權(quán)利要求
1.一種源于陰溝腸桿菌的泛醌輔酶QlO合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的泛醌輔酶QlO合成酶基因，其特征在于，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.權(quán)利要求1或2所述的泛醌輔酶QlO合成酶基因的制備方法，包括如下步驟1)菌種分離利用酪素培養(yǎng)基，從被污染的土壤中選擇生長良好的陰溝腸桿菌菌株， 再將選擇出來的菌落置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時以上；2)總DNA提取和菌種鑒定；3)泛醌輔酶QlO合成酶基因獲取和序列分析；4)采用基因合成方法克隆泛醌輔酶QlO合成酶基因在TaqDNA聚合酶存在的反應(yīng)體系中，利用19個引物完成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述引物具體如下 AraII-I ATGACAACAACACGCTCCCATCATGACAACGTAGAAAAACAGTTTGGTTCTCAGGCAAGT Aral1-2 GATCGCGGCCAGAAGCATGCACGGCACTGCTCAGATAGGCACTTGCCTGAGAACCAAACT Aral1-3 GCATGCTTCTGGCCGCGATCTGGTGCGTCTCGGTGAACGTCTGGCGGCGTTCCCGCAGGC Aral1-4 GCTGGCATGCCCTGCCCCGCAGCCTAAATCCAGCACGTGCGCCTGCGGGAACGCCGCCAG Aral1-5 GCGGGGCAGGGCATGCCAGCTTTACGGCTGCGCAGCGGGTCGCGCACGTTACCGCGTATG Aral1-6 GCCGCCCCAGCAACGACGTCCAGCATCTGGCTGGATAAGTCATACGCGGTAACGTGCGCG Aral1-7 GACGTCGTTGCTGGGGCGGCAAAAGCGAAAGGGCTGAACAACATCGATACGCGCCAGGGC Aral1-8 CCTCAAACGATGCATCATCGAACGGTAAGGATTCGGCATAGCCCTGGCGCGTATCGATGT Aral1-9 CGATGATGCATCGTTTGAGGTGGTGATCAGCCGTTATTCCGCGCACCACTGGCACGATGT AraII-IO CGGCTTCAGAACACGTTTGACCTCGCGCAATGCCTGGCCGACATCGTGCCAGTGGTGCGC AraII-Il TCAAACGTGTTCTGAAGCCGGGCGGCACCTTCATCATTATGGATGTGATGTCTCCCGGAC AraII-12 AGCGCTTCTACCGTCTGCAGCCAGATATTGCGCACCGGGTGTCCGGGAGACATCACATCC AraII-13 CTGCAGACGGTAGAAGCGCTGCGCGATACCTCGCACGTGCAAAATTACGCCAGCGGAGAG AraII-14 CGCGCGCGATCAGCCCCGCTTCAGTGATAAGCGACAACCACTCTCCGCTGGCGTAATTTT AraII-15 AGCGGGGCTGATCGCGCGCGCGTTGATTACCGATCGTTTACCGCTGGAGTTCAGCTCCTG AraII-16 CGCCTGGCTCAATGCTTCCGGGGTGCGCATACGCGCGATCCAGGAGCTGAACTCCAGCGG AraII-17 CGGAAGCATTGAGCCAGGCGATCAGACTGTATCAGGAGAGTGCGTCCGCGGAGGTAAAGG AraII-18 TCGCTGGTAAACGAGCCATCGTCCTGCAGTTCAAAGTACGCCTTTACCTCCGCGGACGCA AraII-19 TTATTCCGCTTTTTGCGCTTCAGCCATGATGGTATCGCTGGTAAACGAGCCATC。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶為KOD FX taq
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于陰溝腸桿菌的泛醌輔酶Q10合成酶基因及其制備方法，其中所述泛醌輔酶Q10合成酶基因其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明從化工廠附件被污染的土壤中分離并提取陰溝腸肝菌總DNA，經(jīng)檢測得到的菌株與陰溝腸桿菌中的16s rRNA有99％的同源性，并經(jīng)PCR擴(kuò)增后得到的本發(fā)明的泛醌輔酶Q10合成酶基因及其表達(dá)載體可應(yīng)用于培育產(chǎn)黑色素轉(zhuǎn)基因植物中，本發(fā)明為培育出能產(chǎn)黑色素的轉(zhuǎn)基因植物提供了重要的試驗(yàn)依據(jù)。
文檔編號C12N15/10GK102533799SQ20101060455
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月24日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 熊愛生, 田永生, 趙偉, 金曉芬, 陳晨, 韓紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院